用PCR-差别筛选法分离和克隆水稻抗瘟性相关基因(英文)

以水稻抗瘟性近等基因系Ｈ７Ｒ和Ｈ７Ｓ为材料,采用ＰＣＲ－差别筛选（ＰＣＲｂａｓｅｄｄｉｆｅｒ－ｅｎｔｉａｌｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）的方法分离和克隆水稻受稻瘟病菌诱导的抗性相关基因．第一轮筛选获得４２个差异表达的ｃＤＮＡ克隆,经ＰＣＲ扩增,转膜,反向Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交后,得到１２个阳性ｃＤＮＡ克隆．本文对ＰＣＲ－差别筛选的优缺点以及进一步的鉴定工作亦作了讨论．     

大丽轮枝菌毒素诱导表达陆地棉cDNA序列的克隆与定位

 为获得陆地棉黄萎病抗性相关候选基因，利用棉花黄萎病菌大丽轮枝菌V991毒素粗提物诱导耐黄萎病陆地棉品种'中棉12'应激基因的表达。在诱导幼根24 h时间点提取总RNA，PCR法合成双链cDNA，应用抑制消减杂交技术[1]，得到了差异表达的180个克隆。经反Northern blot筛选出15个受毒素粗提物诱导应激表达的阳性cDNA克隆，将其命名为Vdrg（response gene induced by toxin of Verticillium dahliae）。本研究对所得阳性cDNA克隆进行了序列分析，并利用Pima S6 与 Acala Maxxa 海陆杂交四倍体棉花F2群体对Vdrg序列进行了棉花基因组定位。     

用PCR—差别筛选法分离和克隆水稻抗瘟性相关基因

以水稻抗瘟性近等基因系Ｈ７Ｒ和Ｈ７Ｓ为材料,采用ＰＣＲ－差别筛选的方法分离和克隆水稻受稻瘟病菌诱导的抗性相关基因。第一轮筛选获得４２个差异表达的ｃＤＮＡ克隆,经ＰＣＲ扩增,转膜,反向Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交后,得到了１２个阳性ｃＤＮＡ克隆。本对ＰＣＲ－差别筛选的优缺点以及进一步的鉴定工作亦作了讨论。     

水稻BWMK1互作基因的分离

为探明BWMK1介导的信号传导途径,采用酵母双杂交系统,构建水稻稻瘟病菌诱导后的cDNA文库,以BWMK1为诱饵,对文库进行筛选,通过验证、测序和基因编码分析,获得了7个BWMK1互作基因BWIP1～BWIP7,分别位于水稻基因组第12、2、3、10、6、4、5染色体上；7个互作基因中,除BWlP2和BWIP7未找到同...     

水稻NBS-LRR类抗稻瘟病蛋白Pik-h的互作蛋白筛选

【目的】利用酵母双杂交系统,以组成抗稻瘟病基因Pik-h介导的抗病反应途径。【方法】以含抗稻瘟病基因Pik-h的近等基因系IRBL8为材料,取稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)GD0193接种12和24 h后的水稻叶片,等量混合后提取总RNA,按照2个紧密连锁且功能独立的Pikh-1和Pikh-2蛋白为诱饵,在水稻叶片中筛选与之互作的蛋白,以便深入研究抗病基因Pik-h的酵母双杂交试剂盒（Make Your Own “Mate&Plate” Library System）的要求构建水稻叶片靶标cDNA文库。利用快速重组克隆的方法构建pGBKT7-Pikh1和pGBKT7-Pikh2诱饵载体,并分别将它们转化至酵母菌株Y2H Gold,提取细胞总蛋白后利用Western blot检测Pikh1和Pikh2的表达情况,并对这2个诱饵载体自激活和毒性分析后进行酵母双杂交筛选。提取SD/-Ade/-Leu/-Trp/ -His/X-α-Gal筛选平板培养基上呈蓝色的酵母单克隆的质粒,将其分别与对应的诱饵载体共转化酵母菌株Y2H Gold,涂布于筛选平板培养基上进行互作的重复验证,将通过重复验证的质粒测序分析所得的序列比对水稻基因组数据库以确定目的基因,并对这些基因进行gene ontology（GO）注释分析以确定其分子功能、生物过程及细胞组成。【结果】靶标cDNA文库的库容量约为2.2×10⁶,插入片段长度均大于400 bp,表明水稻cDNA文库质量高。诱饵载体pGBKT7-Pikh1和pGBKT7-Pikh2均能在酵母细胞中正确表达出对应的Pikh1及Pikh2蛋白,无自激活活性而且对酵母无毒性作用,符合文库筛选的要求。利用含有诱饵载体的酵母菌株Y2H Gold与靶标文库菌株Y187结合（Mating）的方式筛选,获得13个与Pikh-1相互作用的蛋白、5个与Pikh-2相互作用的蛋白,其中有2个与Pikh-1及Pikh-2同时存在相互作用。这些蛋白包括4个在逆境响应或激素信号转导过程中起到重要作用的（辅）转录因子、3个信号蛋白、4个参与光合作用的叶绿体蛋白、1个含有U-BOX结构域的蛋白及4个未知功能蛋白。【结论】成功构建了适宜于研究抗病基因（R基因）介导反应途径的酵母双杂交cDNA文库,筛选出Pik-h的互作蛋白,为进一步研究Pik-h或其他抗稻瘟病基因介导的抗病机制打下了基础。     

水稻纹枯病菌菌核形成过程中特异基因的表达与分析

以水稻纹枯病GD-118菌株菌丝形成期的mRNA为驱赶子(driver),以菌核形成期的mRNA为检测子(tester),采用抑制消减杂交(SSH)结合虚拟Northern杂交筛选,构建了水稻纹枯病菌菌核形成过程中特异表达产生的差减cDNA文库;进一步用PCR筛选显示克隆中插入的片段主要分布在200～500bp之间;随机挑取克隆应用虚拟Northern技术以菌丝、菌核cDNA为探针来验证消减有效性,经测序和同源性检测剔除重复序列之后,获得了从菌丝到菌核形成相关的28条特异表达的基因片段;所筛选的特异表达序列主要涉及胁迫响应、转录调控、信号传导、合成代谢等.这为进一步分析水稻纹枯病菌菌核形成过程的相关基因提供了科学线索.     

纹枯病菌诱导水稻表达的WRKY基因克隆及分析

[目的]克隆纹枯病菌诱导的水稻上调表达基因。[方法]对应用抑制差减杂交技术（SSH）获得的纹枯病菌诱导水稻表达的EST序列K16进行电子克隆,根据电子克隆产物设计引物进行RT—PCR、克隆测序,利用生物信息学技术对克隆产物进行功能预测。[结果]克隆出一个长度为1079bp的序列,结构功能分析显示该基因编码236个氨基酸的蛋白,存在多个功能位点,含有2个典型的WRKY结构域和1个C2H2锌指型结构,该基因与水稻WRKY8、WRKY24和WRKY30基因有较高的同源性。[结论]经电子克隆获得的纹枯病菌诱导表达的基因为典型的WRKY家族基因,该基因可能在水稻抗纹枯病中起重要作用。     

纹枯病菌诱导水稻表达的WRKY基因克隆及分析（摘要）

[目的]克隆纹枯病菌诱导的水稻上调表达基因。[方法]对应用抑制差减杂交技术（SSH）获得的纹枯病菌诱导水稻表达的EST序列K16进行电子克隆,根据电子克隆产物设计引物进行RT-PCR、克隆测序,利用生物信息学技术对克隆产物进行功能预测。[结果]克隆出一个长度为1079bp的序列,结构功能分析显示该基因编码236个氨基酸的蛋白,存在多个功能位点,含有2个典型的WRKY结构域和1个C2H2锌指型结构,该基因与水稻WRKY8、WRKY24和WRKY30基因有较高的同源性。[结论]经电子克隆获得的纹枯病菌诱导表达的基因为典型的WRKY家族基因,该基因可能在水稻抗纹枯病中起重要作用。     

水稻抗稻瘟病蛋白Pik2-H4基因的 克隆及互作蛋白的筛选

Pik2-H4 是从水稻高抗稻瘟病株系H4 中克隆的广谱型抗稻瘟病基因。Pik2-H4 基因的CDS 全长序列 3066 bp,与日本晴中的等位基因相比,其序列存在较大差异。Pik2-H4 属于NBS-LRR 类基因,其蛋白序列含有NBARC 结构域及富亮氨酸重复序列。采用酵母双杂交系统,以Pik2-H4 蛋白为诱饵从水稻cDNA 表达文库中钓取互作 蛋白质,并成功筛选到3 个与Pik2-H4 有相互作用的蛋白质（LOC-Os08g39300、LOC-Os03g25960、LOC-Os09g29130）。 本研究结果有助于进一步了解由Pik2-H4 介导的水稻抗稻瘟病反应机理。     

水稻CIPK基因家族的鉴定及OsCIPK5受稻瘟病菌诱导的qRT-PCR分析

【目的】植物通过启动一系列信号传导过程来应对外部环境,这些过程通常涉及多种蛋白激酶,包括钙调神经磷酸酶B样蛋白互作激酶(calcineurin B-like protein-interacting protein kinases, CIPKs)。为更加清晰全面地了解水稻CIPK基因家族,本研究根据最新的基因组测序数据对水稻基因组中的CIPKs进行了鉴定。【方法】通过探讨拟南芥和水稻中CIPKs蛋白家族的结构特点,结合生物信息学和qRT-PCR技术系统分析水稻中CIPKs家族蛋白的结构。结合转录组数据,比较了粳稻云引受稻瘟病菌诱导后的表达情况。【结果】根据最新的水稻基因组数据,鉴定出31个水稻OsCIPK基因。系统发育树分析结果表明,31个OsCIPK基因可分为5个亚家族,这些亚家族具有不同的外显子-内含子和UTR的结构特点。从广谱抗稻瘟病品种粳稻云引受稻瘟病菌诱导的基因表达谱的趋势聚类中筛选出了OsCIPK5基因并对其进行了表达分析,结果表明,云引中OsCIPK5基因受稻瘟病菌的诱导表达。【结论】内含子缺失和片段重复在水稻OsCIPK基因家族的扩展中起到重要作用,同时OsCIPK5受到稻瘟病菌的诱导表达。     

PCR-based screening of BAC clones of different chromosomes in Chinese cabbage

In this paper, taking SSR and functional gene sequence as the primers and the plasmid of first- and second-level pools of bacterial artificial chromosome (BAC) library as templates, the PCR method was used for specific clones of different chromosomes in Chinese cabbage. The results showed that the number of positive clones was 1?C11 per primer and the average number of clone was 3.9 by screening 19200 clones of BAC library using 12 pairs of SSR primers from 10 linkage groups individually, which were nearly consistent with about 3.4 times of genome coverage. Positive clones were acquired in chromosome Nos. 2 to 5 and 8 to 10 without screening with the positive clones in chromosome Nos. 1, 6, and 7. In addition, the primer of FLC1 functional gene of chromosome No. 10 was used for PCR screening, and two BAC clones containing FLC1 gene were acquired. Therefore, different specific BAC clones of chromosomes were taken by using SSR primer and functional gene primer. Specific clone screening of chromosomes could provide a probe for identifying the chromosome accurately. Meanwhile, the BAC library screening method was optimized, serving as an effective technical means for quick BAC clone screening.     

PCR快速筛选棉纤维cDNA文库分离全长cDNA序列

建立了一种利用PCR-96孔板法快速筛选棉纤维cDNA噬菌体文库,分离全长基因序列的技术体系．首先根据已知EST片段设计一至两对特异PCR引物,通过在96孔滴定板上逐级稀释cDNA文库,利用特异引物以及特异引物与通用引物组合逐级从cDNA文库中筛选目标克隆,最终可获得目标全长cDNA。     

鸡堆型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库的免疫学筛选

[目的]寻找鸡球虫保护性抗原基因,为研究基因功能和研制抗鸡球虫疫苗奠定基础.[方法]将纯化的堆型艾美耳球虫孢子化卵囊于兔皮内多点注射,制备堆型艾美耳球虫抗血清,用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测其效价,进行免疫学筛选.利用PCR对获得的阳性克隆进行初步鉴定.[结果]间接酶联免疫吸附试验结果表明堆型艾美耳球虫抗血清检测结果呈阳性,初步筛选到的疑似阳性斑经3次复筛后获得6个阳性克隆,1～3号克隆约为1 000bp,4～6号克隆约为1 500 bp.[结论]对堆型艾美耳球虫孢子化卵囊cD-NA文库获得的阳性克隆成功进行了免疫学筛选.     

甘蓝型油菜种子不同发育期基因差异表达cDNA文库构建

以授粉后27 d的种子mRNA为目标群体,授粉后7 d的种子mRNA为对照,构建甘蓝型油菜种子发育期基因差异表达文库.文库包括560个克隆,经菌落PCR检测,456个菌落含有插入片段,占全部克隆的91.2 %,片段大小200～600 bp.对PCR阳性克隆进行斑点杂交,得到201个上调的阳性斑点杂交阳性克隆,对其进行测序,得到有效ESTs序列198个.BLASTN结果显示,134个ESTs序列没有同源序列,可能是新基因,另外64个ESTs序列在油菜或拟南芥核酸数据库中存在同源序列.这64个ESTs序列和已知功能(主要是能量代谢、物质代谢、基因调控、衰老及抗性等)的蛋白有高度相似性.     

中国美利奴绵羊MHC ClassⅡb区349I12 BAC克隆插入片段基因组成与结构分析

利用已测序的中国美利奴绵羊细菌人工染色体(BAC)文库MHC区段阳性克隆插入片段制备探针,筛选中国美利奴绵羊(新疆军垦型)混合组织cDNA文库,以期获得该MHC片段的基因组成与结构信息。用中国美利奴绵羊MHC ClassⅡb区域内的349I12 BAC克隆,BsaJⅠ酶切后制备α-32P放射性探针,以噬菌斑原位杂交筛选正常中国美利奴绵羊cDNA文库,并将分离所得的cDNA阳性克隆测序后进行基因结构分析。以349I12 BAC克隆制备探针经过两轮的噬菌斑原位杂交筛选,获得19个cDNA阳性克隆,经测序、比对等进一步分析确定获得17条不同序列,其中7条序列与免疫相关。绵羊20号染色体上的MHC区段包含表达序列,且多为断裂基因,对其基因结构的分析将有助于相应基因功能及调控方面的研究。     

大规模筛选表达序列标签(ESTs)方法的改进

介绍一种改进的大规模ESTs筛选的方法。以SMARTTM cDNA Library Construction Kit所构建的毛冠鹿大脑cDNA文库为研究材料,基于该文库噬菌体可自发转化为质粒的特点,直接把噬菌体文库转化为质粒文库。随机选取平板中转化后的质粒cDNA文库克隆,振荡培养后运用菌液电泳的方法代替传统的PCR筛选法,对重组克隆进行筛选。改进的菌液电泳法可以准确鉴定出重组的质粒,并估计出插入片段的大小。该方法能更好地保持SMARTTM cDNA Library Construction Kit所构建文库的完整性,是一种简单、高效、适用于大规模表达序列标签筛选的有效方法。     

甜菜幼苗低温和长日照诱导表达基因的克隆和序列分析

 以代表性差异分析cDNA-RDA(representational difference analysis of cDNA)方法获得在低温和长日照诱导甜菜(Beta vulgaris L)幼苗茎尖中差异表达的基因片段DP3，并进行了cDNA的末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends），经RT-PCR 扩增和基因组DNA中PCR扩增，克隆测序后获得1个全长609 bp的cDNA和855 bp的DNA序列，分别命名为Ty7Br600 和Ty7Br900，并在GenBank注册，登录号分别为AY324115和AY324114。在GenBank中比较未发现同源序列，可能为新基因。序列分析发现，Ty7Br600具有1个编码136个氨基酸的开放读码框（ORF）, Ty7Br900序列中存在1个内含子。分别以克隆的低温诱导甜菜幼苗cDNA为探针，分别进行Northern印记和Southern印记杂交。结果表明，cDNA差异片段只在低温诱导的甜菜中表达，在甜菜基因组中以2个拷贝或低拷贝形式存在。     

琯溪蜜柚BAC文库的构建和汁胞粒化相关基因的筛选

【目的】构建琯溪蜜柚BAC文库,利用该文库筛选与汁胞粒化相关的基因。【方法】用温和的物理方法获得高分子量DNA,部分酶切后进行回收、连接、转化,超低温保存阳性克隆。构建DNA样品混合样,PCR法筛选文库,生物信息学分析DNA序列。【结果】改进了适合琯溪蜜柚BAC文库构建的方法;构建的琯溪蜜柚BAC文库含有26112个单克隆,空载率小于1%,叶绿体DNA的污染率不超过1%,插入片段平均大小大约120kb,覆盖8倍的琯溪蜜柚基因组。利用与琯溪蜜柚汁胞粒化相关的EST序列设计PCR引物筛选文库,得到一段大小为1088 bp的DNA序列,该序列含有两段大小分别为122bp和172bp的内含子,经同源比对发现,该序列中部分序列与蓖麻(Ricinus communis)、杨树(Populus trichocarpa)多铜氧化酶(multicopper oxidase)cDNA序列分别有85%和71%的同源性;与毛叶番荔枝(Annona cherimola)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)果胶酯酶(pectinesterase)cDNA序列分别有76%和73%的同源性。【结论】本研究构建的BAC文库适用于琯溪蜜柚功能基因组的研究,从BAC文库筛选获得的DNA序列与汁胞粒化相关的基因有高度同源性。     

藜CaMAPKK2的表达分析及盐胁迫信号通路互作组分的筛选

【目的】通过对抗逆植物藜的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联途径中MAPKK的胁迫表达模式分析及信号转导途径互作组分的筛选,探索植物藜响应外界胁迫信号诱发逆境耐受的机制。【方法】以藜叶片总RNA为模板,利用定量PCR方法对NaCl、H2O2和ABA胁迫下藜MAPKK表达规律进行了分析。利用RT-PCR结合RACE技术获得了藜MAPKK的全长cDNA序列。利用酵母双杂交技术对MAPKK盐胁迫信号通路互作组分进行了分析。【结果】获得一个藜MAPKK的全长cDNA序列,命名为CaMAPKK2,其开放阅读框为1 089 bp,编码一个由362个氨基酸组成的丝裂原活化蛋白激酶。定量PCR显示CaMAPKK2受盐胁迫诱导明显上调表达,同时受外源H2O2和ABA调控。H2O2合成抑制剂DPI与ABA合成抑制剂Na2WO4显著抑制了300 mmol•L-1 NaCl处理下CaMAPKK2的表达。以全长CaMAPKK2为诱饵蛋白,利用酵母双杂交技术筛选到5个可能与CaMAPKK2相互作用的蛋白。测序结果显示,其中1个序列可通读,该cDNA序列长794 bp,与欧洲赤杨（Alnus glutinosa）和拟南芥的噻唑合成酶（thiazole biosynthetic enzyme）基因AgTHI1和AtTHI1核酸序列相似度达79%和78%,其它4个序列没有连续的读码框。【结论】CaMAPKK2受NaCl和H2O2诱导上调表达,暗示盐胁迫可能通过诱导H2O2和ABA的积累从而导致CaMAPKK2表达增加。要进一步筛选CaMAPKK2互作组分需获得更多阳性克隆并开展相关功能验证试验。