应用RT-PCR和病毒学方法检测低致病力禽流感感染的研究

分别应用病毒分离和鉴定试验以及禽流感病毒(AIV)型特异性RT-PCR技术,对疑似H9亚型AIV感染的10份病死鸡组织病料进行了实验室诊断。结果有7份病例用上述两种方法检测均为阳性;2份病料仅分离到H9亚型AIV;1份病例仅H9亚型RT-PCR阳性。研究表明,对于H9亚型AIV临床组织样品的检测,病毒分离试验的敏感度高于RT-PCR。当检测因运输或消毒药物作用而导致病料中病毒死亡的H9亚型AI临床病例时,RT-PCR有明显的优势。将RT-PCR和病毒分离鉴定两种方法相结合,可提高临床样本的H9亚型AIV的检出率。     

2种水稻矮缩病毒一步检测方法的建立

水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)和南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)是引起水稻矮缩病的2种主要病毒,这2种病毒病在田间危害症状较相似,难以准确鉴定。为建立这2种病毒的一步快速检测方法,从混合引物配比、退火温度2个方面优化了反应体系与反应程序,并用这2类病毒的总RNA进行了RT-PCR验证,最终建立了准确、灵敏、快速的一步检测方法。利用建立的方法对从江西省大余县和南昌县采集的水稻矮缩病毒叶片样品进行检测。结果表明:大余县10份样品均为南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV),检出率为100%;南昌县10份样品中有7份样品检出南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV),检出率为70%,另外3份样品检出水稻黑条矮缩病毒(RBSDV),检出率为30%。     

牛肠道病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

参照GenBank中登录的牛肠道病毒(BEV)全基因组序列,针对其3D基因设计合成了1对特异性引物,提取病毒RNA,逆转录为cDNA,进行PCR扩增,经条件优化,建立了BEV的RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性进行验证。结果显示,该方法从分离的牛肠道病毒中扩增出了732 bp的特异性目的片段;且对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCoV)等相关病毒均无交叉反应;其检出敏感度达10-1TCID50。应用该方法对山东地区84份临床疑似发病牛样品进行检测,21份为阳性,阳性检出率为25%。     

鹅星状病毒SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法的建立

为建立快速检测鹅星状病毒(GAstV)的方法,本研究根据GenBank中GAstV ORF2基因序列设计1对特异性引物,构建重组质粒pMD19-T-GAstV,以其作为标准品建立了GAstV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。优化其反应条件及体系,进行特异性、敏感性和重复性试验以及临床样本检测。试验结果显示,除GAstV外,禽白血病病毒(ALV)、血清4型禽腺病毒(FAdV-4)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)和鸡传染性贫血病病毒(CIAV)等常见禽病病原利用该方法检测均呈阴性,表明其特异性良好;建立的荧光定量RT-PCR检出的最低模板含量为1μl 3.75×10~1拷贝,敏感性较高;组内和组间重复性试验变异系数均小于1%。利用该方法对来自安徽地区的32份临床样品进行检测,阳性检出率为43.75%,常规PCR方法阳性检出率为18.75%,阳性检出符合率100%,表明该方法可用于临床样品检测。该方法的建立为临床样品中GAstV的快速高效检测提供了技术支持。     

新型鸭呼肠孤病毒一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速、敏感和特异性检测新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)的方法,本研究根据GenBank数据库中NDRV S3基因保守序列设计1对特异性引物和1条MGB荧光探针,建立了一种检测NDRV的一步法MGB荧光定量RT-PCR方法,对其特异性、敏感性和重复性进行检验,并与普通RT-PCR进行比较。结果显示,扩增标准曲线相关系数为0.999,扩增产物的熔解曲线仅出现单特异峰。该方法对经典鸭呼肠孤病毒、H9N2禽流感病毒、鸭坦布苏病毒、A型鸭肝炎病毒、鸭新城疫病毒、鸭瘟病毒及番鸭细小病毒均未检测到信号,对NDRV的最小检出量为10拷贝·μL^-1。组内和组间变异系数均小于2%,重复性好。此外,利用该方法对239份疑似新型呼肠孤病毒病样品进行检测,常规RT-PCR检测时有75份为阳性,一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法检测时有100份为阳性,而且常规RT-PCR检测出的阳性样品用一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测时均为阳性,符合率为100%。该检测方法的建立为NDRV早期快速检测及定量分析提供新的方法。     

靖西大麻鸭主要疫病的监测及防控效果评估

为掌握靖西大麻鸭A型流感、鸭瘟、鸭病毒性肝炎、鸭疫里默氏杆菌等主要疫病流行情况及H5亚型禽流感免疫效果,2015~2016年共对采自于活鸭、病死鸭、外环境样品495份使用RT-PCR进行A型流感病原核酸检测,结果检出阳性样品13份,阳性率为2.63%;对85只不同日龄阶段死亡的靖西大麻鸭进行病原检测,检测鸭瘟全部呈阴性,病毒性肝炎呈阳性3份,阳性率为3.5%,鸭疫里默氏杆菌呈阳性6份,经血清型鉴定均为血清I型,阳性率为7.1%;检测靖西大麻鸭血清样品1313份,H5亚型禽流感免疫抗体合格1112份,合格率为84.1%。同比2014年,2015~2016年靖西大麻鸭A型流感病原阳性率(下降8.05个百分点)显著下降(P=0.04290.05),鸭疫里默氏杆菌检出率下降10.3个百分点,鸭H5亚型禽流感免疫抗体合格率提高5.9个百分点。表明靖西大麻鸭A型流感、鸭病毒性肝炎、鸭疫里默氏杆菌等主要疫病防控工作逐年得到加强,效果显著,但依然存在疫情风险。     

禽坦布苏病毒连接酶依赖RT-PCR检测方法的建立及应用

根据连接酶依赖PCR工作原理设计并建立一种禽坦布苏病毒RT-PCR快速检测方法。结果显示,该方法能特异性检测不同禽源的坦布苏病毒分离株,且与常规RT-PCR检测敏感性相当。运用该方法对动物攻毒试验采集的6份样品及2011~2012年间采集自福建、江西、浙江及广东省发病鸭场的140份样品进行检测。动物试验样品均为阳性,临床样品检出率为14.3%(20/140)。试验结果表明,本试验所建立的连接酶依赖RT-PCR方法具有快速、敏感、特异等优点,可用于禽坦布苏病毒的流行病学调查及病毒检测。     

用单抗夹心ELISA快速检测鸡新城疫病毒

采用传统的病毒分离的方法将免疫鸡群泄殖腔棉拭样品盲传一代，再用新城疫单抗夹心ELISA对F1尿囊液进行新城疫病毒(NDV)检测。结果表明本方法具有良好的特异性，NDV阳性样品检出率很高，且鸡禽流感病毒(AIV)对此无干扰作用；分别检测阳性样品453份、阴性样品2959份，与动物世界卫生组织(OIE)推荐的病毒分离及鉴定、毒力试验的经典检测方法相比较，符合率为99．3％、99．7％；测定的变异系数为8％，稳定性较好，同时本法比经典的检测方法缩短检测时间7d。结果表明用单抗夹心ELISA法检测鸡泄殖腔棉拭样品F1尿囊液新城疫病毒实用、准确、特异、稳定、快速。     

新疆地区四种草莓病毒病原的检测

【目的】研究新疆草莓病毒病病源种类及田间发生情况,建立主要病毒病原多重RT-PCR检测体系,为无病毒草莓生产提供理论和技术支持。【方法】利用已报道的4种草莓主要病毒病原4对特异性引物,分别对新疆主要草莓种植区采集表现疑似病毒病症状的草莓样品共450份,采用单一反转录PCR(RT-PCR)及多重PCR对采集的样品进行检测,分析新疆草莓病毒病的发生情况。【结果】感染新疆草莓有3种主要病毒,南北疆15个不同栽培区均能检测出这3种病毒,每个采集地的病毒检出率均在26%以上。所有样品中病毒总检出率为64.22%;其中,草莓镶脉病毒(strawberry vein banding virus,SVBV)检出率最高,为51.78%;草莓斑驳病毒(strawberry mottle virus,SMoV)检出率为23.78%,草莓轻型黄边病毒(strawberry mild yellow edge virus,SMYEV)检出率为9.33%,草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus,SCV)没有检出。病毒复合侵染率达18.45%,两种病毒病复合侵染检出率为16.67%,三种病毒病复合侵染检出率为1.78%;所有样品中对3种病毒的多重RT-PCR与单一RT-PCR检测结果一致。【结论】新疆草莓受SVBV、SMoV和SMYEV三种病毒危害,单一病毒病感染率以及两种以上病毒复合侵染侵染率都较高,在无病毒种苗的培育和生产中加强病毒检测。     

单抗夹心ELISA检测免疫鸡群新城疫病毒

用SPF鸡胚将送检的免疫鸡群泄殖腔棉拭样品盲传一代，再用新城疫单抗夹心ELISA对F1代尿囊液进行新城疫病毒(NDV)快速检测，同时用世界动物卫生组织(OIE)推荐的NDV分离及鉴定的方法加以验证。通过对3423份样品的检测，检出阳性样品453份，阴性样品2959份，可疑样品11份，两种方法的阳性符合率为99．3％，阴性符合率为99．7％。对全部阳性样品进行病毒分离，经血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验证明均含有新城疫病毒(NDV)，再将全部阳性样品分离物进一步作毒力鉴定，结果有强毒力株、中等毒力株及弱毒力株，因此用新城疫单抗夹心ELISA检测免疫鸡群泄殖腔棉拭样品F1代尿囊液新城疫病毒快速、准确率高，呈阳性者不全是NDV强毒力株感染，还有NDV中等毒力株或弱毒力株感染。     

Correlation Research of the Serological Test (HI) and Challenge Test of Duck Tembusu Virus Inactivated Vaccine

【Objective】The objective of this paper was to evaluate the correlation of the serological test (HI) and challenge test of duck Tembusu virus inactivated vaccine.【Method】Three batches of vaccines ( laboratory trial products) were used to immunize the 51-day-old young ducks and 260-day-old laying ducks by intramuscular injection in 0.15, 0.3, 0.5 and 1.0 mL, respectively. Secondary immunization was proceeded in the same doses and route at 14 day after primary immunization. Ducks were regrouped according to the HI titer and challenged with 0.5 mL (100 DID₅₀) DTMUV at day 28 after secondary immunization. Serum samples were collected at 2 days later for virus isolation and laying ducks were dissected at 8 days later to observe the ovarian lesions. All the results were counted to evaluate the immune potency of vaccines. The correlation of HI titer and immune protection rate was analyzed.【Result】The protection rate of immunized young ducks with HI titer of 1:5 or lower, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 was 50% (20/40), 43.8% (7/16), 74.3% (26/35), 86.7% (26/30), 96.6% (57/59), 92.7% (51/55), 95% (38/40) and 100% (11/11), respectively. The protection rate was 48.2% with HI titer lower than 1:20, while the rate was 74.3% with HI titer of 1:20 and 93.8% with HI titer of 1:40 or greater. In laying ducks, the protection rate of flocks with HI titer of 1:5 or lower, 1:20, 1:40 and 1:80 was 66.7% (12/18), 83.3% (10/12), 95.2% (20/21) and 100% (15/15), respectively. The protected proportion of ducks with HI titer of 1:10, 1:160, 1:320 and 1:640 was 2/3, 7/7, 1/1 and 2/2, respectively. The protection rate was 66.7% with HI titer of 1:10 or below, while the rate was 83.3% with HI titer of 1:20 and 97.8% with HI titer of 1:40 or greater. There were significant positive correlations between the HI titer and the immune protection rate both in young ducks and laying ducks. The Spearman’s correlation coefficient was 0.905 (P<0.01) and 0.932 (P<0.01), respectively. 【Conclusion】There were positive correlations between the HI titer and the immune protection rate of duck Tembusu virus inactivated vaccine (strain HB). The HI detection could be used to evaluate the efficacy of duck Tembusu virus inactivated vaccine (strain HB) instead of challenge test. The HI titer of 1:20 could be defined as the criteria of protection for the duck Tembusu virus inactivated vaccine after immunization.     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒样品对细胞的敏感性

从疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的发病猪场采集组织和血清样品并按病料分成2组,通过反转录—聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测样品中高致病性PRRSV发生变异的Nsp2部分基因,初步筛选出PRRSV阳性样品后分别通过Marc-145和PAM细胞分离培养。结果表明：从45份阳性病料中成功分离到29份高致病性PRRSV,其中从血清样品中成功分离的约占总数72.5%,从组织样品中成功分离的约占总数27.5%;通过Marc-145细胞分离获得的病毒有19份,通过PAM细胞分离获得的有24份,其中有14份是Marc-145和PAM共同分离得到。试验获得的血清是高致病PRRSV分离的理想样品,该病毒对Marc-145和PAM细胞的敏感性差异不显著。     

繁殖障碍型H3亚型猪流感病毒的分离与鉴定

于广东惠州市某猪场采集流产死胎的肺组织、胎衣及鼻棉拭子,病料处理后经SPF鸡胚绒毛尿囊腔接种获得1株有血凝(HA)活性的病毒,通过AGP试验初步确定为猪流感流感病毒;但此病毒的血凝现象不能被抗H1亚型猪流感单因子血清、抗H5亚型猪流感单因子血清、抗H7亚型猪流感单因子血清、抗H9亚型猪流感单因子血清抑制,而能被抗H3亚型猪流感单因子血清抑制;通过H3亚型猪流感病毒RT-PCR分子生物学诊断,最终确定该病毒为H3亚型猪流感病毒.动物回归试验结果显示,攻毒小鼠出现精神萎靡、厌食、嗜睡、被毛松乱、呼吸较急促,攻毒后7 d采集小鼠血清进行检测,HI效价为3log2～4log2;剖检发现病毒性肺炎,且能从病料中再次分离到H3亚型猪流感病毒.     

H1亚型猪流感病毒的分离鉴定

从山东、浙江、湖南、广西等地区各猪场采集30份疑似猪流感病猪的病料,通过鸡胚培养、血凝及血凝抑制试验、电镜观察、RT-PCR和测序分析进行了分离鉴定。结果从山东和湖南两地分离到4株有血凝活性的病毒,其中山东的2株病毒与新城疫病毒阳性血清的血凝抑制试验为阳性,通过电镜观察湖南的2株病毒具有猪流感病毒的特征,且与抗H1亚型猪流感病毒阳性血清的血凝抑制试验为阳性;根据H1亚型猪流感病毒HA基因设计引物,利用RT-PCR扩增出543bp片段,经序列分析证实该病毒为H1亚型猪流感病毒。     

猪乙脑快速诊断方法的建立与应用

根据乙脑病毒基因组3′末端保守区设计一对特异性引物,建立了乙脑病毒不同株的RT-PCR诊断技术.该技术可以从乙脑病毒WHe株、SA14-14-2株、P3株、SA14-14-2VS株接种的鼠脑组织中扩增出486bp的核酸片段,检出的灵敏度约为2pg.对20份临床样品的检测结果与小鼠脑内接种试验(MIT)的测定结果完全吻合,但RT-PCR诊断技术可在3h内直接对组织进行诊断,具有敏感、快速、稳定的优点.     

上海市规模化猪场猪流感的血清学调查

采用HI和EHSA方法，于1999—2002年间对上海市规模化猪场猪群进行了猪流感的血清学调查，通过对猪血清HI、ELISA试验的同步检测，表明本市规模化猪场猪血清仅对流感病毒的H3、H1亚型易感，能产生特异性血凝抑制现象或显色反应，表明存有针对H3、H1亚型流感病毒的血清抗体，阳性率31．8％至94．9％不等，而且种猪的阳性率及抗体滴度明显高于肉猪和保育猪。     

冰冻切片免疫酶和免疫荧光技术快速检测REV抗原

以禽网状内皮组织增生病病毒(reticuloendotheliosis virus,REV)的单克隆抗体11B154作一抗,建立了在冰冻切片中快速检测REV的免疫酶(IHC)和免疫荧光技术(Mc-IFA)。运用两种技术对人工接种REV的肉种鸡和疑似REV田间病例的肝脏、脾脏、腺胃、心脏、骨髓等器官的组织进行了检测,并同病毒分离方法进行了敏感性和特异性的比较。结果表明:在人工接种的肉种鸡中,采用IHC、Mc-IFA和病毒分离方法结果一致,均为阳性;在送检的疑似RE的24份病料中,用IHC检测出阳性率51.7%(13/24),Mc-IFA检测出阳性率62.5%(15/24),其中13份存在交叉;病毒分离的阳性率为37.5%(9/24),阳性数包括在13份IHC阳性病料中。由此表明冰冻切片免疫酶和免疫荧光技术都可用于临床快速检测,其中免疫荧光可用于早期的粗检,而免疫酶可用于细胞内抗原定位。     

应用套式RT—PCR检测广西临床病料猪流感病毒

套式RT-PCR技术是在常规RT-PCR的基础上设计1对内套引物,对常规RT-PCR的产物再进行一次PCR扩增,该技术比常规RT-PCR技术的检测敏感度更高,更适于检测病原RNA含量极其少的临床病料。通过应用套式RT-PCR方法对来自广西7个市不同猪场的疑似猪流感的临床病料进行猪流感病毒检测,结果发现,被检的7个市均检出猪流感病毒,72份病料中31份为阳性,阳性率为43．06％,可见广西有呼吸道症状的病猪中有较高猪流感病毒感染率,必须重视和加强广西猪流感的监测与防控工作。     

猪瘟病毒4种检测方法的比较

应用病毒分离鉴定、荧光抗体法、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和夹心ELISA 4种方法,分别对23份猪瘟病料组织中的猪瘟病毒(CSFV)进行了检测,并比较4种检测方法的优缺点。结果显示,病毒分离鉴定法准确性较高,诊断比较容易,但存在试验步骤繁琐,所需时间长的缺点;荧光抗体检测法所需时间较短,但需要经验比较丰富人员来判定结果,且存在假阳性结果,特异性比较差;RT-PCR检测法具有快速、敏感等优点,特别是样品保存不理想时更有价值,利用套式PCR(nested-PCR)可以提高检测的特异性;夹心ELISA检测法具有快速、敏感等优点,但在样品保存不理想时会出现假阴性结果。