高原鼠兔ISSR引物反应体系的优化与筛选

[目的]筛选和优化高原鼠兔(Ochotona curzoniae)适宜的ISSR反应体系,以在对高原鼠兔进行ISSR分析时获得清晰和多态性好的扩增结果。[方法]以高原鼠兔基因组DNA为模板,通过单因素试验,对体系中的模板浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq酶用量、引物用量、退火温度进行探讨。[结果]结果表明,高原鼠兔ISSR-PCR扩增的最佳条件为:25μl PCR反应体系,其中4lμDNA模板,1.5 mmol/LMgCl2,0.2 mmol/L dNTPs,1.25 UTaq聚合酶,1.5μmol/L引物,复性温度4560℃(退火温度随引物不同而确定)。用11条引物进行了PCR扩增,筛选出效果较好的6条引物。[结论]该反应体系的建立为鼠兔遗传多样性和分子系统学研究提供技术支持。     

油茶SSR-PCR反应体系的优化研究

[目的]优化油茶（Camellia oleifera）SSR-PCR反应体系。[方法]应用改良CTAB法提取油茶基因组DNA,采用L16（45）正交设计试验,对影响油茶SSR-PCR反应体系的5个因素（Taq聚合酶浓度、模板浓度、dNTPs浓度、引物浓度和Mg2＋浓度）在4水平上进行筛选。PCR结果经统计分析软件DPS分析,并对退火温度进行了摸索,确立了油茶SSR-PCR的优化体系。[结果]油茶SSR-PCR的优化体系总体积为20μl,包括Taq聚合酶量为1.0 U/20μl,模板浓度75 ng/20μl,dNTPs浓度为0.15 mmol/L,引物浓度为0.40μmol/L,Mg2＋浓度为1.50 mmol/L,退火温度为50℃。[结论]该研究确定的优化体系可以为油茶资源遗传多样性分析奠定技术基础。     

黑麦特异性PCR反应体系的建立

[目的]建立黑麦特异性PCR反应优化体系。[方法]以普通小麦＂中国春＂、S165、黑麦、八倍体小黑麦、六倍体小黑麦为试验材料,研究了模板DNA、引物、dNTPs、Mg2＋浓度、TaqDNA聚合酶用量及退火温度对黑麦特异性PCR反应体系的影响。[结果]采用改良的CTAB DNA微量提取法可以得到高质量的基因组DNA,满足PCR反应模板的要求,黑麦特异PCR扩增反应体系为：在25μl反应体系中,10×缓冲液,1.5 mmol/LMgCl2,200μmol/LdNTP,40 ng引物,40~60 ng模板DNA,1 UTaq酶。[结论]建立了适宜的黑麦特异PCR扩增反应体系,为小麦背景下黑麦外源种质的检测奠定了基础。     

黑麦特异性PCR反应体系的建立（摘要）

[目的]建立黑麦特异性PCR反应优化体系。[方法]以普通小麦＂中国春＂、S165、黑麦、八倍体小黑麦、六倍体小黑麦为试验材料,研究了模板DNA、引物、dNTPs、Mg2＋浓度、TaqDNA聚合酶用量及退火温度对黑麦特异性PCR反应体系的影响。[结果]采用改良的CTABDNA微量提取法可以得到高质量的基因组DNA,满足PCR反应模板的要求,黑麦特异PCR扩增反应体系为：在25μl反应体系中,10×缓冲液,1.5mmol/LMgCl2,200μmol/LdNTP,40ng引物,40～60ng模板DNA,1UTaq酶。[结论]建立了适宜的黑麦特异PCR扩增反应体系,可为小麦背景下黑麦外源种质的检测奠定基础。     

建兰ISSR-PCR反应体系的建立和优化（摘要）（英文）

[目的]研究建兰[Cymbidium ensifolium（Linn.） Sw]总基因组DNA的提取方法,并对建兰ISSR-PCR反应体系进行优化,建立更为完善的反应体系。[方法]用改良的CTAB法提取叶片的基因组DNA,用1.0%琼脂糖电泳检测DNA质量;用分光光度计测定其纯度和浓度,DNA纯度以OD260/OD280的比值来估算,浓度估算法为：DNA浓度（ng/μl） =OD260×50×稀释倍数。计算DNA获得率（DNA量/所用叶片量×100%）。对建兰ISSR-PCR反应的4项影响因素（DNA模板、TaqDNA聚合酶、Mg2 ＋和dNTPs）逐个作5水平进行研究,以筛选最优的建兰ISSR-PCR反应体系。[结果]获得高质量的建兰基因组DNA,以及优化了的建兰ISSR-PCR反应体系,即25μl PCR反应体积中,2.5μl 10×PCR buffer,2.5 mmol/LMgCl2,240 ng模板DNA,160μmol/LdNTPs,1.25 UTaqDNA聚合酶,0.4μmol/L引物,双蒸水15.78μl。最佳扩增程序为：94℃预变性5min,然后进行40个循环：94℃变性30 s,50 ～60℃退火（退火温度随引物不同而定） 30 s,72℃延伸50 s,72℃延伸7 min。[结论]建立了建兰ISSR-PCR反应体系最适合的条件,为进一步利用ISSR分子标记技术进行建兰遗传多样性研究提供了基础。     

荷包猪RAPD-PCR反应条件研究

[目的]建立适合荷包猪RAPD-PCR反应的最佳反应体系。[方法]以荷包猪为试验材料,以MgCl2浓度、引物浓度、dNTP浓度、模板DNA用量、TaqDNA聚合酶用量及退火温度为影响因子,在保持其他影响因子一致的条件下,变化单一因子,筛选最优参数,研究各影响因子对RAPD-PCR反应的影响。[结果]最佳反应体系的总体积为20.0μl,MgCl2浓度为2.5μmol/L、引物浓度2.0μmol/L、dNTP浓度400.0μmol/L、模板DNA为100 ng/μl、TaqDNA聚合酶为1.0 U。PCR反应程序:94℃预变性2 min(94℃变性1 min,36℃退火1 min,72℃延伸1 min,循环40次),72℃延伸5 min。此反应体系所扩增出来的结果比较稳定,带型清晰且亮度适中。[结论]该研究为应用RAPD技术对荷包猪作进一步的遗传分析奠定了基础。     

温郁金ISSR-PCR反应体系的建立及条件优化

[目的]寻找一个可用于温郁金ISSR-PCR的最适宜反应体系。[方法]利用CTAB法提取基因组DNA,同时利用PCR扩增技术和方法,对引物、模板DNA、Mg2+d、NTP、Taq聚合酶等反应条件进行优化。[结果]反应体系的最佳条件是总体积为25μl,其中Mg2+浓度(25mmol/L)2.2μl,Taq聚合酶(5 U/μl)0.4μl,引物浓度(20μmol/L)1.5μl,模板DNA(5 ng/μl)1.5μl,dNTP(2.5 mmol/L)2.2μl,10×PCRbuffer2.5μl;PCR扩增程序为:1个循环的94℃预变性5 min;94℃变性35 s,相对应的引物退火温度退火1 min,72℃复性1.5 min,共36个循环;最后72℃延伸10 min。[结论]该体系是适合温郁金ISSR-PCR反应的最适宜体系,具有省时、经济、简便以及扩增条带清晰而稳定等特点,为今后温郁金遗传多样性的研究奠定了基础。     

柽柳cpSSR-PCR反应体系的建立和优化

[目的]建立并优化柽柳cpSSR-PCR反应体系和反应条件。[方法]对影响PCR反应的5个变量(Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度、模板DNA浓度)进行L_(16)(4~5)正交试验设计,并对引物退火温度进行梯度筛选。[结果]最优反应体系:Mg~(2+) 2.0 mmol/L、dNTPs 0.125 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.25 U、引物0.25μmol/L、模板DNA 20 ng,共10μL。反应程序:94℃预变性4 min;94℃30 s,引物退火温度30 s,72℃30 s,30个循环;72℃延伸10 min。[结论]该反应体系成功扩增1个柽柳天然群体的23个个体,为柽柳群体扩散路线的确定奠定基础。     

适合西兰花的ISSR反应体系的建立

以西兰花基因组DNA为材料,对ISSR-PCR反应体系中各种影响因子如镁离子浓度、dNTP浓度、模板DNA含量、Taq DNA聚合酶量BSA浓度、引物用量、甘油浓度以及最适退火温度等进行了优化和筛选,建立了适合西兰花的ISSR反应体系:10μl PCR反应体积,1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol/L Tris.HC l,pH值9.0,50mmol/L KC l,0.1%Triton X-100),2.0 mmol/L MgC l2,0.75 U Taq酶,5 ng模板DNA,12 pmol引物,dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.2 mmol/L,4 mg/m l BSA,西兰花的最适退火温度为48.5℃。     

东北红豆杉RAPD反应体系的优化

[目的]研究东北红豆杉RAPD反应体系的优化条件。[方法]以东北红豆杉叶片为材料,用改进CTAB法提取DNA,分别从模板DNA浓度、引物浓度、dNTP浓度,Taq DNA聚合酶量及镁离子浓度5个方面对东北红豆杉RAPD扩增效果的影响进行分析。[结果]通过各因子的比较分析,建立了东北红豆杉RAPD优化体系：20μl PCR反应总体积中含模板DNA 10 ng,Mg^2＋2.0 mmol/L,引物15pmolμ/l,dNTPs 0.2 mmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U,10×buffer缓冲液2μl,以双蒸水补充至20μl。[结论]为进一步探索与东北红豆杉性别鉴定相关的研究提供技术支持。     

甘草RAPD-PCR反应体系正交优化研究

[目的]建立一套适合甘草分子学研究的RAPD-PCR反应体系。[方法]以甘草种质为试材,采用正交试验法设计,对影响RAPD-PCR扩增的主要因素dNTPs、引物、Taq酶和DNA模板进行优化筛选。[结果]总体积25μl的甘草RAPD-PCR最佳反应体系为：10×PCR缓冲液（含MgCl2）2.5μl,10 mmol/L dNTPs 2.5μl,50 ng DNA 2.0μl,10μmol/L引物2.0μl,5 U/μl Taq酶0.4μl。对引物的退火温度进行了梯度筛选,34℃时扩增效果较好。[结论]进行甘草RAPD-PCR反应体系的正交优化非常有效。     

油茶SRAP-PCR反应体系的建立与引物筛选

[目的]建立油茶SRAP-PCR的反应体系,并筛选合适的引物。[方法]采用CTAB法提取油茶基因组DNA,DNA扩增时采用PCR技术,扩增结果采用电泳法和成像系统进行分离和记录。[结果]在30μl反应体系中,适宜浓度分别是Mg2＋1.5 mmol/L、模板DNA90ng、引物0.21μmol/L、dNTPs 110μmol/L、TaqDNA聚合酶1.5 U;反应程序中第2次最适退火温度为49℃。随后,在36对引物组合中筛选出11对重复性好、多态性高的引物。[结论]优化的SRAP-PCR反应体系及筛选的引物为SRAP分子标记在油茶遗传育种中的应用奠定了基础。     

甘草RAPD-PCR反应体系正交优化研究(英文)

[目的]建立一套适合甘草分子学研究的RAPD-PCR反应体系。[方法]以甘草种质为试材,采用正交试验法设计,对影响RAPD-PCR扩增的主要因素dNTPs、引物、Taq酶和DNA模板进行优化筛选。[结果]总体积25μl的甘草RAPD-PCR最佳反应体系为:10×PCR缓冲液(含MgCl2)2.5μl,10mmol/LdNTPs2.5μl,50ng DNA2μl,10μmol/L引物2μl,5UTaq酶0.4μl。对引物的退火温度进行了梯度筛选,34℃时扩增效果较好。[结论]进行甘草RAPD-PCR反应体系的正交优化非常有效。     

老芒麦ISSR-PCR反应体系的建立与优化

[目的]建立并优化老芒麦ISSR-PCR反应体系和扩增程序,以期为探讨老芒麦种质资源的遗传多样性提供科学依据。[方法]采用正交设计试验和单因素试验相结合的方法对老芒麦的ISSR-PCR的反应体系进行构建和优化,对影响ISSR-PCR扩增效果的Taq酶、模板DNA的浓度、Mg2+、dNTP和引物浓度等因素进行优化,同时对退火温度、循环次数和延伸时间进行筛选。[结果]在25μl体系中各反应物的最适含量为:0.2 mmol/L dNTP,0.2μmol/L ISSR引物,1.50 U Taq DNA聚合酶,2.5μl 10×PCR Buffer,1.5 mmol/L MgCl2和40 ng模板DNA;循环次数和延伸时间分别是35次和90 s。[结论]该研究建立并优化了老芒麦ISSR-PCR反应体系,通过2份老芒麦种质对所优化体系得验证,结果显示体系稳定,可用于老芒麦种质资源遗传分析。     

油橄榄ISSR-PCR反应体系优化与引物筛选

[目的]对油橄榄ISSR-PCR反应体系进行优化,并筛选出多态性ISSR引物。[方法]以油橄榄嫩叶片提取的基因组DNA为模板,通过单因子试验针对反应体系主要因子Mg2+、dNTPs、引物浓度及模板用量进行油橄榄ISSR-PCR反应体系优化。[结果]优化的油橄榄ISSR-PCR反应体系为:总体系20μl中含1×Taq Buffer,3.5 mmol/L Mg2+,0.4 mmol/L dNTPs,1.0μmol/L引物,1.0 U Taq DNA聚合酶,20 ng DNA模板。反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,52～55℃退火30 s,72℃延伸2 min,40个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。同时利用上述反应体系和反应程序筛选出了扩增稳定、多态性高、扩增条带清晰的ISSR引物11条。[结论]为进一步油橄榄种质资源的多样性研究和品种鉴定奠定了基础。     

瘤胃甲烷生成菌PCR反应条件的优化

[目的]优化适合于瘤胃甲烷生成菌的PCR反应体系。[方法]以1．5周岁健康的藏系绵羯羊瘤胃内容物总DNA为模板,用特异性引物对甲烷生成菌16SrDNA保守序列进行PCR扩增,并通过改变PCR反应体系中的各参数,优化其PCR反应体系中的相关参数。[结果]PCR最优程序为：94℃预变性3min;94℃变性45s,51℃退火458,72℃延伸90s,35个循环;72℃后延伸7min。优化后的PCR反应体系为：5．00山缓冲液,4．00μl d-NTP,2．00μl引物（前引物和后引物各1．00μl）,4．00μl MgCl2,0．25μl TaqDNA聚合酶和1．00μl 1：100倍稀释的DNA模板,然后加水补足25．00μl。[结论]该研究为瘤胃甲烷生成菌功能的研究奠定了基础。