鸭源新城疫病毒的分离与鉴定

[目的]分离并鉴定鸭源新城疫病毒。[方法]从安徽地区鸭病料中分离新城疫病毒,测定其鸡胚半数感染量(EID_(50))、鸡胚平均致死时间(MDT)和1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)。[结果]2株新城疫病毒均为强毒。通过RT-PCR技术对这2株鸭新城疫病毒的F基因进行序列测定与分析,结果发现F基因裂解位点为~(112)RRQKRF~(117),符合NDV强毒株裂解位点氨基酸序列。F基因遗传进化树分析发现,AH1株属于基因Ⅶ型,而AH2株属于基因Ⅵ型,来源于鸽源病毒。[结论]水禽新城疫病毒(NDV)的感染来源复杂,应避免将不同种类的家禽混合饲养。     

3株鸽源新城疫病毒陕西分离株F基因的克隆与序列分析

对3株鸽源性新城疫病毒F基因进行扩增和序列分析,探讨分离毒株相互之间以及与疫苗毒之间的遗传进化关系.采集病料,通过非免疫鸡胚接毒传代分离病毒,HA及HI试验鉴定其为ND病毒;设计特异性引物,RT-PCR扩增分离ND病毒F 基因的重要功能区片段(1 395 bp),并对其进行克隆、测序及序列分析.结果表明:3株鸽源NDV陕西分离株相互之间F 基因核苷酸序列的同源性在98.0%～99.3%,氨基酸序列同源性为98.5%～99.1%;其F 基因裂解位点的氨基酸组成与NDV 强毒株的特征性结构(112 R-R-Q-K-R-F117 )一致.系统发育进化树表明,此3 株强毒株与某贵州分离株(登录号:EF589137) 高度同源,处于进化树的同一分支,属于基因Ⅵ型.分离到的3株鸽源NDV之间同源性较高,鸡胚病变和序列分析表明其为强毒,与传统的La Sota,B1等疫苗株同源性很低.     

复合RT-PCR快速鉴别鹅副粘病毒与鸡新城疫病毒

对新近分离的鹅副粘病毒SF02株通过自行设计的3条引物建立了复合RT-PCR方法。该方法对鹅源副粘病毒SF02株和GPV2株均可检测到215bp和401bp2条带，对12株(其中7株参考株，5株野毒)鸡源新城疫、2株鸽源新城疫、1株鸭源新城疫病毒的检测只出现1条401bp带，与预期的大小一致，对H5、H9亚型禽流感病毒、鸭病毒性肝炎病毒、传染性支气管炎病毒、SPF鸡胚尿囊液均未检测到特异性条带。     

鸡新城疫病毒分离株F基因的分子特性分析

【目的】对新城疫病毒(NDV)分离毒株进行分子特征分析,了解免疫鸡群发生新城疫的原因。【方法】用非免疫鸡胚从病鸡肺脏中分离新城疫病毒;参考GenBank上发表的NDV的F基因序列设计引物,应用RT-PCR方法对新城疫病毒分离株进行扩增,并构建克隆载体,对阳性质粒测序后进行F基因核苷酸及推导氨基酸序列分析。【结果】从发病鸡群中分离到6株NDV,分离毒株间的F基因核苷酸和F蛋白氨基酸同源性分别在99.6%~99.9%和99.1%~99.8%;分离毒株与参考毒株的F基因核苷酸和F蛋白氨基酸序列同源性分别在83.2%~87.3%和90.2%~93.8%;分离毒株F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株的分子特征;6个分离株均属NDV基因Ⅶ型。【结论】NDV分离株的F基因已经发生明显变异,与La Sota、Clone-30、V4等常用疫苗株在遗传进化上的亲缘关系较远,这可能是免疫鸡群发生新城疫的重要原因之一。     

15株NDV地方株的分离鉴定与生物学特性

从1998~2002年河南省洛阳地区代表性新城疫发病禽群中分离鉴定了15株新城疫病毒(NDV),并对其生物学特性进行了研究。结果表明,15株NDV均呈现良好的血凝活性和特异的血凝抑制特性;对鸡胚的致病作用可被新城疫阳性血清所抑制;对鸡胚最小致死量的平均死亡时间(MDT),1日龄雏鸡脑内接种的致病指数(ICPI)和6周龄鸡静脉内接种的致病指数(IVPI)的测定证实,LD-6-01和LR-2-00株是弱毒株,其余均为强毒株;弱毒株的血凝素热稳定性较好,属慢速血凝解脱型;强毒株的血凝素热稳定性差,属快速或中速血凝解脱型;所有毒株均可较好地凝集鸡和人(O型血)的红细胞,但对其他动物的红细胞凝集性差异较大。对HI抗体为6log2的12日龄雏鸡攻毒试验结果表明,15个分离株中2个弱毒株可得到100%保护;13个强毒株中,LG-1-99,LR-1-98,LD-4-01和LD-3-00得到了70%~90%的保护,而其他9个分离株(LD-1-98,LD-2-99,LD-5-01,LD-7-02,LR-3-02,LW-1-02,LG-2-00,LA-1-99和LE-1-01)基本上得不到保护(0~20%),但所有得不到保护的试验组鸡的发病死亡时间均明显向后推迟。     

肉鸽新城疫病毒山东分离株的分离鉴定及其F基因的分子特性分析

从山东某发病肉鸽的体内分离到一株新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV),命名为Pigeon-Shandong-JN-08(简写JN08),对其融合蛋白(fusion,F)进行序列和分子特性的分析,以了解肉鸽NDV的遗传起源和分子特性。JN08经病毒蚀斑克隆纯化后动物回归试验可产生典型的NDV病变。研究结果发现,F蛋白多肽裂解位点的序列为112RRQKRF117,符合鸽源NDV强毒氨基酸基序。F基因分型及同源性比较显示:JN08与绝大多数鸽源毒株同属于基因Ⅵ型;其F基因与基因Ⅱ型毒株LaSota,B1,Bingham,TEX-48氨基酸同源性为89.9%,89.7%,90.4%,89.7%,与基因Ⅰ型毒株Ulster67的氨基酸同源性为91.3%,与基因Ⅲ型传统强毒F48E9的氨基酸同源性为92.8%;与国内鸽分离株P1-03,CH98-98,JS1-06,PB01-96和GZ-07的氨基酸同源性分别为91.3%,94.6%,94.8%,95.1%,94.0%;与国外鸽分离株Capital3-97,Tigre6-99,1166-02,IT227-97,2736-00,NY-84,TX3503-04,248VB-98的同源性分别为96.2%,93.8%,98.0%,96.8%,97.1%,96.8%,96.8%,98.4%。从F基因遗传进化树上发现:JN08与国外分离株的遗传距离较近,处于同一基因亚型上,而与国内分离株的遗传距离较远。     

一株鸽副粘病毒分离株的毒力及免疫原性

从病/死鸽中分离到1株病毒,血清学鉴定该分离病毒为禽Ⅰ型副粘病毒(PPMV);该病毒经毒力测定结果显示,PPMV的毒力与鸡新城疫病毒(NDV)La Sota株的毒力相似,为自然弱毒株;对该分离株F基因裂解位点的序列分析结果表明,PPMV F裂解位点附近的氨基酸序列为112G-R-Q-G-R-L117,属于弱毒株的特征性序列.将该株病毒制备成灭活疫苗,分别免疫鸽、鸡,结果都能诱导鸽、鸡体产生较高水平的HI抗体;分别以鸡新城疫标准强毒株F48E9、本组分离于鸡的野毒株CPMV( MDT 45.4 h,ICPI 1.85,IVPI 2.42)和分离于鹅的野毒株GPMV( MDT 59 h,ICPI 1.88,IVPI 2.39)攻击免疫鸡群,免疫鸡群可得到保护,而非免疫鸡群被攻击后全部致死.结果表明,用该分离毒制成的油乳剂灭活苗对鸡安全,具有良好的免疫效果,可抵抗鸡新城疫、鹅副粘病毒的攻击.用HI方法检测该株病毒与La Sota株之间的交叉血凝抑制试验,结果显示La Sota株与PPMV两毒株间的抗原性差异较小.     

Ⅶ型NDV对鸽子和鸡的致病性差异研究

【目的】研究NDV强毒(基因Ⅶ型)对鸽子和SPF鸡的致病性差异。【方法】将试验鸽和SPF鸡随机分为4组,每组10只,给其中2组分别滴鼻和肌肉注射鸭源NDV分离株Duck/China/SD03/2009,攻毒剂量为106.2EID50,设空白对照组和同居感染组。攻毒后观察临床症状和剖检变化,并对攻毒后3,5,7,14d动物的血清抗体,喉头、泄殖腔的排毒情况及内脏器官的病毒滴度、抗体效价进行检测。【结果】鸽子感染NDV强毒后呼吸道症状不明显,但脑膜严重出血,腺胃和肠道轻度出血,死亡率为10%~30%;而同期SPF鸡攻毒后表现为急性感染症状,死亡率为100%。鸽子在攻毒后第7天均检出排毒,至14d时均未检出。攻毒后5~14d在所检鸽体内脏器官中均检出病毒,以脑、肺、肠中的病毒含量较高。病毒也可诱导鸽子产生较高水平的血清抗体,至14d时血清抗体HI滴度为512~2 048。【结论】基因Ⅶ型新城疫强毒株Duck/China/SD03/2009对鸽子和鸡的致病性差异明显,与SPF鸡相比,鸽子感染后呼吸道和消化道症状较轻,死亡率也较低,表明基因Ⅶ型NDV强毒株能感染鸽子,但对鸽子的致病性较低。     

2株不同来源的新城疫病毒的F基因克隆和序列分析

以1株从发病鸽中分离到的新城疫病毒(PNDV／99株)和1株从发病鹅中分离到的新城疫病毒(GNDV／00株)为研究对象，用反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)对它们的F基因进行分段扩增、定向克隆到pUCll9质粒载体，然后测定它们的核苷酸序列，并推导出相应的氨基到序列。PNDV／99株和GNDV／00株的F基因全长1662bp，编码553个氨基酸，它们的裂解位点的氨基酸序列为112G-R-Q-G-R-L117，是NDV弱毒株特有的序列结构。序列分析结果表明，它们2株之间的核苷酸同源率高达99．28％，氨基酸同源率则为100％；它们与国内标准毒株F48E9的核苷酸同源率只有87．48％和87．36％，氨基酸的同源率都为91．68％；而它们与弱毒株La Sota的核苷酸同源率别为98．50％和98．74％，氨基酸同源率都为98．73％。     

腺胃型传染性支气管炎病毒的分离鉴定

从河北病鸡肿大腺胃中分离到1株病毒(命名为CK/CH/HBHS/07F株),经鸡胚传代、血凝特性测定、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)干扰试验、传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)膜蛋白(membrane protein,M)基因序列分析、人工感染试验等方法对该病毒进行了鉴定。该分离毒株感染鸡胚的尿囊液没有直接血凝活性,经胰酶处理后可凝集鸡红细胞,其血凝活性可被IBV阳性血清所抑制;经鸡胚传至第3代时,可致死鸡胚或出现侏儒胚;序列分析结果表明,该病毒M基因与18株不同致病型IBV毒株间的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为82.8%~94.1%、82.4%~97.4%,与腺胃型毒株CK/CH/LJL/04I同源性最高,该分离株能人工复制出与自然病例相似的病理变化。初步证实CK/CH/HBHS/07F株为腺胃型IBV。