鸡传染性喉气管炎病毒河南株gB基因真核表达载体的构建及表达

根据已发表的传染性喉气管炎病毒(ILTV)gB基因序列,设计并合成1对引物,以河南分离株(ILTV-HN)接种10日龄鸡胚,从含痘斑的绒毛尿囊膜中提取基因组DNA扩增gB基因,将扩增片段克隆入pGEM-T Easy载体后,经蓝白斑筛选,菌液PCR和酶切鉴定为阳性的重组菌进行测序,结果表明克隆到ILTV-HN株gB基因,全长为2 629 bp,包含一个完整的开放阅读框.然后将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达载体pcDNA3.1-gB,转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过RT-PCR检测,转染细胞中含gB基因的mRNA,间接免疫荧光检测,结果表明gB基因在CEF细胞中进行了瞬时表达.     

含NDV F48E9株F基因的MDV CVI988株转移质粒载体的真核表达

为进一步提高重组病毒的表达水平,用构建的含gB启动子和NDV F48E9株F基因的MDV CVI988株转移质粒载体pUS10F转染293T细胞,通过PCR和接免疫荧光(IFA)法研究了其在真核中的表达,并确定最佳的转染条件。结果表明,真核细胞中带有F基因,转移质粒载体已经进入细胞DNA;转染转移质粒载体 pUS10F后的293 T细胞所表达的NDV F基因产物抗原性较好,能够与抗NDV的标准血清反应。确定的最佳转染条件为:DNA 3μg／mL,转染后48 h外源基因在细胞中的表达量最高,在6孔板和96孔板中细胞数量分别以 2×105／孔和1×101／孔的转染效果最好。     

犬瘟热病毒F蛋白基因片段的克隆与表达及其表达产物抗原性的初步鉴定

本研究采用RT-PCR法扩增出犬瘟热病毒标准疫苗株的融合蛋白基因(F基因)片段约1499 bp,克隆到pMD18-T载体,酶切鉴定后用一对特异性的引物扩增约732 bp的F蛋白基因片段。并把该基因定向克隆到原核表达载体pET-28a( )中,转化到宿主菌BL21(DE3)后进行了表达并纯化了该表达产物,Western印迹显示表达产物有良好的抗原性。     

白菜型油菜BrDAD1基因的克隆及其植物反义载体的构建

应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增了白菜型油菜BrDAD1基因及自身的启动子基因Pro-DAD1,并将其分别克隆到pMD18-Tvector载体上,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并测定了该基因及启动子全序列。结果表明,该基因及启动子全长分别为1 270 bp与1 335 bp。将白菜型油菜BrDAD1基因反向克隆到植物表达载体pCambia 1300的自身启动子基因Pro-DAD1启动子下游,构建了该基因的植物反义表达载体pCamDAD1。     

鹅源新城疫病毒F和HN基因的表达及功能鉴定

鹅源新城疫病毒的F和HN基因经RT-PCR方法从尿囊液中扩增后分别克隆进pCR2．1载体,再分别亚克隆到真核表达载体pCI-neo上,构建了F基因的表达载体(pCI-F)和HN基因的表达载体(pCI-HN)。间接免疫荧光(IFA)鉴定结果表明:F和HN基因均能在细胞中得到较好的表达;将pCI-F和pCI-HN共转染CEF和COS细胞,转染的细胞中能形成明显的合胞体。而用pCI-F单独进行转染时,不能产生合胞体,说明F蛋白要发挥其融合作用必须要有HN蛋白的参与,同时也进一步证明F和HN蛋白与病毒的融合特性密切相关。     

犬瘟热病毒水貂分离株F基因真核表达载体的构建与表达

为了构建犬瘟热病毒F基因真核表达载体,利用RT-PCR方法扩增出水貂源犬瘟热病毒分离株的F基因,将其克隆至pMD-18T载体上,用BamHⅠ和KpnⅠ进行双酶切,回收目的基因。将目的基因亚克隆至pcD-NA3.1(+)中,获得真核重组质粒pcDNA3.1-CDVF。通过脂质体介导法将pcDNA3.1-CDVF转染至BHK-21细胞中,并利用间接免疫荧光试验和RT-PCR法检测pcDNA3.1-CDVF在BHK-21细胞中的表达情况。结果表明,真核重组表达质粒pcDNA3.1-CDVF构建成功,F基因可在BHK-21细胞中表达。     

IBDV超强毒HZ株VP2基因的克隆和真核表达质粒的构建

利用反转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR) ,扩增克隆传染性法氏囊病病毒超强毒 (vv IBDV) HZ株 VP2基因 ,并对 VP2基因进行全序列测定、序列分析和聚类分析 ,同时将VP2基因与真核表达载体 pc DNA3相连接。结果克隆到 VP2基因全序列长 1 356bp,分析表明 HZ株与欧洲超强毒株 UK661高度相似 ,同时将 VP2基因正向插入 pc DNA3的 CMV启动子下游 ,得到了 VP2基因的真核表达质粒。为 IBDV分子流行病学和基因工程疫苗的研究奠定了物质基础     

传染性喉气管炎病毒河南株gB基因的克隆与序列分析

根据传染性喉气管炎病毒(ILTV)gB基因的核苷酸序列,设计、合成1对引物,应用PCR扩增鸡ILTV河南株(ILTV-CG)gB基因.将扩增片段克隆入pGEM-T Easy载体后,经蓝白斑筛选,菌液PCR和酶切鉴定为阳性的重组菌进行测序.结果表明克隆到ILTV-CG株gB基因,全长为2 629 bp,包含一个完整的开放阅读框,共编码873个氨基酸的多肽,推导氨基酸序列有8个潜在的N-糖基化位点,有12个与二硫键形成有关的半胱氨酸.序列分析表明,ILTV-CG株gB基因与GenBank中读取的澳大利亚SA2疫苗株、辽宁疫苗株、烟台株、美国632强毒株、英国Throne强毒株gB基因核苷酸序列同源性为99%以上,与ILTV-SA2株gB基因比较发现,ILTV-CG株gB基因核苷酸序列在第89位均缺失1个碱基G,而在第102位又插入1个碱基A,从而引起该毒株gB基因推导的氨基酸序列中第28～32位5个氨基酸的移码突变.     

传染性喉气管炎病毒河南株gB基因的克隆、序列分析及其真核表达载体的构建

【目的】构建传染性喉气管炎病毒(ILTV)的真核表达载体。【方法】从传染性喉气管炎病毒河南株(ILTV-XY)感染的鸡胚绒毛尿囊膜中提取病毒DNA,进行PCR扩增,PCR产物进行T-A克隆与测序,获得了鸡IL-TV-XYgB全基因序列;对ILTV-XY株gB基因与GenBank中读取的5株ILTVgB基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行了比较分析;并将该基因片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,对构建的重组质粒pcDNA3.1/gB进行酶切、测序鉴定。【结果】序列测定表明,gB全基因核苷酸长度为2 629 bp,编码873个氨基酸,推导氨基酸序列有8个潜在的N-糖基化位点,有12个与二硫键形成有关的半胱氨酸。与GenBank中读取的澳大利亚SA2疫苗株、辽宁疫苗株、烟台株、美国632强毒株、英国Throne强毒株gB基因进行比较,核苷酸序列同源性为99%以上,与ILTV-SA2株gB基因比较发现,ILTV-XY株gB基因核苷酸序列在第89位均缺失1个碱基G,而在第102位又都插入1个碱基A,从而引起该毒株gB基因推导的氨基酸序列中第28~32位5个氨基酸的移码突变。构建的重组质粒pcD-NA3.1/gB经酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确。【结论】成功构建了ILTV的真核表达质粒pcDNA3.1/gB,为ILTV核酸疫苗的研究奠定了基础。     

重组马立克病病毒CVI988/Rispens的构建

根据Ⅰ型马立克病病毒（MDV）强毒GA株基因序列,设计两对引物,用PCR方法扩增出CV1988／Rispens株的US10及其侧翼序列,分别克隆入pUC18载体中。经测序检测正确后,进一步插入含CMV启动子的绿色荧光蛋白（EGFP）基因表达盒,获得了含EGFP报告基因的转移载体质粒pPUC18-US10-EGFP。通过同源重组,成功地筛选出表达EGFP的重组病毒rCV1988-EGFP,经传代证明重组rCV1988-EGFP在感染的CEF细胞中能稳定表达EGFP。结果表明：构建的重组转移载体质粒正确,US10是MDV复制非必需片段,为进一步利用US10区构建重组MDV多价基因工程疫苗奠定了基础。     

含E.coli F因子的马立克氏病病毒1型（MDV1）转移载体的构建及初步应用

【目的】为了构建MDV1细菌人工染色体，以便快速有效地进行重组病毒的筛选，进行了含E.coli F因子的马立克氏病病毒1型（MDV1）转移载体的构建。【方法】利用DNA重组技术，构建了含有E.coli F因子的马立克氏病病毒1型（MDV1）转移载体，利用脂质体，将线性化的转移载体转染入已感染CVI988病毒的CEF，用MX-HAT药物筛选3代以后，用X-gal染色,挑取阳性克隆。【结果】经测序分析发现，人工体外合成的单一loxP位点，序列正确，另外，同源重组左臂和右臂序列正确，并且相对连接。利用SphⅠ和NheⅠ双酶切，鉴定出含有同向LoxP位点的转移载体，将其命名为pUS-BGS。将该载体用NheⅠ线性化后，用脂质体转染已感染CVI988病毒的CEF，用MX-HAT药物筛选3代以后，X-gal染色，可以观察到呈现蓝色的重组病毒。【结论】本研究报道了含有E.coli F因子以及两同向的loxP位点的MDV1转移载体的构建，利用该载体可以有效地进行重组病毒的筛选，为下一步MDV1细菌人工染色体的构建奠定了基础。     

MDV CVI988/Rispens弱毒株VP22基因克隆和序列分析

血清I型马立克氏病病毒(MDV-1)的UL49h基因编码病毒被膜蛋白VP22在病毒的复制和传播过程中具有非常重要的作用.根据已发表的MDV-1 GA株的序列,从CVI988/Rispens弱毒株感染的鸭胚成纤维细胞中扩增VP22基因片段,结果获得大小为732 bp的PCR产物.将PCR产物克隆T载体并测序分析,结果发现,与经典强毒GA株相比,弱毒株CVI988的VP22存在3个定点突变和一个缺失性突变.缺失的位点亲水性强,并位于VP22主要的抗原决定簇区.结果证明强毒株与弱毒株的VP22存在明显差异,为利用CVI988 VP22的蛋白传导域传导目的蛋白奠定了理论基础.     

含E.coli F因子的马立克氏病病毒1型（MDVI）转移载体的构建及初步应用

【目的】为了构建MDVI细菌人工染色体，以便快速有效地进行重组病毒的筛选，进行了含EcoliF因子的马立克氏病病毒I型（MDVI）转移载体的构建。【方法】利用DNA重组技术，构建了含有EcoliF因子的马立克氏病病毒I型（MDVI）转移载体，利用脂质体，将线性化的转移载体转染入已感染CVI988病毒的CEF，用Mx—HAT药物筛选3代以后，用x—gal染色，挑取阳性克隆。【结果】经测序分析发现，人工体外合成的单一loxP位点，序列正确，另外，同源重组左臂和右臂序列正确，并且相对连接。利用SphI和NheI双酶切，鉴定出含有同向LoxP位点的转移载体，将其命名为pUS—BGS。将该载体用NheI线性化后，用脂质体转染已感染cVI988病毒的CEF，用MX—HAT药物筛选3代以后，x—gaI染色，可以观察到呈现蓝色的重组病毒。【结论】本研究报道了含有Ecol／F因子以及两同向的loxP位点的MDVI转移载体的构建，利用该载体可以有效地进行重组病毒的筛选，为下一步MDVI细菌人工染色体的构建奠定了基础。     

Ⅰ型马立克氏病强弱毒株Meq基因的克隆与序列分析

[目的]为获得MDV-1强弱毒株Meq基因序列的差异。[方法]根据GENE BANK登录的马立克氏病毒Meq基因序列,设计一对引物,采用PcR技术对MDV—Ⅰ型国内商用CVI988／Rispens疫苗株和参考强毒京-1（BJ-1）株的Meq基因进行了扩增,并将扩增产物提纯后克隆到pcDNA3．1（＋）上,进行酶切鉴定及测序验证。[结果]CVI988疫苗株和BJ-1强毒株的Meq基因开放阅读框（ORF）长度分别为1200和1197bp。通过与国际标准强毒GA株Meq基因进行比较,BJ-1株和CVI988株Meq基因中分别有一段180和177bp的插入序列,第211住核苷酸由G变为T,导致第71位氨基酸由丙氨酸A变为丝氨酸S;同时,CVI988株Meq基因第228位核苷酸由A变为G,导致第77位氨基酸由赖氨酸K变为谷氨酸E。此外,与BJ-1株相比,CVI988株Meq基因在576～578bp之间缺失3个碱基（ACC）,并导致第193位脯氨酸P的缺失,该突变发生在一个多脯氨酸重复区域内。[结论]MDV-1强弱毒株Meq基因序列存在明显差异,为从其分子水平进行区分及生物学功能的研究奠定了基础。     

油菜PEP基因的克隆及PEP反义基因的构建

丙酮酸羧化酶（ Ｐ Ｅ Ｐ）是控制油菜蛋白质／油脂含量比例的一个关键酶⒚本研究用 Ｐ Ｃ Ｒ 法扩增出了 Ｐ Ｅ Ｐ 基因片段,并将其 克隆到 ｐ Ｂ Ｓ Ｓ Ｋ＋ 的 Ｓｍ ａ Ⅰ位点⒚ Ｄ Ｎ Ａ 序列分析表 明克隆片段 的长度为 ５３０ｂｐ,其序列与报道序列相同⒚将该 Ｐ Ｅ Ｐ基因 片段反向插入 ｐ Ｉ Ｇ１２１ 质粒,构建了带 Ｐ Ｅ Ｐ 反义基因的超级双元载体并进行油菜的转化,目前已获得转基因植株⒚     

鸡新城疫病毒F蛋白部分表位基因的克隆表达及其免疫反应性

为研究NDV-F蛋白抗原表位在动物免疫应答中的作用特点,作者克隆和表达了NDV-F蛋白基因的部分片段,并检测其免疫反应性.首先根据F基因和载体pGEX-4T-1的多克隆位点自行设计了1对引物,以已克隆的NDV(F48E9株)的F基因为模板,通过PCR扩增获得长度为594 bp的片段.接着在电泳和酶切鉴定后将其定向插入pGEX-4T-1,构建重组质粒pGEX-4T-1-F594,并经PCR、双酶切及测序鉴定后,进一步将其转化到大肠杆菌BL21中.最后用IPTG诱导表达,提取物用SDS-PAGE和Western-blotting分析.结果表明,该基因片段表达的融合蛋白大小约为46 000,以包涵体形式存在,并具有良好的免疫反应性.     

一株鸡新城疫病毒的分离与鉴定

从广东某发病鸡场分离鉴定出1株鸡新城疫病毒,采用RT-PCR法扩增出包括裂解位点在内的部分F基因,对其进行序列测定后与GenBank中的毒株进行比较。结果表明：所克隆片断长度为463bp;F基因的裂解位点序列为112R-R-Q-K-R-F117,并且第101位为K（赖氨酸）,121位为V（缬氨酸）,具有基因Ⅶ型副粘病毒强毒株的特征序列;分离株与Lasota株同源性为81.2%,与我国标准强毒F48E9的同源性只有82.4%,表明该基因已经发生了变化。     

新城疫病毒F基因重组噬菌体的构建及其免疫原性

 用PCR方法扩增不含信号序列、长度为1 566 bp、编码522个氨基酸的新城疫病毒(NDV)F基因片段，将其克隆至pR质粒获得重组质粒pR-F，以此转化大肠杆菌E2，用溶菌酶缺陷噬菌体T4-Z1感染重组E2菌，F基因经同源重组整合到噬菌体基因组中，用PCR方法筛选重组噬菌体并命名为T4-Z1-F。将T4-Z1-F制备成油乳剂疫苗免疫10日龄SPF鸡，25日龄加强免疫1次。结果表明，表达F蛋白的重组噬菌体具有良好的免疫原性，可诱导免疫鸡产生特异性抗体并对NDV强毒攻击提供部分免疫保护。     

鸡新城疫病毒F基因高效真核表达质粒的构建

为进一步研究基因疫苗的免疫机制和基因疫苗的免疫效果 ,应用 DNA重组技术 ,根据载体 pc D-NA4 .0 / His Max的多克隆位点设计引物 ,对含有 NDV保护性抗原基因 F的质粒 PCR扩增。将得到的目的片段插入到载体的启动子下游 ,成功得到含有 NDV F基因的真核表达质粒载体 PC4 F的基因疫苗。