鲫CyHV-2病毒病的诊断及组织病理损伤研究

【目的】为了确定一例鲫(Carassius auratus)鳃出血症的病原。【方法】无菌操作条件下从患病鱼的肝脏、脾脏等病原灶处分离病原菌;利用压片法取鳃丝、体表粘液进行观察,检查是否有寄生虫感染;取鳃、肝脏、脾脏、肾脏用聚合酶链式反应(PCR)技术检测鲤疱疹病毒Ⅱ型病毒(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2),并构建系统发育树,结合组织病理学技术以分析鳃出血症的病因。【结果】结果发现,病鱼尾鳍末端发白,鳃丝出血、末端轻微溃烂,有少量红色腹水;寄生虫学检测未发现鳃丝和体表黏液有寄生虫寄生;通过微生物学诊断,未见病原菌生长;PCR检测结果显示患病鲫体内CyHV-2呈阳性;组织病理学检测表明,患病鲫的主要损伤靶器官为脾脏、鳃、肾脏、肠道、心脏和肝脏,主要引起重度鳃出血和坏死性鳃炎,重度坏死性脾炎、中度至重度肠炎、中度至重度坏死性肾炎、中度坏死性心肌炎和中度心内膜炎和轻度坏死性肝炎。【结论】推断本次鲫鳃出血症为CyHV-2感染导致。     

江苏地区1株锦鲤疱疹病毒的鉴定

对我国江苏地区养殖锦鲤暴发性鲤疱疹病毒病(koiherpes virus disease,简称KHVD)的病原进行鉴定。2018年5月,江苏省一锦鲤养殖场暴发不明原因传染疾病,病鱼肝、脾、肾脏中未分离到细菌。透射电镜观察发现大量球状病毒粒子。提取自然发病鱼的鳃、肾、脾、肝组织DNA作为模板进行PCR检测,结果显示为阳性。Blast比对结果显示,扩增序列与锦鲤疮疹病毒(koi herpesvirus,简称KHV)胸苷激酶(thymidine kinase,简称TK)基因和KHV DNA聚合酶(SPH)基因核苷酸序列同源性为99%。对病毒株的TK基因全长序列进行系统发育分析,证实该毒株属于KHV亚洲型毒株。     

铜绿微囊藻通过食物链对红鲤肝和鳃组织的影响

研究了铜绿微囊藻通过以多刺裸腹溞为媒介生物的食物链对红鲤肝和鳃组织的影响,结果表明：1）当铜绿微囊藻密度为5.0×103 cells/mL时,红鲤肝细胞的损伤表现为细胞肿大,细胞核变形,细胞质空泡化;鳃细胞的损伤程度主要表现为细胞肿大,但整个细胞形状基本完整.2）当铜绿微囊藻密度为5.0×105 cells/mL时,红鲤肝细胞的病理损伤表现为细胞形状完全消失,细胞核严重萎缩变形,部分细胞膜溶解,细胞质有凝集现象;鳃细胞病理表现为细胞肿大.3）铜绿微囊藻密度为5.0×106 cells/mL时,红鲤肝细胞中绝大部分细胞核消失,细胞质凝集呈现颗粒状;鳃细胞也出现了小部分细胞核消失和细胞质凝集现象.     

异育银鲫呼肠孤病毒的分离与鉴定

【目的】发现异育银鲫Carassius auratus gibelio新病原,为其病害防控提供理论基础。【方法】从吉林省某养殖场采集异育银鲫出血病疑似病样,对其进行细菌分离及寄生虫观察、鲤疱疹病毒Ⅱ型的PCR检测和人工感染试验,然后用感染滤液接种鲤上皮瘤细胞(EPC),并对其进行电镜观察。对病毒基因组进行SDS-PAGE电泳分析、RT-PCR鉴定及序列测定。【结果】发病异育银鲫无细菌及寄生虫感染,鲤疱疹病毒Ⅱ型的PCR检测无特异性条带,将过滤后的患病鱼组织滤液感染健康异育银鲫,7 d内死亡率高达86.7%。盲传4代后出现明显的细胞病变。负染后电镜下可观察到病毒粒子,直径约70 nm,病毒颗粒近球形,无囊膜结构,初步判断为呼肠孤病毒(暂命名JL-4)。SDS-PAGE结果揭示,JL-4基因组由11条dsRNA组成,呈现水生呼肠孤病毒基因组典型特征。将RT-PCR扩增产物的序列进行聚类分析,结果显示,JL-4与呼肠孤病毒HZ08株S6序列相似性高达99%,证明该分离株为呼肠孤病毒。【结论】从患病异育银鲫中分离到1株呼肠孤病毒。     

鲤摄食含氧化鱼油的饲料后其病理学的变化

用含质量分数为10%的氧化鱼油半精制饲料饲喂鲤Cyprinus carpio,并对鲤摄食氧化鱼油后的病理学变化进行了研究。试验组饲料中氧化鱼油过氧化物值(POV)分别为69.5、145.3和263.6mEq O2/kg,对照组饲料的POV为3.6 mEq O2/kg。经过112 d试验,各组鱼的发病率分别为16.7%、40.0%和76.7%,死亡率分别为10.0%、23.3%和40.0%;对照组鱼未发病。试验鱼生长不良,出现特征性的瘦背症及渗出性素质样病变。解剖可见:肝胰腺、肾脏肿大,颜色变淡,肌肉水肿,红肌褪色;肝胰腺后期呈墨绿色,上有针尖到米粒大的灰白色坏死灶;鳃小片上皮细胞增生;肝细胞变性及溶解性和凝固性坏死;胰腺腺泡萎缩,腺细胞坏死;肌纤维萎缩、变性、坏死。电镜下,可见各组织细胞线粒体肿胀、扩张,嵴断裂溶解,结构破坏;心肌细胞膜肿胀、扩张,间隙增宽,闰盘变浅甚至消失;肾小管上皮细胞溶酶体增多,微绒毛脱落;骨骼肌纤维萎缩。     

镜鲤野鲤碘泡虫病的诊断与组织病理损伤研究

【目的】明确引起四川省某养殖场镜鲤(Cyprinus carpio L.)鳃出现乳白色赘生物的病原，探讨其对鳃组织的病理损伤，为该病的诊断和防治提供科学依据。【方法】采集发病症状明显的鱼，对其进行剖检、病原学检测(细菌、真菌、寄生虫)和分子生物学鉴定；采集鳃组织，通过病理学观察分析其致病性。【结果】病鱼脾和肾组织均未分离到细菌；鳃丝压片可见真菌菌丝，孢囊压片可见大量寄生虫孢子，孢子内含有2个明显的“八”字形对称极囊，其形态与粘孢子虫类寄生虫形态特征相似。该孢囊的18S rRNA基因扩增序列(GenBank登录号：KT240127)与碘泡虫(Myxobolus)的18S rRNA序列同源性最高，达92%～97%；在系统发育树中，该孢囊与野鲤碘泡虫(Myxobolus koi)(GenBank登录号为FJ841887和KJ725077)聚为一族。组织病理学观察发现：野鲤碘泡虫以大孢囊的形式仅寄生于鳃弓和鳃丝，形成巨大的寄生虫孢囊，囊内包裹大量成熟孢子；鳃小片增生和坏死，可见大量炎性细胞浸润，表现为寄生虫性、增生性和坏死性鳃炎。【结论】野鲤碘泡虫为本次引起镜鲤鳃乳白色赘生物的病原。本研究首次...     

湖北省蛋鸡I群禽腺病毒感染的病例诊断

2015年10月,湖北省某规模化鸡场产蛋鸡群相继发生某种疾病,日死亡率达2%。为了明确患病蛋鸡死亡的原因及确定病原,对临床送检患病蛋鸡开展了病理解剖、组织病理学观察、PCR检测和病毒分离等实验室诊断。结果表明,患病蛋鸡临床剖检可见心包内有淡黄色清亮液体,肝脏肿胀、脂肪变性和变色,肾脏肿大、尿酸盐沉淀较多;病理组织学观察发现肝细胞核内形成嗜碱性核内包涵体;病料样品及病料鸡胚接种尿囊液,PCR扩增产物测序结果与I群禽腺病毒hexon基因同源性为99%,表明分离到的病毒为I群禽腺病毒。     

肉种鸡禽白血病与马立克氏病混合感染的初步诊断

2018年11月,江苏省某肉种鸡场26周龄鸡群出现采食下降、精神沉郁、消瘦、产蛋下降、死亡等症状,临床剖检主要病变为肝脏、脾脏肿大,表面可见灰白色结节,腺胃、肾脏肿大,胸骨上可见圆形白色肿瘤病灶。为了明确肉种鸡发病的原因及确定病原,无菌采取肝脏、肾脏等病变组织,开展了PCR鉴定和组织病理学观察等实验室诊断。结果表明,病料PCR检测禽白血病毒和马立克氏病毒为阳性,组织病理学观察发现肝脏、脾脏、腺胃、心肌内弥漫大量MD和ALV-J特有肿瘤细胞。上述结果初步表明,该病例为J亚群禽白血病病毒与马立克氏病病毒混合感染。     

鲤肠黄脉病样中烟粉虱传双生病毒的检测

在严重发生番茄曲叶病的田间,发现主要杂草鲤肠表现出叶脉褪绿黄化、叶片皱缩或卷曲等症状,田间病株率达63%;用烟粉虱传双生病毒兼并引物对随机采集的20个鲤肠病样进行PCR检测,结果发现,从这些病样中均能扩增出1条356 bp的特异片段;室内人工接种试验结果显示,鲤肠分离物可以侵染番茄而引起曲叶症状。因此,鲤肠可能是广东番茄曲叶病毒的自然中间寄主。     

花斑裸鲤GeHSP70基因的克隆及其对重金属Cu2+胁迫的应答

【目的】克隆花斑裸鲤GeHSP70基因,并进行生物信息学分析;研究正常和Cu~(2+)胁迫条件下GeHSP70的表达模式。【方法】采用分子生物学技术克隆花斑裸鲤GeHSP70基因的全长cDNA,分析其生物信息学特征。采用Real-time PCR技术分析正常和0.01mg/L Cu~(2+)胁迫(胁迫0,12,24,48h)条件下GeHSP70mRNA在花斑裸鲤肝脏、肾脏、脑和鳃4个组织中的表达情况,并采用ELISA试剂盒检测肝脏、鳃组织中GeHSP70蛋白的表达水平。【结果】花斑裸鲤GeHSP70序列共1 387bp,由123bp的5′-UTR、592bp的3′-UTR和672bp的编码区构成,编码223个氨基酸;GeHSP70蛋白是疏水性蛋白,分子质量为11.15ku,等电点为5.01,包含2个HSP70家族的特征序列:IDLGTTYS(11-18位氨基酸)和IFDLGGGTFDVSIL(199-212位氨基酸)。GeHSP70基因核苷酸序列与鲫鱼的同源性最高(93%),在系统进化树中与同科或属中鱼种聚合成一个分支,显示出高度保守性。Real-time PCR结果表明,正常条件下花斑裸鲤GeHSP70在鳃组织中的表达量最高,其次是肝脏,在脑和鳃组织中表达量较低;随着0.01mg/L Cu~(2+)胁迫时间的延长,花斑裸鲤肝脏、肾脏和鳃组织的GeHSP70mRNA表达量先升后降,在24h表达量最高,而脑组织的表达量持续升高;GeHSP70在花斑裸鲤肝脏和鳃组织的蛋白水平表达量总体均表现为先升后降,表明Cu~(2+)能够诱导GeHSP70的表达。【结论】成功克隆了花斑裸鲤GeHSP70cDNA全长,在0.01mg/L Cu~(2+)胁迫下花斑裸鲤GeHSP70在mRNA水平和蛋白水平呈规律性应答,表明GeHSP70是潜在的反映水环境质量的生物标志物。     

柏氏鲤与荷包红鲤抗寒品系杂交子二代的RAPD分析

采用随机扩增多态性DNA（RAPD）分子标记技术，对荷包红鲤抗寒品系与柏氏鲤进行杂交所获得的F2代个体进行亲子鉴定分析。从180个随机引物中筛选出5个多态性较丰富的引物，并对其产生的多态性DNA片段进行统计分析，结果显示：双亲的RAPD谱带全部在F2代中表现出来，而子代中产生的所有谱带在双亲中的表现率在AB02、AB05、AC20、AI10、AI13几个引物中分别为87．0％、100．0％、92．1％、82．8％、92．6％。这也表明BAPD技术在对鲤的亲子鉴定中具有很强的可行性。     

柏氏鲤与荷包红鲤抗寒品系杂交子二代的RAPD分析

采用随机扩增多态性DNA（RAPD）分子标记技术，对荷包红鲤抗寒品系与柏氏鲤进行杂交所获得的F2代个体进行亲子鉴定分析。从180个随机引物中筛选出5个多态性较丰富的引物，并对其产生的多态性DNA片段进行统计分析，结果显示：双亲的RAPD谱带全部在F2代中表现出来，而子代中产生的所有谱带在双亲中的表现率在AB02、AB05、AC20、AI10、AI13几个引物中分别为87．0％、100．0％、92．1％、82．8％、92．6％。这也表明BAPD技术在对鲤的亲子鉴定中具有很强的可行性。     

诺氟沙星对鲤鳃弓软骨组织病理学的影响

以大肠杆菌ATCC25922菌株为鉴定菌,用琼脂扩散单层法测定了渔用抗菌药诺氟沙星在鲤Cyprinus carpio鳃弓等组织中的分布,考察该药对鳃弓软骨的组织病理学影响。结果表明,诺氟沙星对稚鲤软骨组织有较强的亲合力,在软骨中分布较多,肝脏中次之,肌肉中较少;用浓度为150、900 mg/L以上的诺氟沙星药液浸泡鲤5 d,可导致稚鲤的鳃弓软骨细胞出现坏死、溶解、空泡等组织病理学损伤。据此认为,在防治幼龄鱼类患感染性疾病时,应慎用氟喹诺酮类药物。     

阿维菌素在草鱼体内的药物代谢动力学研究

【目的】研究阿维菌素在草鱼体内的药物代谢动力学,为实际生产中阿维菌素的使用提供理论指导。【方法】用初始质量浓度为0.3 μg/L的阿维菌素水溶液药浴草鱼,于给药后0.5,1,2,3,4,6,8,10,12,24,48,72,96,144,216,336,528和576 h采取血浆、肌肉+皮、肝脏、肾脏、鳃等样品,采用高效液相色谱荧光法测定阿维菌素在草鱼血浆中的质量浓度及在组织中的含量,数据经3P97药动学软件分析。【结果】在(26.0±1.0) ℃的水温条件下,阿维菌素单剂量浸泡给药0.3 μg/L,血药经时过程符合二室开放式模型。主要药动学参数如下：分布半衰期(T_1/2α)34.2 h,吸收半衰期(T_1/2(ka))15.61 h,消除半衰期(T_1/2β)163.22 h,药时曲线下面积(AUC)2 486.02 (μg·h)/L,达峰时间(T_peak)40.75 h,峰质量浓度(C_max)11.92 μg/L。药后72 h时草鱼肌肉、肝脏、肾脏和鳃中阿维菌素含量均达到最高值,其中肝脏中的含量最高,达到17.8 μg/kg,其后依次为肾脏(12.1 μg/kg)、肌肉(10.7 μg/kg)和鳃组织(5.2 μg/kg),血浆中阿维菌素含量在48 h达到最高(11.2 μg/L)。肝脏、肾脏和鳃组织中阿维菌素含量均呈“双峰”曲线,前两者在144 h时都有第2次吸收高峰,分别为15.0和8.4 μg/kg。【结论】草鱼血浆及各组织中阿维菌素在给药后24 d未检出,考虑到临床应用情况的复杂性及理论值与实测值之间的差距,建议对草鱼单剂量(0.3 μg/L)药浴阿维菌素后的休药期为24 d。     

鲤竖鳞病组织病理研究

鲤竖鳞病的组织病理变化主要表现为溶血，水肿，变性坏死和炎症，病鱼的皮肤，鳞囊，鳍、鳃、肾、肝、脾和肠都显出不同程度的病理变化，尤其是肾，锶和皮肤更严重。     

鲤鱼春季病毒血症病毒磷蛋白基因的克隆与原核表达

【目的】克隆鲤鱼春季病毒血症病毒（SVCV）的磷蛋白（P蛋白）基因,并对其进行原核表达,为进一步制备SVCV-P蛋白单克隆抗体及建立新的SVCV诊断方法奠定基础。【方法】采用RT-PCR方法扩增SVCV P蛋白基因,将其克隆入pET-28a(＋)载体中,获得原核重组表达质粒pET28-P,进行原核表达。将该重组原核表达质粒转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞中,用0.4 mmol/L IPTG进行诱导表达,用镍亲和层析试剂盒对表达产物进行纯化,分别用SDS-PAGE和Western Blotting方法对表达产物进行鉴定。【结果】成功克隆了SVCV-P蛋白基因,该基因长度为933 bp。成功构建了原核重组表达质粒pET28-P,其诱导表达产物分子质量约为37 ku;表达的重组P蛋白可被SVCV阳性血清所识别。【结论】成功克隆了SVCV P蛋白基因,获得了分子质量约为37 ku的重组P蛋白。     

恩诺沙星对鲤酯酶同工酶和血清生理生化指标的影响

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和试剂盒等方法,对投喂不同剂量恩诺沙星和氯霉素的鲤Cyprinus carpio酯酶同工酶进行了电泳分析,同时对一些血清生理生化指标进行了测定。结果表明：恩诺沙星可使鲤酯酶同工酶的活性升高;所有投喂药饵的鱼血清总蛋白、白蛋白、白蛋白与球蛋白之比均下降,谷丙转氨酶、碱性磷酸酶、无机磷、非蛋白氮、肌酐呈上升趋势;高浓度药物对鲤的器官生理功能均有不同程度的影响,其中对肝胰脏、肾脏的影响较为明显。     

吡喹酮对鲤鱼感染台湾棘带吸虫后期囊幼虫的防治效果

[目的]探讨3种不同药物处理方式对台湾棘带吸虫引起的鲤鱼幼鱼急性鱼鳃传染病(开放性鳃病)的防治效果.[方法]在试验初期,将1620条鲤鱼幼鱼(70日龄)鱼鳃自然感染台湾棘带吸虫,随后分成4组,分别采用CuSO4、福尔马林和吡喹酮不同方式处理6周,与对照(自然喂食、不使用任何化学药剂)比较防治鲤鱼幼鱼急性鳃传染病的效果.[结果]感染台湾棘带吸虫的幼鱼生长缓慢,其身长和体重增长均较慢.施药后,幼鱼台湾棘带吸虫后期囊幼虫感染强度减少.在每千克饲料中分别添加50和75 mg吡喹酮喂食幼鱼5d,可以杀死鱼鳃中所有的台湾棘带吸虫后期囊幼虫,且鱼鳃恢复正常;面使用25 mg吡喹酮,仅有35%的后期囊幼虫死亡.所有不同浓度CuSO4处理(0.3、0.4和0.5mg/kg冲洗浸泡24 h及以3.0、4.0和5.0 mg/kg冲洗浸泡10m)和福尔马林处理(20、25和30 mg/kg冲洗浸泡及200、250和300 mg/kg短时间冲洗浸泡)均不能杀死台湾棘带吸虫后期囊幼虫.[结论]经普通化学药剂CuSO4或福尔马林冲洗浸泡,不能防治由台湾棘带吸虫后期囊幼虫引起的鲤鱼开放性鳃病,但50~75 mg吡喹酮/kg饲料可以在5d内治疗该病.     

猫传染性腹膜炎病毒AH1905株N基因的生物信息学分析及原核表达

为了解猫传染性腹膜炎病毒(feline infectious peritonitis virus, FIPV)在中国的流行与遗传变异情况,对新分离的FIPV AH1905株的N基因进行了克隆和序列比对分析,并利用生物信息学软件对N基因编码蛋白的二级结构进行了预测。最后,将N基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,在原核细胞中进行表达,并制备鼠源多克隆抗体。测序结果表明,FIPV AH1905株的N基因全长1 134 bp,编码377个氨基酸。序列比对分析结果显示,FIPV AH1905株与报道的FIPV参考毒株的核苷酸同源性为90.2%~92.4%,氨基酸同源性为91.8%~93.9%,与国内其他分离株位于同一进化分支,同属于FIPV基因Ⅰ型。对N蛋白二级结构预测结果显示,该蛋白具有高度亲水性,其二级结构主要由α螺旋(h)(14.06%)、延伸链(e)(15.12%)、β转角(t)(3.71%)和无规则卷曲(c)(67.11%)组成,无信号肽区域和跨膜结构域,存在48个潜在的磷酸化位点,含有6个潜在的B细胞抗原表位、2个CTL表位和2个Th表位。Western blot检测结果证明,N蛋白在大肠埃希菌细胞中主要以包涵体形式大量表达,相对分子质量约为68 ku,具有良好的反应原性。以上结果可为进一步开展FIPV的流行病学和分子生物学研究奠定基础。     

脆肉鲩与普通草鱼肌肉显微结构观察

【目的】观察对比脆肉鲩与普通草鱼肌肉显微结构的差异,为脆肉鲩的肉质加工提供科学依据。【方法】采集脆肉鲩和普通草鱼的背部白肌、背部红肌和腹部白肌,经石蜡组织切片和苏木素-伊红染色后,显微镜下观察肌纤维的形态特征,用肌纤维直径和密度两个指标衡量脆肉鲩与普通草鱼的肌纤维差异。【结果】脆肉鲩和普通草鱼背部白肌、腹部白肌及背部红肌的基本结构相同。脆肉鲩背部白肌的肌纤维直径（67．6μm）显著小于普通草鱼（109．4μm）（P〈0.05,下同）,肌纤维密度（249条／mm2）N显著大于普通草鱼（121条／mm2）;在腹部白肌和背部红肌的肌纤维直径、肌纤维密度方面,脆肉鲩与普通草鱼无显著差异（P〉0．05）。【结论】脆肉鲩肌肉的肌纤维直径及密度与其肌肉硬度具有一定相关性。