新疆哈密瓜细菌性斑点病种子带菌的分离检测

甜瓜果腐病是一种检疫性病害,可随种子远距离传播,给甜瓜生产带来很大的危害。本研究对哈密瓜种子上携带的瓜类果腐病菌和黄瓜角斑病菌进行了育苗症状检测、直接分离和带菌部位测定。结果表明,甜瓜细菌性果腐病和黄瓜细菌性角斑病均可随种子传播,特别是甜瓜细菌性果腐病种子带菌率较高,而且种子内外都携带一定量的病原菌,但种子带菌以种皮带菌为主。将带菌种子于低温下在PBS缓冲液的浸提液中浸提,2-4小时内的浸提效果较好,得到较充分病原菌的富集。     

利用PCR技术专化性检测瓜类细菌性果斑病菌

将hrpB2基因作为检测靶标,根据hrpB2基因设计了1对特异性引物HB2F2/HB2R2,用此特异引物从瓜类细菌性果斑病菌菌株中扩增出290 bp的特异性片段,而其余参试菌株和甜瓜组织的PCR反应结果为阴性,灵敏度试验证明可以检测到103CFU/ml靶标菌体。对市售的17个品种的甜瓜种子进行PCR检测,其中4个品种检测出携带有瓜类细菌性果斑病菌。将hrp基因作为靶标,为快速检测瓜类细菌性果斑病菌提供了新的方法。     

哈密瓜细菌性果斑病菌快速检测方法的建立

 【目的】哈密瓜细菌性果斑病在中国为新发生的病害，其病原菌为燕麦食酸菌西瓜亚种（Acidovorax avenae subsp. Citrulli），危害瓜果造成品质下降。该病为典型的种传细菌性病害，因此种子检疫成为防治此病害的重要手段。【方法】通过实验，将生物学、免疫学和分子生物学检测技术有机结合，建立了一套针对哈密瓜果斑病的种子带菌检测方法Bio-IMS-Real-time PCR。【结果】经过人工模拟种子带菌检测实验，结果表明该方法可成功地检测出1 000粒种子中的1粒带菌种子（带菌量约为1.04×105 CFU/种子，经计算，可以检测的最初浓度为2 CFU•ml-1 ASCM培养液），且信号较强。【结论】该检测方法的建立，大大提高了对哈密瓜细菌性果斑病菌检测的精度，也为生产实践中哈密瓜果斑病的防治提供了重要的技术支持。     

甜瓜种子细菌性果斑病菌PCR检测方法的研究

以携带细菌性果斑病菌(Acidovoras avenae subsp. citrulli)的甜瓜种子为材料,比较了不同引物、不同种子处理方式、不同浸提液及不同提取时间对细菌性果斑病菌PCR及实时荧光定量PCR检测结果的影响。结果表明:以完整带菌种子浸提液为模板进行PCR扩增,操作最简单且特异条带亮度最高,"种壳+种仁"处理次之,而以磨碎种子浸提液为模板,未能扩增出特异条带。以无菌水作为浸提液的PCR扩增效果明显优于磷酸缓冲液和液体KB培养基,浸提时间以3—12 h为宜。实时荧光定量PCR检测结果与普通PCR一致。在3对特异引物中,引物BX-L_1/BX-S-R_2的普通PCR扩增效果最佳,引物SEQID4~m/SEQID5更适用于实时荧光定量PCR检测。     

瓜类细菌性果腐病病原IAS-PCR检测研究

本研究采用免疫磁珠吸附与PCR相结合的技术,对瓜类细菌性果腐病病原快速检测方法进行了研究。对新疆昌吉、海南、上海等地的西、甜瓜细菌性果腐病病叶、种子进行检测结果表明,用特异性引物,带菌病叶、种子均出现360bp特异条带,该方法对该菌悬浮液最低检出量为1×10cfu/mL,检出种子最低带菌率1‰。与常规PCR方法相比,检测时间周期为4h,且不需进行细菌DNA提取,灵敏度高出常规PCR100倍。这一方法的建立对于田间该病原的准确诊断,控制西、甜瓜种子带菌传播及进出口西、甜瓜种子检疫将起到重要作用。     

瓜类果斑病的发生与防控

调查研究了瓜类果斑病的种子带菌情况、危害特点和产量损失,提出了主要防治技术,以期为减轻该病的传播、扩散和危害提供一定的参考依据。     

哈密瓜细菌性果斑病胞外酶活性测定

为了防治哈密瓜细菌性果斑病初期侵染,通过测定哈密瓜细菌性果斑病病菌生长曲线、病菌胞外酶、果胶酶和纤维素酶变化,掌握哈密瓜细菌性果斑病侵染初期胞外酶、果胶酶和纤维素酶活性的变化规律。结果表明:哈密瓜细菌性果斑病病菌同时产生果胶酶和纤维素酶,说明该病菌在侵染初期的致病力跟这两个酶活性有关。结合病菌生长曲线,果胶酶未呈现明显趋势,而纤维素酶随细菌的生长进入衰退期后活性呈逐渐增加趋势,在44h果胶酶和纤维素酶同时出现波峰,但后期44~72h果胶酶再没有出现大幅增长趋势,而纤维素酶呈明显上升趋势,说明病害后期的扩展纤维素酶起到了主要作用。     

西瓜细菌性果斑病菌Taq Man探针实时荧光PCR检测鉴定方法的建立

根据西瓜细菌性果斑病菌（Acidovorax avenae subsp．citrulli）与相关细菌16SrDNA序列差异，设计出对西瓜细菌性果斑病菌具有稳定点突变特异性探针Aac—probe，利用该探针对23种供试菌株进行了实时荧光PCR检测实验。结果表明，只有西瓜细菌性果斑病菌能检测到荧光增强信号，其它细菌无荧光增强信号。该方法特异性强，灵敏度高，重复性好，可有效地应用于西瓜细菌性果斑病菌的检测。     

不同哈密瓜品种苗期对细菌性果斑病的抗病性鉴定

为探明新疆哈密瓜不同品种对瓜类细菌性果斑病(Acidovorax avenae subsp. citrulli)的抗性差异,提供筛选抗耐病性材料的新来源,通过室内喷雾接种法,对30个哈密瓜主栽品种和后备品种(系)进行了苗期抗病性鉴定,结果表明:新金雪莲为高抗品种,病情指数为2.73;新密25号等12个为中抗品种;新密杂7号等12个为中感品种;金凤凰等5个为高感品种,最高病情指数为52.30;没有免疫品种.     

瓜类细菌性果斑病菌突变体文库的构建及群体感应信号分子突变株的筛选

利用三亲杂交的方法将带卡那抗性的Mini-Tn5转座子随机插入瓜类细菌性果斑病菌xjl12基因组DNA中,构建插入不同位点的突变体文库,通过信号分子高效检测菌株JZAI,筛选群体感应信号分子失活突变株.挑取2株野生株和筛选出的4株突变株,进行Southern杂交,结果表明,转座子Mini-Tn5以单拷贝随机诱变瓜类细菌性果斑病菌获得成功;对筛出的4株突变株进行了致病性和烟草过敏反应测试,发现突变株明显降低了致病性,且2株突变株(5-17,2-57)在烟草上无过敏反应.瓜类细菌性果斑病菌突变体文库的成功构建及筛选到不同突变位点的群体感应信号分子失活突变株,对从基因水平研究瓜类细菌性果斑病菌致病分子机理及群体感应相关基因奠定了基础.     

西瓜细菌性果斑病带菌部位检测及种子处理研究

由燕麦噬酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp.citrulli,简称Aac)引起的西瓜细菌性果斑病(Bacterial Fhat Blotch)是发生在西瓜、甜瓜上的一种毁灭性病害.对3种已有引物进行比较筛选,发现WFB1/WFB2引物对Aac的扩增效果最好.通过对发病西瓜果实不同部位的PCR检...     

西瓜细菌性果斑病菌在不同场所存活期的检测

选择西瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli,Aac)的抗利福平菌株RifAac,通过人工模拟接种试验,采用选择性平板分离、菌落PCR(Bio-PCR)和常规PCR方法,观察该病原细菌在西瓜种子、土壤、病残体和田水中的存活期。结果表明,果斑病细菌在种子表面可存活4～5个月,在田水中可存活2个月,在不含植物残体的土壤中可存活8个月,在含西瓜残体的土壤中可以存活12个月以上。     

不同哈密瓜品种对细菌性果斑病的抗性与蜡质的关系

通过测定对果斑病表现不同抗性的哈密瓜品种的蜡质含量,结果表明:抗病品种种皮的蜡质含量与感病品种种皮蜡质含量存在显著性差异,抗病品种高于感病品种;在叶片上,接种后哈密瓜对果斑病的抗性与叶片的蜡质含量之间无相关性。可见,种皮的蜡质含量可作为衡量哈密瓜抗果斑病的1个参考指标。     

Acidovorax avenae subsp.Citrulli危害新寄主籽瓜和病菌的快速检测

根据病原菌的生物学特性、生理生化特性包括革兰氏染色反应、氧化酶反应、过氧化氢酶反应、氧需求等和特异性PCR扩增结果，以及病原菌危害造成的田间症状，发现燕麦嗜酸菌属西瓜亚种（Acidovorax avenae subsp．Citrulli）可在新寄主一籽瓜上造成严重危害。该病菌在田间主要侵染籽瓜的果实和子叶，症状在果实上尤为明显，形成黑色的星状开裂。为了控制该病的发生，对种子携带病原菌的快速检测方法进行了研究。结果表明，特异性PCR作为检测种传病原菌具有快速、准确和灵敏的特点。当种子浸出液为PCR反应的模板时，可检测出的种子带菌率极限最低为4％；当以种子浸出液提取的DNA为模板时，种子带菌率检测极限为2％甚至更低。     

瓜类细菌性果斑病菌tvrR基因的克隆及其对致病性的影响

根据丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)DC3000中新的毒性基因tvrR(TetR-like viru-lence regulator)的氨基酸序列,从瓜类细菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli,Aac)的全基因组中发现并克隆了tvrR基因的同源物。通过同源重组的方法,构建了tvrR基因的插入突变体,并且经过PCR及Southern杂交验证确认。突变体和野生型一样可以激发烟草过敏反应。致病性试验结果显示:突变体比野生型的病程延长,但最终致病情况与野生型无差异。接种的寄主组织中菌体生长能力检测发现,突变体的繁殖速度慢于野生型,但最终其菌体数量也能达到野生型菌株的最大值。在营养丰富的LB培养基和营养贫乏的MMX基本培养基中生长测定均发现,突变体生长速度慢于野生型,但最终也能达到野生型的最大生长量。瓜类细菌性果斑病菌tvrR基因突变体致病性的改变与其生长能力变化的一致性表明,其致病性的变化是由于其生长能力的改变引起的。     

巢式PCR快速检测西瓜细菌性果斑病菌

【目的】建立nested-PCR方法,快速检测西瓜种子中的燕麦嗜酸菌西瓜亚种（Acidovorax avenae subsp. citrulli,Aac）,为西瓜细菌性果斑病（bacterial fruit blotch of watermelon,WFB）的防控提供技术支持。【方法】 根据Aac BOX短重复序列的PCR产物设计两对引物BX-L1/BX-R5和BX-L1/BX-S-R2,建立以BX-L1/BX-R5为外侧引物,BX-L1/BX-S-R2为内侧引物的nested-PCR,以5 µL样品处理液于99℃高温裂解10 min,再放置冰上冷却5 min,以所释放病原DNA为模板进行PCR扩增,采用50 μL反应体系：5 μL 10×PCR buffer（25 mmol?L-1 MgCl2）,4 μL dNTP （D4030RA,2.5 mmol?L-1）,引物（5 μmol?L-1）各3 μL,0.4 μL Taq DNA酶（DR001B,5 U?μL-1）,通过退火温度优化,反应条件为：引物BX-L1/BX-R5各3 μL进行第一轮扩增,95℃,2 min;95℃,30 s;65℃,45s;72℃,1 min;35个循环;72℃,延伸7 min;取扩增后的产物1 μL为模板,以引物BX-L1/BX-S-R2各3 μL进行第二轮扩增,95℃,2 min;95℃,30 s,66℃,45 s,72℃,1 min,30个循环,72℃,7 min。在此条件下对梯度Aac菌悬液、模拟带菌种子提取液进行特异性、灵敏性及重复性检验,对不同带菌率的西瓜种子提取液进行检测。【结果】引物BX-L1/BX-R5和BX-L1/BX-S-R2在检测不同来源的Aac菌株时都产生了预期大小的片段,并且对其近源种燕麦嗜酸菌卡特莱兰亚种（A. avenae subsp. cattleyae）、魔芋假单胞菌（A. avenae subsp. konjaci）及其不相关菌株未扩增出目标片段。以BX-L1/BX-R5为外侧引物,BX-L1/BX-S-R2为内侧引物的nested-PCR,对Aac纯菌液和模拟带菌种子提取液的最低检测限4.7×101 cfu/mL,比direct-PCR灵敏度高出1 000倍。当西瓜种子带菌率在0.1%-0.5%时,nested-PCR阳性检测率为66.7%;当种子带菌率为1%-10%时,nested-PCR的阳性检测率为83%-100%。【结论】以BX-L1/BX-R5为外侧引物,BX-L1/BX-S-R2为内侧引物的nested-PCR方法,能够快速、高效检测携带微量Aac的西瓜种子,检测结果重现性高。     

海南甜瓜细菌性果斑病病原菌鉴定

通过田间采集病样,分离到致病性细菌菌株LD101206,采用柯赫氏法则对分离物进行致病性测定,通过对其形态学、培养性状、生理生化性状和16S rRNA基因序列分析,将菌株LD101206鉴定为燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp.citrulli Willems)。     

西瓜细菌性果斑病拮抗内生细菌的分离和筛选

从葫芦科作物及空心菜的叶片、茎及花上共分离到95个菌株,采用抑菌圈法共筛选到对西瓜细菌性果斑病病原菌具有不同程度拮抗作用的菌株46株,占分离菌株总数的48.4%;从拮抗菌株中筛选出5株对西瓜细菌性果斑病菌具有较好拮抗效果的菌株,其对西瓜细菌性果斑病的防治效果为68.75%-93.24%.内生性测定结果表明这5株菌株均能在西瓜体内定殖,5株菌株经过革兰氏染色、鞭毛染色、芽孢染色和一些生理生化测定,初步被确定为芽孢杆菌属(Bacillus spp.).