利用PCR技术专化性检测瓜类细菌性果斑病菌

将hrpB2基因作为检测靶标,根据hrpB2基因设计了1对特异性引物HB2F2/HB2R2,用此特异引物从瓜类细菌性果斑病菌菌株中扩增出290 bp的特异性片段,而其余参试菌株和甜瓜组织的PCR反应结果为阴性,灵敏度试验证明可以检测到103CFU/ml靶标菌体。对市售的17个品种的甜瓜种子进行PCR检测,其中4个品种检测出携带有瓜类细菌性果斑病菌。将hrp基因作为靶标,为快速检测瓜类细菌性果斑病菌提供了新的方法。     

瓜类细菌性果斑病菌tvrR基因的克隆及其对致病性的影响

根据丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)DC3000中新的毒性基因tvrR(TetR-like viru-lence regulator)的氨基酸序列,从瓜类细菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli,Aac)的全基因组中发现并克隆了tvrR基因的同源物。通过同源重组的方法,构建了tvrR基因的插入突变体,并且经过PCR及Southern杂交验证确认。突变体和野生型一样可以激发烟草过敏反应。致病性试验结果显示:突变体比野生型的病程延长,但最终致病情况与野生型无差异。接种的寄主组织中菌体生长能力检测发现,突变体的繁殖速度慢于野生型,但最终其菌体数量也能达到野生型菌株的最大值。在营养丰富的LB培养基和营养贫乏的MMX基本培养基中生长测定均发现,突变体生长速度慢于野生型,但最终也能达到野生型的最大生长量。瓜类细菌性果斑病菌tvrR基因突变体致病性的改变与其生长能力变化的一致性表明,其致病性的变化是由于其生长能力的改变引起的。     

瓜类果斑病菌荧光免疫层析试纸条的研制

为建立检测果斑病菌的新型免疫学检测技术,以异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)作为荧光探针,共价偶联抗瓜类果斑病菌野生型菌株SD01的鼠源单克隆抗体4F,将抗SD01单克隆抗体6D和羊抗鼠二抗喷涂于硝酸纤维素膜(NC膜)上分别作为检测线和质控线;以双抗体夹心反应模式制备检测果斑病菌的荧光免疫层析试纸条,并对试纸条的灵敏度、特异性及对实际样品的检测性能进行评估。结果表明:制备的荧光试纸条对纯培养果斑病菌SD01的检出限为3.1×10⁶CFU∕mL;试纸条可检出8种果斑病菌(其中标准株1种,野生株7种),与6株近源的植物病原菌均无交叉反应,表明试纸条具有较高的特异性。在检测实际样品时,8种葫芦科植物的果斑病菌检出限为3.1×10⁶CFU∕mL,表明汁液中的杂质对试纸条的检测灵敏度无影响,该试纸条适用于实际样品的检测。本研究制备的荧光试纸条操作简便、快速,结果肉眼可见,为果斑病菌的快速检测提供了一种新方法。     

西瓜细菌性果斑病菌的室内药剂筛选试验

采用含毒介质法进行6种杀菌剂对西瓜细菌性果斑病的室内毒力测定，结果表明：链霉素、可杀得抑菌效果较好，抑菌最低有效浓度分别为15μg/mL和150μg/mL；其次是细菌灵、细菌杀，抑菌有效浓度均为300μg/mL，而叶青双、百菌清效果较差，抑菌最低有效浓度高达600μg/mL。     

云南省瓜类细菌性果斑病的鉴定

 瓜类细菌性果斑病(BFB)是严重危害葫芦科作物的细菌病害。2009—2010年,通过田间调查,发现云南西双版纳州和普洱市部分地区的西瓜(Citrullus lanatus)和甜瓜（Cucumis melo）上出现疑似瓜类细菌性果斑病病害发生。通过菌株分离纯化、菌体形态和菌落形态特征、革兰氏染色、致病性测定、微生物鉴定系统测定、分子鉴定等方法进行诊断鉴定,结果表明获得的yn2和yn3菌株与西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli) 的特征一致。确定了云南省已有瓜类细菌性果斑病分布,为云南省首次报道。     

甜瓜细菌性果斑病病菌鉴定及不同材料抗病性测定

为明确近几年江苏地区甜瓜叶片及瓜上发生的某一细菌性病害,以江苏绿港现代农业发展有限公司设施大棚中甜瓜发病叶片为研究对象,经分离纯化得到菌株LG08,观察病菌形态初步判定该病原菌为甜瓜细菌性果斑病菌,为进一步明确该病菌,分别用4对细菌性果斑病菌通用标记(BX、BX-S、ERC和WFB)、3对甜瓜细菌性果斑病菌特异性标记(AcM380、AcM797、AcM13)及16S测序进行分析.结果表明,菌株LG08为燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp.citrulli).苗期和坐果期对西甜瓜部分材料接种菌株LG08,结果发现菌株LG08对西甜瓜都有致病性.该研究不仅有利于进一步了解甜瓜细菌性果斑菌的特性,为果斑病的防治提供参考,而且也有助于甜瓜抗病品种的选育.     

黄瓜子叶细菌性果斑病菌侵染初期cDNA文库的构建及质量评价

[目的]构建黄瓜子叶细菌性果斑病菌侵染初期的cDNA文库,研究细菌性果斑病菌与黄瓜相互作用的分子机制奠定基础.[方法]以接种细菌性果斑病菌4d的Chinese long品种自交系9930黄瓜子叶为材料,分离纯化mRNA,反转录合成双链cDNA,利用同源重组的方法将双链cDNA转移到酵母双杂交载体pGADT中,获得cDNA文库,对该文库质量进行分析.[结果]提取的黄瓜子叶总RNA电泳检测出3条特异性条带,分离纯化的mRNA电泳检测呈弥散条带;反转录合成的双链cDNA电泳条带呈弥散状均匀分布,大小分布在850 ～4 000 bp;黄瓜子叶cDNA文库的库容量达2.2×106 CFU/mL,文库重组率为95.8;,文库插入片段的平均长度在1.5kb左右,达到了标准cDNA文库的要求.[结论]所获得的文库质量较高,可以用于进行与功能蛋白相互作用的筛选及研究细菌性果斑病菌与黄瓜相互作用的分子机制.     

细菌的群体感应及其信号分子

主要阐述细菌群体感应的类型、信号分子作用以及应用前景。     

细菌性果斑病菌Acidovorax avenae subsp.citrulli对黄瓜侵染及离体叶片接种方法的研究

由Acidovorax avenae subsp. citrulli引起的细菌性果斑病对西瓜、甜瓜等葫芦科作物是一种毁灭性病害.对分离自发病甜瓜的细菌性果斑病菌供试菌株FC440的抗生素抗性特点、对黄瓜(Cucumis sativus L.)的致病性以及黄瓜离体叶片接种发病条件等病原生物学特性作了研究.结果表明:FC440对氨苄青霉素,氯霉素,壮观霉素,利福平和潮霉素具有抗性,对卡那霉素和四环素敏感,可侵染重要的经济作物黄瓜.离体叶片接种实验显示,不同缓冲液制备的菌悬液在供试黄瓜叶片上形成病斑存在差异,磷酸盐缓冲液(5和10 mmoL/L PBS)悬浮菌液发病较水悬浮菌液快,104 cfu PBS悬浮菌的接种量和107 cfu水悬浮菌的接种量分别可致黄瓜离体叶片在接种8 d内形成典型症状;病斑在划伤条件下以及在老龄叶片上形成快;以5 mmoL/L PBS(pH 7.4) 悬浮,106 cfu的接菌量划伤接种第一、二真叶期叶片,是离体黄瓜叶片上形成病斑的较好的接种方法.这些研究结果为利用该菌的抗生素抗性特点开展其遗传转化工作、离体接种以便规模筛选致病突变体以及研究其与寄主植物互作机制等方面的工作奠定了基础.     

三重PCR检测黄瓜靶斑病菌、炭疽病菌和细菌性角斑病菌

【目的】开发一种可同时检测黄瓜靶斑病菌(Corynespora cassiicola)、黄瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)和黄瓜细菌性角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)的三重PCR快速检测方法。【方法】根据ITS或16S r DNA序列分别设计黄瓜靶斑病原菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌特异性检测引物;通过鉴定引物的特异性,筛选可在目标菌株中扩增出特异片段的特异引物;选择可以组合的3种病原菌特异性引物进行三重PCR,对引物浓度、退火温度、延伸时间和循环数分别进行优化,优化三重PCR体系。【结果】针对黄瓜靶斑病菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌分别设计出5对、7对和6对特异性引物,其中引物CC4F/CC4R和CC5F/CC5R可特异扩增黄瓜靶斑病菌ITS,引物CL1F/CL1R、CL2F/CL2R、CL3F/CL3R、CL3F/CL4R、CL3F/CL5R、CL3F/CL6R和CL3F/CL7R可特异扩增黄瓜炭疽病菌ITS,引物PS3F/PS4R和PS4F/PS4R可特异扩增黄瓜细菌性角斑病菌16S rDNA。引物CC5F/CC5R、CL3F/5R和PS3F/4R扩增片段长度分别为370、275和698 bp,其混合扩增产物可在3%琼脂糖凝胶上得到充分分离,这3对引物选择作为三重PCR引物。在三重PCR反应体系中,当引物CC5F/CC5R、CL3F/5R和PS3F/4R的终浓度分别为0.16、0.4和0.16μmol·L~(-1)时,3个目的片段能同时得到有效扩增;当退火温度大于65℃时,部分目的片段不能有效扩增。最终建立并验证了适合上述3种黄瓜主要病原菌的三重PCR检测体系,即25μL PCR反应体系中含有12.5μL 2×Hiff~(TM) PCR Master Mix(With Dye)、0.16μmol·L~(-1) CC5F/CC5R、0.4μmol·L~(-1) CL3F/CL5R、0.16μmol·L~(-1) PS3F/PS4R。反应程序:95℃预变性3 min;95℃变性30 s,65℃退火30s,72℃延伸2 min,35个循环;最后72℃延伸10 min。【结论】建立的三重PCR方法能够快速检测田间采集的黄瓜发病叶片中的黄瓜靶斑病菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌,灵敏度均可达到0.4 pg·μL~(-1)。     

烟草青枯菌Tn5突变体库的构建及突变位点分析

为了从烟草青枯菌全基因组范围内发掘致病性相关基因,采用电转化法构建了一个EzTn5转座子介导的烟草青枯菌TXLLJ14-3菌株插入突变体库,该突变体库包含1.2万个突变子,经烟草上的致病性检测,共得到216个无致病力或弱致病力突变菌株。利用TAIL-PCR扩增获得其中15个无致病力烟草青枯菌的Tn5侧翼序列,并对其插入位点进行了分析,结果表明,15个突变菌株的插入位点分别位于核苷酸水解酶、糖基转移酶、转座酶和合成酶等具有不同功能的基因上,这些基因受到干扰或破坏后,可能会抑制致病相关物质的表达或分泌,或者诱导烟草对病原菌产生抗性,从而表现出无致病力特征。     

影响静止中心(QC)细胞分裂的EMS突变体库构建与筛选分析

采用正向遗传学方法,以转基因拟南芥(Arabidopsis)SCRGVG UAS∶∶axr3-1为材料来进行EMS诱变。通过外源施加激素DEX诱导GVG/UAS系统启动axr3-1在静止中心表达,导致静止中心发生分裂。通过构建EMS突变体库,得到2 616份M2代候选突变体家系。对M2代种子进行初筛得到43个候选家系。经过复筛,获得22个具有稳定表型的突变体家系。根据表型相似性将候选家系分为5类,共6组。将候选家系进行组内杂交,根据F1代植株表型是否与亲本相似,获得2对等位突变体。这些突变体将为研究干细胞小生境的调控机制研究提供新材料。     

叶锈菌及信号分子诱导小麦TcLr35中β-1,3-葡聚糖酶基因的表达分析

【目的】β-1, 3-葡聚糖酶是一种病程相关（pathogenesis-related,PR）蛋白,了解小麦TcLr35中β-1, 3-葡聚糖酶基因在叶锈菌（Puccinia triticina）与TcLr35小麦互作体系中的表达模式,明确其与TcLr35小麦抗叶锈病相关性,进而探讨PR蛋白介导的小麦成株抗叶锈病的分子机理。【方法】在前期研究基础上,利用生物信息学方法分析已克隆β-1, 3-葡聚糖酶类病程相关蛋白基因TaLr35PR2结构特征,利用半定量RT-PCR方法结合genetools和SPSS软件检测叶锈菌及信号分子诱导后不同时间点该基因表达量,并明确其在小麦根、茎和叶各生长器官及小麦不同生长时期的基因表达模式。【结果】小麦TaLr35PR2含有信号肽,编码定位于液泡的碱性蛋白,蛋白序列与其他物种PR2类蛋白序列具有较高同源性,与普通小麦病程相关蛋白2亲缘关系最近,与水稻病程相关蛋白亲缘关系最远。小麦成株期接种叶锈菌后不同时间点,TaLr35PR2在亲和反应（Thatcher）中表达量变化不大,趋于平缓;而在非亲和反应（TcLr35）中的表达有显著差异,总体上,该基因在非亲和组合中表达量明显高于亲和组合中表达量。检测TaLr35PR2在成株小麦TcLr35各器官中基因表达,该基因在叶片中表达量随接菌时间点延长明显增加,并在接菌后48 h达到表达高峰;而在根中接菌后各时间点均未检测到基因表达;在茎中接菌后48 h开始有少量表达,但表达量变化不大,趋于平缓,总体表达丰度为叶＞茎＞根。在小麦生长发育的不同时期,除1叶期外,该基因在TcLr35和Thatcher中均有表达,Mock（未接菌处理）反应中,TaLr35PR2在小麦不同生长期的表达呈上升趋势;接种叶锈菌后,TaLr35PR2在亲和反应和非亲和反应小麦各生长时期的表达量均高于Mock反应,且在成株期表达稳定。信号分子水杨酸（salicylic acid,SA）、脱落酸（abscisic acid,ABA）均能诱导该基因的表达,信号分子预处理后接种叶锈菌,基因表达量显著上调。【结论】TaLr35PR2的表达受叶锈菌诱导,TaLr35PR2可能参与SA、ABA介导的信号通路,并参与小麦TcLr35成株抗叶锈病防御反应。     

苏云金芽胞杆菌菌株YBT-1518的插入突变体库的构建及芽胞萌发突变株的筛选

通过携带Mini-Tn10转座子的温度敏感性质粒载体pIC333构建了苏云金芽胞杆菌YBT-1518菌株的插入突变体库。从突变体库中筛选得到1株芽胞不能在萌发剂L-丙氨酸诱导下萌发的突变株(命名为MA1),进一步的试验表明该突变株菌株的芽胞在其他氨基酸L-苯丙氨酸、L-缬氨酸和L-亮氨酸以及糖类萌发剂葡萄糖、果糖和蔗糖的诱导下也都不能萌发,表明MA1很可能属于新型的芽胞萌发缺陷突变株。     

梨幼果FWL1膜系统酵母双杂交三框cDNA文库构建及互作蛋白的筛选

【目的】筛选与FWL1互作的蛋白,为研究FWL1基因调节果实大小机理提供依据。【方法】以杜梨、库尔勒香梨、鸭梨、早美香为材料,提取4个梨品种果实细胞分裂关键时期的果肉组织混样RNA。构建梨幼果FWL1膜系统酵母双杂交三框cDNA文库,并鉴定文库质量。构建诱饵载体并转化酵母菌,筛选与FWL1互作的蛋白,对初步筛选出的阳性酵母克隆进行测序并在NCBI中进行Blast比对,确定候选互作蛋白。【结果】文库库容约为3×10⁷ CFU,大于1×10⁷ CFU,平均插入片段大于1 000 bp,阳性率为≥98%。诱饵载体无自激活功能,利用共转化方法,筛选出272个与FWL1互作的蛋白质。【结论】梨幼果膜系统酵母双杂交三框cDNA文库符合酵母双杂文库的基本条件,适用于后期筛选相互作用的蛋白。筛选出的272个互作蛋白在果实发育过程中表达不同,其中collagen and calcium-binding EGF domain-containing protein 1和metallothionein-like protein可能与梨果实大小发育有关。     

草酸青霉菌I1的cDNA文库构建及其溶磷相关基因的筛选

【目的】构建草酸青霉菌I1的cDNA文库,筛选溶磷相关基因。【方法】利用SMART技术构建草酸青霉菌I1的初级cDNA文库,通过难溶磷培养基筛选具有溶磷能力的转化子,测序并进行生物信息学分析。在难溶磷液体培养基中,进行转化子对溶液pH值、可溶磷含量的影响和产有机酸试验。【结果】成功构建了草酸青霉菌I1的初级cDNA文库,其库容量约为5.29×106 cfu•mL-1,重组率为99%;利用难溶磷固体培养基筛选,得到具有溶磷圈的转化子48个,其中转化子I-4的cDNA序列全长536 bp,为一个新的序列,基因编码氨基酸残基序列长129 n.t。转化子E. coli HST08 I-4在液体难溶磷培养基中培养,提高了有机酸的表达量,并增加了有机酸的种类,在培养12 h后,开始产生乙酸,24 h后,溶液中产生乳酸、苹果酸和α-酮戊二酸,培养36 h,溶液pH值由6.32降到3.69,可溶磷含量达到0.1076 mg•mL-1。【结论】从草酸青霉I1中筛选到一个溶磷相关基因pstI。     

遥感概论课程试题库的设计与建立

按照地理信息专业遥感概论的教学大纲要求,研究确定了各章节的知识点,将每一章的知识点又分为基本概念、基本理论和方法、基本操作、综合应用题目4个类别。对每一类知识点提出了明确的出题要求,以指导出题工作,并按照该要求在建立试题库的实际过程中,具体进行了实施。     

Construction of Agropyrum intermedium 2Ai-2 Chromosome DNA Library and Cloning of Species-Specific DNA Sequences

The univalent from the meiosis-metaphase spreads of F1 (Z2× wheat variety Wan7107) was identified to be Agropyrum intermedium 2Ai-2 chromosome by GISH. The 2Ai-2 chromosomes were microisolated and collected. After two rounds of PCR amplification, the PCR products were ranged from 150 - 3 000 bp,with predominant fragments at about 200 - 2 000 bp. Using Ag.intermediumgenomic DNA as a probe, Southern blotting analysis confirmed the products originated from Ag. intermediumgenome. The products were purified, ligated to pUC18 and then transformed into competence E.coli DH5α to produce a 2Ai-2 chromosome DNA library. The microcloning experiments produced approximately 5×105 clones, the size range of the cloned inserts was 200- 1 500 bp, with an average of 580bp. Using Ag. intermediumgenomic DNA as a probe, dot blotting results showed that 56% clones are unique/low copy sequences, 44% are repetitive sequences in the library. Four Ag. intermedium clones were screened from the library by RFLP, and three clones(Mag065, Mag088, Mag139)belong to low/single sequences, one clone(Mag104)was repetitive sequence, and GISH results indicated that Mag104 was Ag.intermedium species-specific repetitive DNA sequence.     

国家图书馆台港澳文献资源建设之我见

随着两岸三地的交往日益加深,台港澳地区的文献资源受到了越来越多的读者关注,国家图书馆作为国家重要的台港澳文献信息提供部门肩负着重要的责任,并且非常重视台港澳文献资源的建设,在一定程度上满足了社会发展对台港澳信息的巨大需求。通过对国家图书馆台港澳文献的“藏”“用”分析．评价了当前国家图书馆台港澳文献资源建设的状况,并就如何进一步做好台港澳文献资源的建设进行了探讨。     

猪C3d分子佐剂PRRSV GP5基因核酸疫苗的构建及免疫效果的研究

 【目的】构建猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GP5基因C3d-P28分子佐剂重组质粒,探明C3d-P28分子佐剂的免疫增强效果。【方法】用大肠杆菌疫苗对健康猪进行免疫激活,提取猪肝脏总RNA,RT-PCR克隆C3d-P28并连接至pUC19载体,构建pUC19-P28.n（2、4、6）串联体,然后分别将P28.n（2、4、6）连接至真核表达载体pcDNA3.1构建成 pcDNA3.1-P28.n（2、4、6）。RT-PCR扩增PRRSV GP5基因,分别定向克隆至pcDNA3.1-P28.n（2、4、6）中,构建pcDNA3.1-GP5-P28.n（2、4、6）重组质粒;提取重组质粒进行双酶切、电泳,同时用重组质粒转染Marc 145细胞,经间接免疫荧光进行蛋白表达检测,并用重组质粒免疫小鼠,通过ELISA试剂盒检测小鼠体内抗体、IL-4和IFN-γ的水平,检验重组质粒的免疫效果。【结果】从猪肝脏中克隆了C3d cDNA,构建了pcDNA3.1-P28.n（2、4、6）串联体,并将PRRSV GP5基因定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1-P28.n（2、4、6）中,构建了PRRSV GP5重组质粒（pcDNA3.1-GP5-P28.2、pcDNA3.1-GP5-P28.4、pcDNA3.1-GP5-P28.6）;通过检测小鼠血清中抗体、IL-4和IFN-γ的结果显示,抗体效价、IL-4和IFN-γ含量均比对照组高,且以pcDNA3.1-GP5-P28.6组的效果最好,与空白对照及PCDNA3.1-GP5组比较差异均显著（P<0.05）。【结论】构建了猪补体C3d-P28分子佐剂PRRSV GP5重组质粒,该质粒可刺激机体产生较高的体液免疫和细胞免疫水平,补体 C3d-P28分子佐剂能显著增强PRRSV GP5基因的免疫效果。