用萤光抗体试验筛选能表达鸡马立克病病毒pp38基因的重组昆虫杆状病毒

用抗鸡马立克病病毒(MDV)的38Kd磷蛋白的单克隆抗体作萤光抗体试验,直接从用可转染性野生型杆状病毒AcMNPV株DNA与含MDVpp38基因的重组转基因质粒载体DNA共同转染的Sf 9单层细胞培养中筛选到能表达pp38基因产物的重组杆状病毒感染斑,并从保存于琼脂醣凝胶上的复印斑中收复并进一步克隆了该基因重组病毒.该法易于实施,即使未能熟练掌握根据杆状病毒多角体来区别野生型杆状病毒斑与基因重组病毒斑的技术,也可顺利地筛选到能表达目的基因的重组合病毒。     

含GFP-Lac Z基因的伪狂犬病病毒上海株缺失株的构建

在伪狂犬病病毒(PRV)上海株gI和gE基因克隆鉴定的基础上，用BamHⅠ BstpⅠ去掉gE基因的5′端363bp，在缺失位置插入绿色荧光蛋白(GFP)和Lac Z基因，构建含双报告基因的PRV-SH转移载体pgEI-GFPZ。将psEI-GFPZ转染PRV-SH的BHK-21细胞，待出现80％病变后收获病毒，并以蚀斑法得到纯化的含Lac Z和GFP两种筛选标记的缺失了gE／gI的重组病毒株。     

甘蔗S-腺苷蛋氨酸脱羧酶基因Sc-SAMDC的克隆和表达分析

【目的】克隆甘蔗(Saccharum officinarum)S-腺苷蛋氨酸脱羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase,SAMDC)基因,并进行序列特征、原核表达和不同逆境胁迫下表达特性分析。【方法】通过对甘蔗茎全长cDNA文库测序和分析,获得SAMDC基因cDNA全长,命名为Sc-SAMDC,并进行序列分析。随后将编码S-腺苷蛋氨酸脱羧酶的cDNA片段克隆到原核表达载体pET29a(+)中,构建融合表达质粒,转化至Esherichia coli BL21(DE3)中进行表达。最后利用定量PCR技术分析甘蔗幼苗中该基因在不同外源胁迫下的表达特性。【结果】序列分析显示,甘蔗Sc-SAMDC基因(GenBank Accession number:GQ246459)cDNA全长1968bp,存在3个读码框(袖珍读码框tORF、上游读码框uORF和主读码框mORF),mORF长1200bp,编码399个氨基酸的SAMDC酶原,预测分子量为43.6kD,该酶原含有两个高度保守的功能结构域(酶原剪切位点和PEST结构域)。原核表达产物经SDS-PAGE表明,Sc-SAMDC以融合蛋白形式表达,相对分子量约为50kD。定量PCR分析表明,Sc-SAMDC基因在聚乙二醇(PEG)、NaCl、水杨酸(SA)和H2O2外源胁迫下表达特性不同,受PEG和NaCl的诱导,受SA和H2O2的抑制。【结论】本研究成功地克隆了Sc-SAMDC基因并在原核生物中进行了表达研究,分析了该基因的表达特性,为其进一步的生物学功能研究及其应用奠定了基础。     

中介蝮蛇毒纤溶酶基因克隆及生物信息学分析

克隆中介蝮蛇(Gloydius intermedius)纤维溶解酶(Fibrinolytic enzyme,FLE)基因,分析其基因序列并对该基因的功能进行分析.从中介蝮蛇毒腺细胞中提取总RNA,通过RT-PCR法扩增纤溶酶基因,与pMD18-T载体连接进行TA克隆,再进行序列的测定并且对该序列进行分析.扩增得到完整开放读码框在内的长为777 bp的纤溶酶基因序列.成功克隆了编码中介蝮蛇纤溶酶的基因序列,推导其编码的氨基酸序列.开放读码框编码258个氨基酸,含有大量疏水氨基酸.其中,前1～19位氨基酸编码信号肽;根据同源性推测,以His65、Asp110和Ser204组成纤溶酶的活性中心并高度保守;序列内合12个Cys.两两配对结合成的6个二硫键对纤溶酶的高级构型和稳定性至关重要.成功克隆中介蝮蛇毒纤溶酶基因为进一步研究该基因的遗传特征以及为该酶在原核及真核生物中的表达研究提供依据.     

柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)BJ株SO7基因的克隆和序列分析

对柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)BJ 株 SO7基因进行了克隆和测序分析。以纯化的 E.tenella BJ 株7h 孢子化卵囊的总 RNA 为模板,应用 RNA 反转录酶(M-MLV)合成 cDNA,再用 Taq DNA 聚合酶进行PCR 扩增出 BJ 株 SO7基因.用常规基因克隆方法把 BJ 株 SO7基因插入 pGEM-T 克隆载体,选取正方向插入子的一个阳性克隆进行酶切分析及插入片段的全序列测序分析。结果表明:该序列全长862个核苷酸,有一个开放性读框(65～713nt),可编码216个氨基酸(22.4kD)。SO7-BJ 与国外株 SO7比较,同源性为99%,突变的8个核苷酸中,4个为有义突变.开放性读框中有仅2个核苷酸突变,其中1个为有义突变,使推测氨基酸 Cly 变为 Cys。     

亚麻纤维素合酶LuCesA8基因克隆与表达分析

以亚麻快速生长期茎部组织总RNA为模板,通过反转录PCR克隆纤维素合酶基因Lu Ce s A8(基因ID:Lus10029245)全长开放读码框序列。序列分析结果表明,开放读码框全长2 967 bp,共编码988个氨基酸。通过多氨基酸序列比对发现,该蛋白与麻风树Ces A8蛋白亲缘关系最近,相似度达87%,与胡杨、可可树、雷蒙德氏棉及芝麻Ces A8蛋白氨基酸序列相似性分别为86%、85%、85%、81%。荧光定量PCR结果表明,该基因在亚麻不同发育阶段表达水平存在显著差异,快速生长期表达量最高,花期和绿熟期次之,苗期最低。研究为揭示Lu Ce s A8基因在次生细胞壁纤维素合成中的作用奠定基础。     

以精子作载体实现鸡转基因首例获得成功

由于鸡胚的发育特性,它的转基因技术已成为当前动物基因工程的一个难题,尽管应用REV作载体实现鸡的转基因已有报道,但这种病毒可能产生的潜在危险迫使人们另辟新路.最近,江苏农学院哺乳动物个体表达系统研究组,在采得鸡的精液后,把精子和鸡马立克氏病毒的pp38kd磷蛋白基因(MDV-38kdpp)混     

二色补血草LbARP基因的克隆及其表达分析

从二色补血草(Limonium bicolor)cDNA文库中分离出一个生长素抑制蛋白基因LbARP(GenBank登录号为KF886022).该基因全长698 bp,含有3个外显子和2个内含子,开放读码框(ORF)387 bp,共编码128个氨基酸,推测蛋白质分子量为13.84 kDa,理论等电点为9.69.多序列比对结果显示,该基因编码的氨基酸序列与其他植物的ARP蛋白序列相似性达到50％以上,具有生长素抑制基因家族的保守结构域.荧光定量PCR结果表明,LbARP基因能够对NaCl、ABA、CuSO4、CdCl2及ZnCl2等非生物胁迫作出应答.     

猪肝脏组织表达序列标签(ESTs)的初步分析

 构建了猪肝脏组织cDNA文库 ,并对文库中随机挑选的 4 38个克隆的表达序列标签 (ESTs)进行了研究。结果表明 ,在所研究的 4 38个ESTs中 ,186个在猪种中已有匹配序列 ,37个在人类及其它物种中可以找到同源序列 ,2 15个为未知功能基因。试验还测定了文库中 4 5个cDNA克隆的全长插入序列 ,结果表明 ,19个为已知功能基因 ,11个没有发现开放阅读框 ,其它 15个具有开放阅读框 ,但基因的功能未知。这些结果初步代表了肝脏组织的功能基因表达谱。     

小菜蛾p38 MAPK基因的克隆与生物信息学分析

小菜蛾(Plutella xylostella L.)是一种危害十字花科植物的世界性害虫,研究其基因功能为寻找新的小菜蛾防治方法具有重要意义。本研究克隆了小菜蛾p38 MAPK基因的开放阅读框(ORF),并根据其DNA序列推导出了蛋白一级结构,发现该基因编码一个含有349个氨基酸残基的蛋白。通过SMART网站分析发现该蛋白在第20~304位氨基酸残基区域存在着一个典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域,说明它是一个潜在的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。Blast比对发现Pxp38基因与家蚕Bmp38基因、酿酒酵母ScHOG1基因、人类Homo sapiens p38基因在蛋白一级结构上的相似性分别是91.7%、51.6%和78.6%,说明p38 MAPK基因在进化上具有较高的保守性。     

马立克氏病病毒p79抗原基因在大肠杆菌中的表达特性分析

马立克氏病病毒（ＭＤＶ）的７９ｋｄ蛋白质是该属３个血清型所共有的抗原．用能表达该蛋白质片段的重组噬菌体Ｌａｍｂｄａｇｔ１１克降ＧＢ－２在宿主菌大肠杆萌Ｙ１０９０菌株中表达该蛋白，免疫转印试验中的确产生了能为对７９ｋｄ蛋白质的单克隆抗体Ｔ８１所识别的表达产物。表达过程中，不论加入或不加蛋白分解酶抑制剂，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ中均未显示分子量大于β－半乳糠甘酶的融合蛋白的存在，而是产生了能为单克隆抗体Ｔ８１识别的分子量分别约为５０ｋｄ，３０ｋｄ，２６ｋｄ的３条多肽，用从凝胶中回收的这３条多肽混合物免疫的小鼠血清，在１：４稀释时，与ＭＤＶ感染的ＤＥＦ细胞在免疫荧光反应中呈阳性反应。此外，用抗β－半乳糖甘酶免疫亲和层析柱杜所得到的提纯蛋白质也不被单克隆抗体Ｔ８１所识别．用和不用ＩＰＴＧ诱导的对照试验表明，在该ＧＢ－２克隆中的ＭＤＶｐ７９基因的表达与Ｌａｍｂｄａｇｔ１１表达外源基因的通常方式不同，不需要ＰＴＧ诱导，而是呈现结构性表达的特征，暗示该蛋白质基因的表达并不使用β－半乳糖苷酶基因启动子。     

Molecular Comparisons of Marek＇s disease virus strains of different pathotypes for their gⅠ, gE, pp38 and meq genes

Five to ten serotype I Marek‘ s disease virus (MDV1) strains of different pathotypes were compared for their DNA sequences of gⅠ, gE, pp38 and meq genes. The reference strains were vMDV GA and JM, vvMDV RB1B and Mdll(pl6), vv MDV strains 648A and 584A, vaccine strain CVI988/Rispens; Chinese strains were: v MDV strain N, vvMDV strain G2, vaccine strain 814. Only random aa changes were found in 12 positions within gE of 497 aa among 10 analyzed strains and in 10 positions within gⅠ of 355 aa among 5 strains. There was no relationship found between virus pathotypes and aa changes of both glycoproteins. The aa changes happened in 14 positions within meq of 339 aa among 5 compared strains. But a proline deletion at aa # 194 in a proline- rich domain of meq were shared by two vaccine strains CVI988/Rispens and 814, the latter was a non - pathogenic vaccine strain of serotype 1 isolated in 1983 in China. In another hand, vv MDV strains 648A demonstrated 5 unique aa changes and 4 of them also located in the proline - rich region. The pp38 was very conservative among sequenced 10 strains, there were only two positions at # 107 and # 109 with an altered in its 290 aa. All tested MDV1 strains had glufamine at # 107, instead, only vaccine CVI988 had arginine at the position and lost its epitope reactive with Mab H19, to which all ether tested MDV1 strains were positive. However, CVI988 and vMDV GA shared a Mab T65 - recognized epitope when there was glyeine at aa # 109. It was glutamie acid at aa # 109 in all other MDV1 strains which were not reactive with Mab T65. It seems like that there is some relationship between pathotypes and sequences of pp38 and meq, but more strains need to be compared.     

亲和层析法提纯鸡马立克病毒gB基因重组产物

应用针对鸡马立克病毒（ＭＤＶ）糖蛋白Ｂ（ｇＢ）抗原单克隆抗体ＩＡＮ８６制备亲和层析柱，从感染重组杆状病毒（ｇＢ－ＡｃＮＰＶ）的昆虫细胞中提纯鸡ＭＤＶｇＢ基因重组产物，获得较好效果。提纯的蛋白质在ＳＤＳ－ｐＡＧＥ中出现的５条条带中有４条在免疫印迹试验中出现，其分子量为１００，６０，４９，４０ｋｄ占蛋白总量的５４．７％。试验证明用单克隆抗体亲和层析法提纯ＭＤＶｇＢ基因重组产物是一个行之有效的方法。     

表达禽流感病毒核蛋白基因重组禽痘病毒的构建及其免疫保护性研究

 从含有禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96 (H5N1)核蛋白 (NP)基因的质粒pUCNP中切下NP基因片段 ,将其亚克隆到pSY5 38质粒 ,再将带有痘苗病毒启动子P11的LacZ基因也平端克隆到pSY5 38质粒 ,然后切下同时含有NP及LacZ基因的片段 ,再亚克隆到禽痘病毒载体pSY6 81,从而构建出表达核蛋白基因的重组禽痘病毒转移载体pSY(NP +LacZ)。应用脂质体介导的方法将转移载体转染已感染禽痘病毒S FPV 0 17的鸡胚成纤维细胞 ,在X gal存在的条件下 ,利用蓝白斑筛选、数轮蚀斑纯化以及PCR、Western blot鉴定 ,结果证明 ,获得了能高效表达AIVNP蛋白的重组禽痘病毒rFPV NP。SPF鸡体内的免疫保护试验结果表明 ,它能够诱导机体产生较高水平的NP特异性抗体 ,并对H5N1和H7N1这 2种亚型高致病力禽流感病毒的攻击提供一定的保护。     

马立克氏病鸡MDV血清基因的克隆与鉴定

[目的]克隆马立克氏病鸡MDV血清基因,并对其进行鉴定。[方法]从潜伏期感染马立克氏病鸡淋巴组织中提取基因组DNA,采用梯度PCR扩增马立克氏病毒的L-meq基因。将其插入pMD18-T克隆载体并进行测序,并用DNAman软件进行序列分析。[结果]获得的DNA片段的序列与已发表的L-meq基因序列相一致,表明该试验成功获得了目的基因。[结论]该研究可为鸡马立克氏病的预防与治疗提供新思路和新方法。     

茶蚕颗粒体病毒AcMNPVORF38同源基因的克隆及序列分析

[目的]为利用昆虫病毒更好地防治害虫和进行分子生物学研究。[方法]从感病茶蚕幼虫的尸体中提取颗粒体病毒DNA后,进行酶切、克隆、测序和序列分析。[结果]成功克隆了茶蚕颗粒体病毒基因组中一个1 484 bp的片段。该片段含有1个完整的开放阅读框(ORF)和2个不完整ORF。完整ORF为666 bp,有典型Nudix结构域,其编码1个与苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒AcMNPV的ORF38高度同源的基因,定名为AcORF38同源基因。2个不完整ORF分别编码p47蛋白基因的C-端和p24基因的N-端。[结论]茶蚕颗粒体病毒与卷蛾科宿主中颗粒体病毒亲源关系较近,而与夜蛾科宿主昆虫中颗粒体病毒较远。AcORF38同源基因与编码NTP焦磷酸水解酶的基因高度同源,可能与病毒的复制和DNA损伤的修复过程相关,也可能与入侵寄主的过程相关。     

重组鸭瘟病毒载体中筛选高效表达鸭坦布苏病毒E蛋白启动子

【背景】鸭瘟和鸭坦布苏病毒是鸭的两种重要传染病,鸭瘟属于疱疹病毒科,具有开发成病毒载体的优势。为了优化鸭坦布苏病毒E基因在重组鸭瘟病毒载体中的表达,之前探讨了不同形式鸭坦布苏病毒E蛋白在重组鸭瘟病毒载体中的表达,发现以鸭为宿主进行密码子优化的E基因C端截短形式（E451-dk,简称为Es）表达量最高。【目的】探讨不同启动子对Es 在重组鸭瘟病毒载体中表达的影响,为鸭瘟病毒—坦布苏病毒二联苗的研制奠定基础。【方法】将pCAG、 pSV40、pRSV、p1.8k(MDV)和pgB(MDV)启动子通过常规基因克隆的方法替换转移载体pEP-BGH-Es中的pCMV启动子,构建不同启动子调控Es表达的重组表达框pro-Es-BGH-pA。在鸭瘟病毒（DEV）疫苗株细菌人工染色体克隆pDEV-EF1的基础上,将5个重组表达框分别通过“Red E/T两步重组”克隆至pDEV-EF1突变体的US7和US8基因之间,构建了携带不同启动子调控的Es突变体克隆pDEV-pro-Es。用磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞（CEFs）拯救获得相应重组病毒rDEV-pro-Es,并对重组病毒感染细胞蚀斑大小和Es蛋白表达情况进行测定。【结果】将重组突变体克隆转染细胞拯救获得了5株重组病毒rDEV-pro-Es。Western blotting分析表明外源蛋白Es在 pRSV调控下表达量最高,其表达量较rDEV-Es提高了169.12%。【结论】完成了Es在重组鸭瘟病毒载体中高效表达启动子的筛选,获得了一种调控Es高效表达的启动子pRSV。同时也获得了一株高效表达鸭坦布苏病毒外源基因Es的重组鸭瘟病毒rDEV-pRSV-Es。     

表达NDV F48E9株F基因的MDV CVI988株转移质粒载体的构建

将新城疫病毒(NDV)F48E9株融合蛋白(F)基因1700bp克隆到真核表达载体pIRES中,构建成表达F基因的载体pIRESF,然后将包含F基因及其上游的内含子和下游的polyA的2900bpDNA片段再克隆入包含gB启动子的SK载体中,并使其克隆到gB启动子600bp的下游,最后将包含gB启动子和F基因表达盒3500bp克隆到包含MDVCVI988非必须片段US10的载体SK中。该研究为进一步在细胞中转染并获得表达F基因的MDVCVI988重组病毒奠定了基础。     

A novel gene of HIV-1, vpu, and its 16-kilodalton product

A 16-kilodalton protein expressed in cells producing the human immunodeficiency virus (HIV-1) was identified as the gene product of the vpu open reading frame. When expressed in vitro, the 81-amino acid vpu protein reacted with about one-third of the serum samples from AIDS patients that were tested, indicating that the vpu open reading frame is expressed in vivo as well. Introduction of a frame-shift mutation into the vpu open reading frame did not significantly interfere with expression of the major viral proteins in a transient expression system. However, a five- to tenfold reduction in progeny virions was observed after the infection of T lymphocytes with the mutant virus. These data suggest that the vpu gene product is required for efficient virus replication and may have a role in assembly or maturation of progeny virions.