安徽省猪伪狂犬病毒的分离鉴定及其主要毒力基因分子特征

猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)引起的一种急性、热性传染病。自2011年底以来,PRV发生了变异,传统的PRV弱毒疫苗已不能对PRV变异株提供完全保护,这给我国PR防控带来了巨大挑战。为了解安徽省PRV流行特征及其主要毒力基因遗传变异情况。利用PCR技术、细胞接种试验、电子显微镜观察、间接免疫荧光试验及兔体接种试验等方法,对安徽省临诊病例中疑似PRV感染的病猪进行病原检测及PRV分离鉴定,并通过设计6对特异性引物对PRV分离株主要毒力基因(gE、gI、TK、gB、gC、gD)进行克隆及测序分析。2016—2018年安徽省临诊病例中共分离鉴定15株PRV;PRV分离株主要毒力基因序列均与2011年后国内PRV变异株同源性较高;与2011年前国内PRV经典株序列比对,PRV分离株gE、gB、gC及gD基因存在多个位点的一致性替换、插入或缺失,且gE、gC基因多位点突变位于其重要的抗原表位区。本研究分离的15株PRV均为变异株,变异株已成为安徽省主要的流行毒株。15株PRV分离株的gI、TK基因序列较为保守,而gE、gC蛋白抗原表位区域氨基酸的突变可能导致其毒力及抗原性发生改变。部分PRV分离株与邻近地区PRV序列同源性均为100%,可能与频繁跨省调运生猪、跨区引种等原因有关。     

鸭瘟病毒ZJ2016强毒株部分基因序列的测定与分析

2016年,浙江省一鸭场发生疑似鸭瘟病例,经鉴定,病鸭感染鸭瘟病毒,命名为ZJ2016病毒株。实验应用二代基因测序方法对该病毒核酸进行全基因测序,鉴定分析鸭瘟病毒ZJ2016株抗原与毒力相关基因序列特征。对测序病毒主要囊膜糖蛋白基因gB、gC、gG、gH、gI、gK、gL、gM、gN与致病力基因LORF11、UL2、UL12、UL41、UL47、US10进行核酸与氨基酸序列分析,并与已发表毒株序列及疫苗株(VAC株、clone-03株)序列比较。结果显示,与疫苗免疫保护抗原相关的ZJ2016株囊膜糖蛋白序列与疫苗毒株序列相比未发生明显的变异,而ZJ2016株的LORF11、UL2、UL12、UL41、UL47、US10基因结构及同源性与疫苗株氨基酸序列差异明显,且与中国其他分离强毒株LH2011株、CHv株、CV株同源性较高,表明该毒株具有强毒株的基因型特征。     

马源蜡样芽孢杆菌的分离鉴定及毒力基因检测

为鉴定从内蒙古通辽市某马术俱乐部发病及死亡赛马体内分离出的一株病原菌,本研究对分离菌株进行革兰氏染色镜检、动物致病性试验、全自动微生物分析系统检测、16S rRNA基因扩增、系统进化树分析及部分毒力基因PCR检测。结果显示:分离株生化特性符合蜡样芽孢杆菌的特性;其对克林霉素、庆大霉素等药物敏感,对头孢西丁、环丙沙星等药物中度敏感,对氨曲南、头孢唑林等药物耐药;16S rRNA基因序列与GenBank中已登录的蜡样芽孢杆菌序列同源性为100%;系统进化树分析表明,分离株与蜡样芽孢杆菌等亲缘关系最近;毒力基因PCR检测结果显示,8种潜在的毒力基因entFM、cytK、hblA、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC均呈阳性。试验结果表明,该分离菌株为具有严重致病性的蜡样芽孢杆菌。     

广东甘薯疮痂病病原菌鉴定

[目的]明确广东甘薯疮痂病的病原菌种类及生物学和系统发育学特征,为甘薯疮痂病防治及抗病育种提供参考.[方法]从广东省茂名和湛江等甘薯产区采集甘薯疮痂病植株,采用分生孢子悬液梯度稀释分离法分离病原菌,通过病原菌的形态特征观察、致病力测定,结合核糖体内转录间隔区(ITS)、28S核糖体RNA(LSU)、RNA聚合酶II第二大亚基(rpb2)和翻译延伸因子1-α(TEF1)部分序列的多核苷酸序列系统学分析等方法对病原菌进行鉴定.[结果]共分离获得26株单分生孢子分离物,随机选取3株代表性菌株SPEb-1、SPEb-2和SPEb-3进行观察和测定.光学显微镜下观察发现,3株代表性菌株的产孢细胞透明,内生芽殖;分生孢子单细胞,透明,短棒形,两侧顶端钝圆,大小为6.1~9.0μm×2.2~3.0μm;分生孢子梗短棒状;致病性人工接种表明,3株代表性菌株均可侵染甘薯引起典型的疮痂病症状.3株代表菌株的ITS、LSU、rpb2和TEF1序列与痂囊腔菌属(Elsino?)的E.ampelina、E.bidentis、E.arachidis、E.mimosae、E.ricini和E.sesseae等多个种的对应序列一致性为95%~99%.系统发育进化树分析结果显示,3株代表性菌株与蓖麻痂囊腔菌(E.ricini)单独聚成一支.[结论]广东甘薯疮痂病的病原菌为甘薯痂囊腔菌(E.batatas).     

浙江地区猪圆环病毒2型检测及遗传变异分析

为了掌握浙江地区猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)流行病学特点和遗传变异情况,应用PCR检测方法,对2018年浙江地区猪场采集的临床疑似病料进行PCV2检测,并对部分阳性病料进行全基因扩增、克隆、序列测定和ORF2遗传进化树分析。结果显示:329份临床疑似样品中,PCV2阳性率27.4%(90/329),其中宁波地区阳性率最高,为52%;保育猪和肥育猪阳性率最高,分别为38.8%(64/165)和68.8%(11/16)。选取7份病料进行全基因组扩增,每个毒株随机挑选3个或4个阳性克隆进行序列测定,共得到22个毒株进行遗传变异分析。22株病株同源性为93.3%~99.8%,与16个参考毒株同源性为93.5%~99.8%。根据遗传进化树分析,22个毒株分别处于3个分支,其中6株PCV2a,6株PCV2b,10株PCV2d,说明目前浙江地区PCV2d是优势毒株。ORF2遗传进化树分析显示,ORF2核苷酸同源性较全基因组核苷酸同源性低, 3个分支分别处于PCV2b、PCV2d和PCV2e,预示浙江地区流行毒株可能在向PCV2e转变。本研究掌握了PCV2在浙江地区的流行动态,为浙江省PCV2疫苗株的选择和疫苗研发提供了理论依据。     

甘薯基腐病病原菌分离鉴定及对甘薯品种的致病性测定

甘薯基腐病是引起甘薯茎基部褐化干枯的重要病害。田间调查发现,浙薯13茎基部褐化干枯,病部有黑色小粒点。对病害样品进行镜检、病原菌分离鉴定,并对3个甘薯品种进行致病性测定。镜检发现,病组织上产生的黑色小粒点为病原菌分生孢子器,产生的分生孢子为椭圆形,两端各有1个油球;分离纯化获得菌株ZJUP0002,该菌株在PDA培养基上初为白色,后期为黄色,菌丝稀疏,不产孢。ITS序列系统发育分析,将其鉴定为Diaporthe destruens。将菌株ZJUP0002接种至浙薯77、浙薯13和心香3个甘薯品种的茎基部,3个甘薯品种均表现出相同的基腐症状,其中浙薯13和心香发病较重。结果表明,浙江宁海发生的甘薯茎基部褐化干枯是由Diaporthe destruens引起的甘薯基腐病,不同甘薯品种对甘薯基腐病菌的抗病性有差异,其中浙薯77抗病性较强。     

四株猪伪狂犬病毒株的分离鉴定与主要毒力基因分析

猪伪狂犬病毒(PRV)的流行对中国养猪业造成巨大损失,而2011年后许多已免疫PRV疫苗的猪场频繁出现gE抗体转为阳性现象,感染猪出现PRV的临床症状,并出现所谓的“流产风暴”,学者们怀疑PRV的重新流行与病毒毒力增强和基因变异有关。为了解PRV变异情况,从各地疑似PRV阳性病料中,通过PK-15细胞分离出4个毒株,对毒株传代培养,进行TCID₅₀与LD₅₀测定,对主要毒力基因gB、gC、gE和TK进行扩增测序后分析,确定该4株病毒为PRV株,分别命名为FJ01株、FJ03株、YK株和MS2018株,滴度分别为10^-6.63、10^-7.08、10^-8.10、10^-7.18 TCID_50s·0.1mL^-1,对Balb/c小鼠的LD₅₀分别为10^2.17、10^2.72、10^3.44、10^3.51 TCID_50s,可见FJ01株的毒力最强。对4个毒株的毒力基因与其他PRV毒株进行同源性比对并建立进化树,FJ01株、FJ03株、MS2018株与中国近几年流行的变异毒株如HNX株、HNB株、JS-2012株等在一个大进化分支上,亲缘性较近,而与疫苗株Bartha-K61、SA215等,国际经典毒株Becker、Kaplan等亲缘性较远,变异较大。YK株与国际毒株亲缘性更近,其原因有待进一步探索。     

肉牛源毛孢子菌Trichosporon loubieri的分离鉴定与药敏试验

为探究肉牛真菌性皮肤病的病因并有效防治该病。取发生皮癣病肉牛患部的皮屑、被毛进行真菌学检查和分离。采用沙保弱氏培养法对皮屑和毛发样品进行分离纯化。对分离株进行形态学、分子生物学鉴定和小鼠致病性、药敏试验。最终从样本中分离到一株真菌(编号zrfg01)。对分离株进行PCR扩增,获得长度为542 bp的转录基因间隔区(intergenic spacer,IGS)序列片段,序列提交GenBank,获得序列号为MF401393.1。序列在Blast中比对结果显示,zrfg01与编号KT936593.1的Trichosporon loubieri的相似性为100%。根据形态学和分子生物学方法将其鉴定为T. loubieri。动物实验表明该菌对小鼠有选择性致病作用。药敏试验表明,该菌在25 ℃环境条件下,对特比萘芬和氟胞嘧啶耐药,对克霉唑、两性霉素B、氟康唑、伏立康唑较为敏感。该研究可为诊断和治疗T. loubieri引起的肉牛皮肤癣菌病提供重要参考。     

二化螟两种P450基因CYP4M38和CYP4M39的时空表达分析

细胞色素P450在昆虫对外源物质代谢中发挥重要作用,是昆虫重要的解毒酶系。CYP4家族是昆虫细胞色素P450基因家族中的重要分支,与昆虫的解毒代谢密切相关。为初步明确CYP4家族基因在二化螟中的表达信息,本文测定分析了二化螟两种P450基因CsCYP4M38和CsCYP4M39的序列同源性及时空表达谱,序列同源性分析发现CsCYP4M38与烟草天蛾MsCYP4M2氨基酸序列同源性最高,序列一致性高达56.86%;CsCYP4M39与烟草天蛾MsCYP4M1氨基酸序列同源性最高,序列一致性高达59.96%,构建系统发育树显示,CsCYP4M38与CsCYP4M39属于CYP4家族,且分别与MsCYP4M2和MsCYP4M1进化距离较近;时空表达谱测定结果表明,两种基因在不同发育阶段和不同组织中的表达存在差异性,CsCYP4M38在2龄幼虫、5龄幼虫及雌成虫内表达量相对较高,在1龄幼虫中表达量最低,CsCYP4M39在幼虫期表达量相对较高,且表达量随龄期增加呈现先上升后下降的趋势,在卵、蛹及成虫中表达量相对较低。CsCYP4M38和CsCYP4M39在脂肪体、中肠及表皮中的表达量相对较高,且均在脂肪体内的表达量最高。明确基因表达谱是研究其功能的基础,CsCYP4M38和CsCYP4M39在不同阶段的表达量具有一定的变化性,说明这两种基因在二化螟不同发育历期中的功能不同,而两种基因均在脂肪体中表达量最高,这可能与脂肪体是昆虫的主要的解毒代谢场所有关。     

浙江省地方鸡种禽白血病毒抗原检测与部分分离株GP85基因序列分析

为了解浙江地区地方品种鸡中J亚群禽白血病病毒(subgroup J avian leukosis vrius,ALV-J)的感染情况与流行毒株的分子特征,对浙江省部分地方品种鸡体内ALV的p27抗原进行了检测,从疑似感染鸡群中检测分离到5株 ALV-J,并对其GP85基因进行PCR分子克隆和序列分析。研究结果显示:在检测的19个地方鸡品系中,所有品系的鸡样本都呈现抗原阳性,其中101系的抗体阳性率最高,母鸡阳性率为40.48%,公鸡阳性率为16.54%;126系次之,母鸡阳性率为28.87%,公鸡阳性率为3.30%;171系抗体阳性率最低,其母鸡阳性率仅为4.08%,公鸡的感染率为0。为了解地方鸡群中ALV-J的遗传变异,对分离到的5株ALV-J的GP85基因进行了分子克隆和序列分析。结果表明,5个分离毒株的GP85基因大小均为924 bp,与预期一致;本研究样品序列之间的核苷酸同源性为90.8%~98.5%,与原型毒株HPRS103核苷酸相似性为90.3%~97.0%,与国内其他分离株的同源性为86.5%~99.0%。分离株与福建(FJ201308株)和广东(WF13株)分离株的同源性最高。结果表明:浙江省大部分地方品种鸡都不同程度感染ALV-J,而且分离毒株已经发生了不同程度的变异,提示我们应加强浙江省地方品种鸡ALV的净化工作。     

甜瓜细菌性果斑病菌检测技术研究进展

综述了近年来甜瓜细菌性果斑病害检测技术的研究进展,强调了检测技术的发展对我国入世以后植物病害检测检疫的重大意义。     

Bleeding canker of pear——An emerging devastating disease

正Bleeding canker (BC) of pear trees,is a devastating disease in China.The disease was originally observed in Jiangsu Province and its causal agent was identified first as Erwinia sp.in the early 1970's and latter as a novel species,Dickeya fangzhongdai.BC is epidemically emerging prevalently from April to September annually in pear-growing regions in Zhejiang,Anhui and Shandong provinces,and threatening pear industry currently in China.To better control BC disease,it is crucial to know BC symptomatology,epidemics,etiology,and diagnostics first.The special topic of the three papers have well illustrated the points mentioned above.The first article by Chen et al.(2020b) described in detail the symptomatology,etiology and epidemiology of BC disease.BC mainly damages pear trunks and branches with no obvious symptoms early and bacterial rusty oozes mixed with tree saps exuded from died tissues later.The diseased portions display small soft and sap-filled brown spots or red streaks with strong smells likely of yeast fermentation.Importantly in this paper,the causal agent is identified as     

甘薯茎腐病田间症状识别与快速镜检诊断研究

为寻找一种适应基层植物检疫站应用的甘薯茎腐病产地检疫方法,以有效控制其传播与蔓延。通过多年田间发病全程观察及对甘薯茎腐病306份茎部和270份其他部位样本的显微镜检查并与传统和分子生物学方法比较和验证。研究表明甘薯茎腐病症状识别加显微镜喷菌现象观察能准确区分甘薯细菌性茎腐病与其他病原引起的甘薯茎基部腐烂病。明确了甘薯茎腐病初发病期的茎基水渍状斑始现时是镜检最佳和最有效时期,茎部是显微镜镜检的最佳部位。初期甘薯茎腐病症状识别加显微镜镜检喷菌现象的方法与传统和分子生物学方法匹配的准确率在98%~100%。这一方法不但准确、快速、简便、直观,而且适于国内基层植检站应用。     

青海省马铃薯黑胫病病原菌的鉴定

为明确引起青海省马铃薯黑胫病的病原菌,从青海省不同地区马铃薯黑胫病病样分离病原菌,研究病原菌的形态学特征、致病性、生理生化特性,并结合16S rRNA序列进行病原学鉴定。结果表明:引起马铃薯黑胫病的5个菌株均为黒腐果胶杆菌(Pectobacterium atrosepticum),来源不同的菌株接种马铃薯后致病力有差异;其中,3株强致病力菌株主要来自于乐都、湟中和大通,2株中等致病力菌株来自于民和和湟源。综上,黒腐果胶杆菌是引起青海省马铃薯黑胫病的病原菌。     

哈密瓜细菌性果斑病菌快速检测方法的建立

 【目的】哈密瓜细菌性果斑病在中国为新发生的病害，其病原菌为燕麦食酸菌西瓜亚种（Acidovorax avenae subsp. Citrulli），危害瓜果造成品质下降。该病为典型的种传细菌性病害，因此种子检疫成为防治此病害的重要手段。【方法】通过实验，将生物学、免疫学和分子生物学检测技术有机结合，建立了一套针对哈密瓜果斑病的种子带菌检测方法Bio-IMS-Real-time PCR。【结果】经过人工模拟种子带菌检测实验，结果表明该方法可成功地检测出1 000粒种子中的1粒带菌种子（带菌量约为1.04×105 CFU/种子，经计算，可以检测的最初浓度为2 CFU•ml-1 ASCM培养液），且信号较强。【结论】该检测方法的建立，大大提高了对哈密瓜细菌性果斑病菌检测的精度，也为生产实践中哈密瓜果斑病的防治提供了重要的技术支持。     

云南省瓜类细菌性果斑病的鉴定

 瓜类细菌性果斑病(BFB)是严重危害葫芦科作物的细菌病害。2009—2010年,通过田间调查,发现云南西双版纳州和普洱市部分地区的西瓜(Citrullus lanatus)和甜瓜（Cucumis melo）上出现疑似瓜类细菌性果斑病病害发生。通过菌株分离纯化、菌体形态和菌落形态特征、革兰氏染色、致病性测定、微生物鉴定系统测定、分子鉴定等方法进行诊断鉴定,结果表明获得的yn2和yn3菌株与西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli) 的特征一致。确定了云南省已有瓜类细菌性果斑病分布,为云南省首次报道。     

台州发现2种新的甘薯病害

为明确甘薯基部腐烂病害的病原菌与发病原因,2015—2017年开展甘薯病害调查取样、病原菌鉴定与防治试验。结果表明：台州甘薯基部腐烂病主要由甘薯茎腐病菌( Dickeya dadantii)与甘薯基腐病菌(Phomopsis destruens)等复合侵染引起。简述了2种病害的分布情况、症状识别、病原菌形态、入侵途径及病害发生特点,提出了加强植物检疫、建立健康种苗制度、水旱轮作和薯田淹水、清洁田园和化学药剂预防等防控措施,以及从保障国家粮食安全的战略高度,加大经费投入,开展甘薯主要病虫抗性基因筛选、培育抗性品种和新入侵病害致病成因研究等建议。     

利用甘薯青枯病菌及其粗毒素测定甘薯品种抗瘟性的相关性研究

用甘薯青枯菌液及其粗毒素在温室内测定甘薯幼苗的抗病性，结果表明青枯菌菌株侵染甘薯幼苗的病情指数与其粗毒素的致萎度之间呈正相关，相关系数为0.9458(n=88)，达极显著水平；用5个不同致病力（强、中、弱）甘薯青枯菌株及其粗毒素分别接种抗、中、感甘薯品种华北48、广薯15、惠红早，结果表明甘薯品种对不同致病力青枯病菌菌株及其粗毒素的抗性呈极显著正相关，相关系数在0.9992-1.0000之间；以不同致病力甘薯青枯菌混合菌株及其粗毒素接种抗、中、感甘薯品种97-10、广薯15、惠红早，结果表明不同抗性甘薯品种病情指数与致萎度之间也存在极明显正相关，相关系数为0.9257-0.9651。说明在室内用粗毒素检测甘薯幼苗的致萎度，能够反映甘薯对甘薯瘟病的抗病或感病水平。     

广西甜瓜细菌性果斑病病原鉴定及16S rDNA序列分析

【目的】对广西区内疑似甜瓜细菌性果斑病的病原菌进行分离鉴定,明确引起该病害的病原菌,为甜瓜细菌性果斑病的抗病育种及综合防治提供理论依据。【方法】分别采集南宁市和贺州市疑似甜瓜细菌性果斑病的病叶(编号:WM0922)和病果(编号:XD0611)样品,对样品进行分离纯化,并通过测定分离菌株的致病性、观察菌落形态和培养性状、测定其生理生化性状及比对分析16S rDNA序列,对供试病原菌进行鉴定。【结果】从编号WM0922的病叶上分离得到5株菌株,经致病性测定有3株菌株(WM0922-2、WM0922-3和WM0922-4)具有致病性;从编号XD0611的病果上分离得到8株菌株,经致病性测定有4株菌株(XD0611-5、XD0611-6、XD0611-7和XD0611-8)具有致病性;择优选取具有代表性的菌株WM0922-3和XD0611-7进行后续试验,发现二者均可侵染葫芦子叶,革兰氏反应均为阴性,培养性状及生理生化测定结果一致,对比分析16S rDNA基因序列,与Acidororaxcitrulli的相似性均在99%以上。【结论】引起甜瓜细菌性果斑病的病原菌为燕麦嗜酸菌西瓜亚种(A.avenae subsp.citrulli)。     

甜瓜细菌性斑点病拮抗菌的分离与筛选

从新疆昌吉及吐鲁番甜瓜地采集样品86份,以果腐病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli)F159、BFB和角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)P4为指示菌,采用试管混菌平板涂布法,共计分离到195株菌,对甜瓜细菌性斑点病有拮抗作用的菌株63株,其中细菌56株,放线菌7株.以管碟法复筛,获得有较强拮抗活力的菌株2株,分别为细菌G-14、放线菌P-13.