NDVF基因真核表达质粒的构建及其与鸡IL-18基因联合免疫的初步研究*

 为了探索鸡新城疫病毒(NDV)F蛋白的免疫原性及鸡白细胞介素-18(IL-18)的免疫增强作用,通过PCR和酶切方法将NDV F基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达质粒pcDNA-F。用质粒pcDNA-F单独或与鸡IL-18重组真核表达质粒pIL-18联合免疫14日龄SPF鸡。首免后每周采取外周血及外周抗凝血,应用ELISA和MTT法分别检测免疫鸡的体液免疫及细胞免疫水平。二免后第14 d用NDV强毒F48E9株进行攻击。结果表明,质粒pcDNA-F与pIL-18联合免疫显著提高鸡体的细胞免疫水平,并且提供了50%免疫保护,这为ND的防治开辟了新的途径。     

鸡IL-18真核表达质粒与新城疫病毒F基因疫苗联合免疫探讨

为探讨鸡IL-18基因真核表达质粒pcDNA-chIL-18在新城疫病毒(NDV)F基因疫苗免疫中的作用,克隆了新城疫病毒标准株F48E9的F基因,构建F基因重组真核表达质粒pcDNA-F;将11日龄试验鸡分为4组,每组10只,14日龄一免,28日龄二免,分别肌注pcDNA-F、pcDNA-F+pcDNA-ckIL-18、新城疫传统疫苗(14日龄NDV弱毒疫苗首免,28日龄NDV油苗二免)、生理盐水,一免疫后第7、14、21、28 d均采血进行ND抗体(ELISA)检测和T淋巴细胞转化(MTT)试验;第29 d均肌注50LD50NDV强毒F48E9株.结果显示:免疫保护效率,生理盐水组0/10,pcDNA-F免疫组3/10,pcDNA-F+pcDNA-chIL-18免疫组5/10,新城疫传统疫苗免疫组10/10;ND抗体水平,pcDNA-F免疫组与pcDNA.F+pcDNA-chIL-18免疫组无差异(P>0.05),均显著低于传统疫苗免疫组(P<0.05);T细胞转化水平,pcDNA.F+pcDNA-cML-18免疫组明显高于pcDNA-F免疫组(P<0.05),pcDNA-F免疫组与传统疫苗免疫组无差异(P>0.05).试验结果综合显示pcDNA-F免疫试验鸡可产生一定程度的免疫保护;pcDNA-chIL-18对pcD-NA-F具有一定的免疫增强作用.     

鸡新城疫病毒F蛋白部分表位基因的克隆表达及其免疫反应性

为研究NDV-F蛋白抗原表位在动物免疫应答中的作用特点,作者克隆和表达了NDV-F蛋白基因的部分片段,并检测其免疫反应性.首先根据F基因和载体pGEX-4T-1的多克隆位点自行设计了1对引物,以已克隆的NDV(F48E9株)的F基因为模板,通过PCR扩增获得长度为594 bp的片段.接着在电泳和酶切鉴定后将其定向插入pGEX-4T-1,构建重组质粒pGEX-4T-1-F594,并经PCR、双酶切及测序鉴定后,进一步将其转化到大肠杆菌BL21中.最后用IPTG诱导表达,提取物用SDS-PAGE和Western-blotting分析.结果表明,该基因片段表达的融合蛋白大小约为46 000,以包涵体形式存在,并具有良好的免疫反应性.     

鸡新城疫病毒F基因片段的原核表达及其抗F蛋白单克隆抗体的制备

[目的]制备鸡新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)抗原的单克隆抗体。[方法]克隆和表达了NDV-F蛋白基因的部分片段F306,经杂交瘤技术制备了抗F蛋白的单克隆抗体。[结果]首先根据F基因和载体pGEX-4T-1的多克隆位点自行设计了1对引物,以保存的重组质粒为模板,通过PCR扩增获得长度为306 bp的片段,再将其定向插入pGEX-4T-1,构建重组质粒pGEX-4T-1-F306。其次经原核表达获得大小为35.8 kD的融合蛋白,提纯后免疫Balb/c小鼠。最后,用免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经ELISA筛选和3次亚克隆获得2株稳定传代和分泌抗NDV-F的抗体的杂交瘤细胞株。连续传代10次后,细胞上清和腹水的抗体效价仍维持在1∶5 124和1∶64 000以上。[结论]获得了2株稳定分泌抗鸡NDV-F抗体的杂交瘤细胞。     

鸡新城疫病毒F基因高效真核表达质粒的构建

为进一步研究基因疫苗的免疫机制和基因疫苗的免疫效果 ,应用 DNA重组技术 ,根据载体 pc D-NA4 .0 / His Max的多克隆位点设计引物 ,对含有 NDV保护性抗原基因 F的质粒 PCR扩增。将得到的目的片段插入到载体的启动子下游 ,成功得到含有 NDV F基因的真核表达质粒载体 PC4 F的基因疫苗。     

截短NDV F蛋白的原核表达

根据NDVLaSota株F基因已知的抗原表位,对F蛋白进行分段表达。应用RT—PCR方法分段扩增F基因,并将其克隆到pET30a（＋））原核表达载体上,得到重组质粒pET30-F780和pET30-F760,将质粒导人BL21（ED3）感受态中,经IPTG诱导表达。表达的重组蛋白通过SDS—PAGE和Westem—blotting方法进行鉴定。表达的两段蛋白大小约为31．1kDa和27．9kDa,与预期的蛋白分子量大小相符。Westernblot分析表明重组蛋白可以和NDV抗体发生特异性反应。成功构建了原核表达质粒pET -F780和pET—F760并获得了高效表达,通过Westernblot分析表明重组蛋白具有良好的免疫反应性。     

含NDV F48E9株F基因的MDV CVI988株转移质粒载体的真核表达

为进一步提高重组病毒的表达水平,用构建的含gB启动子和NDV F48E9株F基因的MDV CVI988株转移质粒载体pUS10F转染293T细胞,通过PCR和接免疫荧光(IFA)法研究了其在真核中的表达,并确定最佳的转染条件。结果表明,真核细胞中带有F基因,转移质粒载体已经进入细胞DNA;转染转移质粒载体 pUS10F后的293 T细胞所表达的NDV F基因产物抗原性较好,能够与抗NDV的标准血清反应。确定的最佳转染条件为:DNA 3μg／mL,转染后48 h外源基因在细胞中的表达量最高,在6孔板和96孔板中细胞数量分别以 2×105／孔和1×101／孔的转染效果最好。     

转运真核表达盒的重组T7噬菌体构建

为了构建转运真核表达盒的重组T7噬菌体,并分别在体外、体内条件下检测其标签蛋白质EGFP的表达。以T7噬菌体基因组左侧578 bp处为插入位点,取上游400 bp和下游200 bp片段作为左右同源臂,并在其中插入表达EGFP基因的真核表达盒(EEB),构建同源重组质粒p UC-L-EEB-R。将该质粒载体转化T7噬菌体宿主细菌BL21,在噬菌体繁殖过程中完成同源重组,PCR筛选重组T7-EEB噬菌体。提取该重组噬菌体基因组转染Vero细胞后体外检测EGFP蛋白质表达,纯化的噬菌体免疫小鼠后体内检测EGFP蛋白质表达。结果显示,通过同源重组方法成功构建了携带真核表达盒的重组T7噬菌体,PCR检测和酶切鉴定均证明表达盒已正确插入。T7-EEB基因组转染真核细胞可见明显的EGFP蛋白质表达,免疫小鼠后活体荧光检测到EGFP蛋白质信号,在小鼠肝脏、脾脏组织中RT-PCR检测到EGFP基因的mRNA转录。表明同源重组方法可以用于构建重组T7噬菌体,噬菌体能够转运真核表达盒并实现蛋白质表达。     

猪瘟病毒E2基因重组鸡痘病毒的构建及免疫保护试验

应用PCR从pMD18-T-E2质粒中扩增编码猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)E2蛋白的基因片段,定向克隆到重组鸡痘病毒表达载体FPV-P11上,构建出重组鸡痘病毒转移载体FPV-pSY-E2.用脂质体将该质粒转染至鸡痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)后,通过蓝斑纯化试验筛选出重组鸡痘病毒FV282-CSFV-E2.PCR证实E2基因已整合至鸡痘病毒基因组中.重组鸡痘病毒3次腹腔接种小鼠,ELISA检测血清猪瘟病毒抗体滴度为1:4096.给猪颈部和腹股沟皮下分点注射免疫3次,4周后用CSFV石门强毒株以100 LD<,50>接毒量攻击,结果保护率为75%.本试验为猪瘟重组鸡痘病毒活载体疫苗的研制奠定了基础.     

鸡新城疫病毒F基因部分片段克隆表达及其抗体制备

[目的]为进一步研究新城疫病毒的分子结构和基因疫苗奠定基础。[方法]用自行设计的l对引物,通过RT-PCR从接毒的SPF鸡胚的尿囊液中克隆了新城疫病毒F基因部分片段,将该基因片段插入含谷胱甘肽(GST)基因的质粒pGEX-4T-1,构建了重组质粒,对提取的融合蛋白进行亲和层析纯化和琼扩、ELISA及W estern-blot检测。[结果]通过克隆和PCR扩增获得新城疫病毒F基因的部分片段,大小为509 bp;对构建的重组质粒pGEX-4T-1-F509经诱导表达,获得分子大小约为44 000 bp的融合蛋白,其中F基因的部分片段大小约18 000 bp;经亲和层析,获得纯化GST-F509融合蛋白,进一步用该蛋白免疫小鼠,制备了鼠源抗鸡新城疫病毒F蛋白抗体。[结论]琼脂扩散试验、ELISA及W estern-blot检测表明,该融合蛋白中的F片段具有良好的抗原性。     

新城疫病毒F和HN基因真核表达载体的构建

根据GenBank中新城疫病毒(NDV)F、HN基因序列和真核细胞表达载体pEGPF-N1的克隆位点,分别设计一对引物,通过PCR方法获得了F、HN基因,经回收纯化,将产物连接到克隆载体pMD18-T上。酶切鉴定和序列分析后,再将目的基因亚克隆到真核细胞表达载体pEGPF-N1上,经鉴定,成功构建含有NDVF和HN基因的真核细胞表达载体pEGPF-N1-F和pEGPF-N1-HN,为下一步研究NDVF和HN蛋白在细胞凋亡中的生物学功能奠定基础。     

新城疫病毒F基因真核表达载体的构建及瞬时表达

应用PCR扩增出新城疫病毒F基因,将其克隆入pGEM-T载体,测序。然后将NDVF基因与高效的真核表达载体pcDNA4/HisMax相连,构建NDVF基因重组真核表达质粒pc4F,采用Superfect转染试剂将pc4F瞬时转染COS-7细胞,应用细胞免疫组化法检测其在细胞中的表达情况。结果表明,F基因能够在COS-7细胞中成功表达。     

新城疫病毒F48E9株HN蛋白抗原结构域区段的原核表达

利用生物软件对新城疫病毒F48E9株的血凝素神经氨酸酶(HN)蛋白进行抗原特性分析,选定172～570位氨基酸区域作为多肽表位候选区域。以pUC18-F-HN为模板,设计引物通过PCR扩增,获得HN抗原结构域基因片段,SaⅠl、NoⅠt双酶切定向克隆到原核表达载体pET28a,获得重组质粒分别命名为pET28a-HNa。重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21,筛选出阳性克隆,诱导表达并取产物进行分析。结果表明,HN抗原结构域基因片段获得了融合表达,Western-blotting分析证实表达产物HN与NDV阳性血清具有免疫反应性。为进一步研究HN蛋白抗原结构域的免疫原性以及HN蛋白与F蛋白相互作用奠定了基础。     

新城疫病毒F48E9株F1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中新城疫病毒(NDV)F48E9株F1基因序列和原核表达载体pET-28a的克隆位点,设计1对引物,通过PCR方法获得了F1基因;将F1双酶切产物插入原核表达载体pET-28a,得到的重组子命名为pET-F1。用IPTG进行诱导将其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行了表达,收集菌液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,结果表明,NDV F1在pET-F1中获得了高效融合表达,其表达蛋白的分子质量约为31 ku。表达的重组蛋白为进一步研究NDV的免疫特性和分子生物学功能奠定了基础。