诱导性免疫共刺激分子转基因小鼠模型的建立

利用RT—PCR方法从人扁桃体的激活T细胞mRNA中扩增出诱导性免疫共刺激分子(ICOS)cDNA,继而将ICOS基因插入到pEGFP—N3中得到含ICOS和GFP融合蛋白的pEGFP—ICOS。将外源基因pEGF、P—ICOS注射至FVB小鼠原核中,其胚胎移植到同期发情的假孕受体产出后代,经PCR和Southern检测获得阳性转基因小鼠。试验共注射移植胚胎117枚,出生小鼠43只,检出阳性小鼠2只,该转基因已稳定遗传至F3代,说明建立了ICOS转基因小鼠模型。     

hLF转基因羊繁殖、遗传与表达稳定性

【目的】分析转基因对人乳铁蛋白（human Lactoferrin,hLF）转基因羊繁殖性能的影响,及转基因在不同世代中的遗传与表达稳定性。【方法】应用自主研发的原代hLF转基因山羊（G0代公羊）建系,与普通奶山羊常规交配获得F1代;F1代公羊与F1、F2代母羊或普通奶山羊（N）交配获得F2代;F2代公羊与F2代母羊交配获得F3代。分别采用PCR和ELISA方法对其后代个体进行整合与表达鉴定;统计各世代不同配种方式所获得的后代数量、转基因整合率、母羊受胎率、羔羊异常率等繁殖性能数据。【结果】经过多个繁殖周期,各世代转基因羊受胎率、产羔率等繁殖性状均正常。获得F1代hLF羊19只,转基因整合率为24.7%（19/77）;F2代hLF羊86只,其中通过（F1♂×N♀）交配方式获得的是62只,转基因整合率为33.2%（62/187）;通过（F1♂×F1♀）交配方式获得hLF羊16只,转基因整合率为76.2%（16/21）;通过（F1♂×F2♀）交配方式获得hLF羊8只,转基因整合率为34.8%（8/23）;获得F3代hLF羊9只,转基因整合率为52.9%（9/17）。ELISA方法测定F1、F2、F3代羊泌乳20周乳汁中hLF的表达发现,hLF在转基因羊乳汁中稳定表达,3个世代hLF羊乳中的平均表达量分别为351.75、340.00和326.25 μg•mL-1。【结论】hLF基因的转入未对转基因羊群的繁殖性能产生显著影响,hLF基因能在山羊群体世代间稳定遗传和表达。     

抗全蚀病的转PvPGIP2-TaLTP5双价基因小麦的创制及鉴定

【目的】全蚀病是小麦的毁灭性病害。创制转PvPGIP2和TaLTP5双价基因小麦,分析外源PvPGIP2和TaLTP5在转基因小麦中的遗传与表达情况,选育抗全蚀病的转基因小麦新种质。【方法】采用基因重组技术构建了PvPGIP2和TaLTP5双价表达转基因载体pA25-PvPGIP2-TaLTP5,利用基因枪介导法将该载体转入小麦品种扬麦18,采用PCR、RT-PCR与qRT-PCR方法分析转基因小麦T0—T4植株中目的基因及其表达量,并对T3和T4逐株进行全蚀病接种与抗性鉴定。【结果】创制并选育出稳定的抗全蚀病转PvPGIP2和TaLTP5小麦株系6个。PvPGIP2和TaLTP5能够在这6个转基因小麦株系中稳定遗传,并高水平表达。对转PvPGIP2和TaLTP5小麦的全蚀病抗性鉴定结果表明,与受体扬麦18相比,转PvPGIP2和TaLTP5小麦对全蚀病抗性明显提高。【结论】创制了转PvPGIP2和TaLTP5抗全蚀病的小麦新种质,其对全蚀病具有一定的抗性。     

不同品种羊血液和肺脏中TLRs基因转录水平差异分析

【目的】分析不同品种羊Toll样受体（TLRs）基因转录水平的差异性,为揭示TLRs基因转录水平与羊疫病间的关联性提供参考依据。【方法】选取贵州省主要饲养的贵州黑山羊、贵州白山羊、黔北麻羊、波尔山羊和湖羊为研究对象,根据GenBank已公布的TLRs基因序列设计荧光定量PCR特异性扩增引物及TaqMan探针引物,利用TaqMan探针荧光定量PCR检测不同品种羊血液和肺脏中TLR1~TLR10基因转录水平差异。【结果】 TLR1~TLR10基因在不同品种羊血液和肺脏中均有转录表达。不同品种羊血液和肺脏中的TLRs基因转录水平均存在差异性,在波尔山羊血液中TLR2、TLR4和TLR5基因转录水平均极显著低于其他4种羊（P<0.01,下同）,TLR7和TLR8基因转录水平则极显著低于除黑山羊外的其他3种羊;在白山羊血液中TLR4、TLR7、TLR8和TLR9基因转录水平极显著高于其他4种羊;在湖羊肺脏中TLR2、TLR3、TLR4、TLR5和TLR8基因转录水平极显著低于其他4种羊,而在黔北麻羊肺脏中TLR5和TLR8基因转录水平极显著高于其他4种羊。此外,在5种羊血液中TLR2、TLR4、TLR7和TLR8基因转录水平均极显著高于其他TLRs基因转录水平;羊肺脏中TLR2、TLR3、TLR4、TLR5和TLR8基因转录水平相对较高,在贵州白山羊、贵州黑山羊和波尔山羊均表现为极显著高于其他TLRs基因转录水平。【结论】不同品种羊血液和肺脏中TLRs基因转录水平具有差异性,以TLR2、TLR3、TLR4、TLR5和TLR8基因转录水平相对较高,提示TLRs在不同品种羊机体中发挥着清除病原体及维持机体稳态的作用,而TLRs基因转录水平差异可能是造成不同品种羊对疫病易感差异的原因之一。     

转基因鱼的研究进展

转于的外源基因构建需要有妄动仓,目的基因和终止子等,常用外源基因的导入方法有显微注射,电穿孔等,并介绍了外源基因表达模式及常用的标记基因。转基因鱼的研究比较落后,当务之急是从分子水平上分析鱼类的生理现象及表达基因的结构。     

转Bt基因水稻与非转基因水稻在虫压下的适合度差异(英文)

以转Bt抗虫水稻Bt63、R1、R2和非转基因常规水稻Ⅱ优838为试材,采用高、低两个不同虫害胁迫水平和转基因与非转基因水稻相间种植方式,通过观察水稻植株营养生长、结实以及对螟虫危害的抗性表现等差异,研究比较Bt外源基因插入后对水稻植株适合度的影响,以解转基因水稻的基因扩散效率和潜在生态风险。结果表明:在低虫害胁迫条件下,转Bt基因水稻在植株分蘖数、生物量鲜重等营养生长指标方面与非转基因对照品系间无明显差异,但株高、穗长、穗重等指标不及对照,且R2和Bt63与对照间差异显著;在高虫害胁迫条件下,3个转Bt基因水稻品系的分蘖数、穗长、穗重等指标明显高于对照。而不同转基因品系株高适合度效应不同,这可能与受体品系本身的特性相关。3种转基因水稻的单株结实粒数、千粒重与对照在两种虫害胁迫条件下均无显著性差异,Bt基因对受体植株的结实影响不明显。在高虫害胁迫条件下,3种转Bt基因水稻的抗虫能力均显著优于非转基因水稻,表明Bt基因对受体植株的抗虫性影响显著。本研究结果还表明转Bt基因水稻的适合度代价较小,预示了抗虫转基因水稻外源Bt基因在一定环境条件下具有逃逸的可能,但这种风险比较小。     

转TaDREB3a大豆品系KD1遗传稳定性分析及抗旱性鉴定

利用基因工程技术将抗旱基因转入大豆,培育高抗旱大豆品种,可提高大豆总产量.抗旱转基因大豆KD1是通过农杆菌介导法将来源于小麦TaDREB3a基因导入大豆受体品种垦农18中获得的转基因大豆材料.利用PCR方法,对转基因大豆KD1连续3代(T2～T4代)转基因大豆进行特异性PCR检测验证.结果表明,TaDREB3a和bar基因在KD1后代中稳定遗传.进一步对外源基因作表达分析,连续3代(T2～T4)qRT-PCR检测结果表明,外源基因TaDREB3a和标记基因bar在转基因大豆叶、茎、根和籽粒中均表达且稳定遗传,且TaDREB3a基因在叶片和根中表达水平较高.Western blot结果表明,TaDREB3a和bar基因翻译的外源蛋白在转基因材料后代中稳定表达.对连续2代转基因材料抗旱性分析表明,KD1在芽期具有较强抗旱性,且其抗旱性状显著高于对照且稳定遗传.对转基因大豆KD1作靶标及非靶标除草剂抗性及耐性分析得知,外源基因bar在转基因大豆中稳定表达且在受体垦农18中表达TaDREB3a基因未改变非靶标除草剂抗性.     

转hrpZpsta抗病基因大豆的研究

【目的】将具有广谱抗病性的hrpZpsta基因导入大豆,为培育抗灰斑病的转基因大豆新品系奠定基础。【方法】采用农杆菌介导法,以大豆子叶节为受体,将具有广谱抗性的hrpZpsta基因转入大豆品种"吉林30"中,以耐盐基因badh作为筛选标记性基因,经过抗性筛选,对转基因植株进行PCR检测、Southern杂交和RT-PCR检测分析。【结果】确定的NaCl筛选浓度为200mmol/L。对T1、T2和T3代转基因植株进行PCR检测,得到T1代阳性植株30株,T2代45株,T3代284株,说明外源hrpZpsta基因在转基因后代中能够遗传。Southern杂交结果表明,外源目的基因hrpZpsta已经整合进大豆基因组中,且整合位点不尽相同。RT-PCR结果表明,hrpZpsta基因在受体大豆中获得表达。【结论】获得了hrpZpsta基因遗传表达的T3代转基因大豆株系。     

OsRhoGDI2过表达转基因水稻的筛选鉴定及外源基因拷贝数的初步分析

水稻Rho GDP解离抑制基因OsRhoGDI2是从幼穗中分离出的功能未知基因。为鉴定该基因的功能,笔者所在实验室前期构建了植物过表达载体pCAMBIA1302-OsRhoGDI2-GFP,并对水稻进行了遗传转化。对OsRhoGDI2过表达转基因水稻T_2代进行筛选和鉴定,采用PCR技术鉴定转基因植株,采用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR检测OsRhoGDI2在转基因水稻中的表达水平,结果显示,其中6个株系为过表达转基因植株,OsRhoGDI2表达水平上调1.69～13.35倍。为检测外源基因在转基因水稻中的拷贝数,分别以蔗糖磷酸合成酶基因SPS和潮霉素抗性基因HYG为内参基因和标记基因,采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术结合内参基因和标记基因的标准曲线进行分析,结果显示在所检测的6个转基因株系中,外源基因的拷贝数均为1,提示已经获得稳定遗传的OsRhoGDI2过表达转基因水稻,为后续OsRhoGDI2基因的功能研究奠定基础。     

转chi+rip双价抗真菌病基因大豆遗传稳定性分析

外源基因在转基因植物中遗传和表达的稳定性直接关系到转基因材料的应用前景.研究以转chi+rip双价基因大豆株系G0431、G0433的T2、T3及T4连续世代为材料,通过PCR、Southem杂交、Real-time PCR进一步证明外源基因已经整合到大豆基因组中,并稳定遗传给后代;Real-time RT-PCR、W...     

慢病毒生产卵泡抑素转基因绵阳PCR检测方法的建立(英文)

[目的]建立稳定快速的慢病毒转基因羊DNA水平检测方法。[方法]采集初生转基因羔羊的子叶、脐带、尾组织以及死亡羔羊的全身各组织,提取基因组DNA作为模板进行PCR检测,以Follistatin基因N+D1片段特异性引物进行PCR检测;同时,对慢病毒载体的CMV启动子、5’-LTR等结构元件进行PCR检测;提取死亡羔羊的全身组织以及转基因羔羊的活体肌肉组织总RNA,进行RTPCR检测。[结果]采用试剂盒提取的基因组DNA比常规方法提取的DNA快速、高效,且更易被检测,扩增时的引物采用载体上游与目标基因下游的组合大大增加了检测的特异性,避免了内源性目标基因的干扰而造成假阳性;初生转基因羔羊的尾组织可作为PCR检测的组织样品,其结果可靠、准确;对CMV启动子及5’-LTR等结构元件作PCR检测为转基因动物的安全性考察提供了数据,同时验证了转基因羔羊目的基因的检测结果;对转基因羔羊肌肉组织提取总RNA后进行RT-PCR检测,其中有3只羔羊没有检测到转录产物,其他均有转录。[结论]该研究建立的转基因绵羊PCR检测方法高效、快速且准确,为进一步蛋白水平检测提供试验依据,也为建立转基因绵羊系统性多层次的检测方法奠定基础,还为转基因绵羊的安全监测提供了稳定的技术平台。     

GsPPCK1和GsPPCK3基因转化苜蓿及其耐碱性分析

基于课题组构建的野大豆碱胁迫基因转录谱和调控网络,筛选出两个碱胁迫应答关键基因:丝苏氨酸磷酸激酶(GsPPCK1和GsPPCK3)。本研究构建了以35S为启动子,bar基因为筛选标记基因的植物超表达载体,以紫花苜蓿龙牧806子叶节为外植体,通过农杆菌介导法进行了GsPPCK1和GsPPCK3的苜蓿遗传转化;通过固沙草筛选GsPPCK1获得抗性植株45株,GsPPCK3获得53株;对抗性植株进行PCR和Real-time PCR检测,最终确定基因超量表达各2个株系。为进一步研究该基因的耐碱性,用NaHCO3分别为0 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L、250 mmol/L的4个浓度处理转基因苜蓿,9 d后不同NaHCO3胁迫下对转基因株系进行耐碱性相关的生理指标分析,包括质膜透性、叶绿素含量、丙二醛含量、脯氨酸含量、柠檬酸含量、SOD活性及PEPC活性,结果表明:GsPPCK1和GsPPCK3在苜蓿中的超量表达显著提高了苜蓿的耐碱性。     

紫花苜蓿MsCOL1基因植物表达载体的构建及拟南芥转化

[目的]构建紫花苜蓿MsCOL1基因植物的表达载体。[方法]根据紫花苜蓿CONSTANS类似基因MsCOL1基因(登录号:DQ661682)序列,设计含有酶切位点的一对特异性引物,以紫花苜蓿cDNA为模板,获得MsCOL1基因完整编码区DNA序列,并将目的片段插入表达载体pBI121的相应位置,构建植物表达载体35S∷MsCOL1,再利用农杆菌介导方法将35S∷MsCOL1转化到拟南芥中。[结果]分析测序结果显示,所获得克隆为插入目的片段的阳性克隆。经RT-PCR检测,证明转基因植株中MsCOL1基因能够顺利表达。[结论]该方法成功构建植物表达载体35S∷MsCOL1,并获得了转基因拟南芥植株。     

转KAP6.1-GFP-蜘蛛拖丝蛋白基因核心序列4S 绵羊成纤维细胞株的筛选

 【目的】通过体细胞核移植为获得皮肤特异表达蜘蛛拖丝蛋白的绵羊奠定基础。【方法】将pcDNA3.1和带有角蛋白结合蛋白启动子质粒pGM-T-KAP6.1分别用Bgl Ⅱ和Hin d Ⅲ双酶切后连接,再与蜘蛛拖丝蛋白基因核心序列4S连接,最后通过酶切与pIRES2-EGFP质粒连接后构建真核表达载体pIRES2-EGFP-4S;将此载体线性化后,采用脂质体法转染绵羊皮肤成纤维细胞,通过G418筛选获得转基因阳性细胞。【结果】筛选得到转pIRES2-EGFP-4S的阳性细胞。对阳性细胞经体外培养后的检测显示：（1）细胞形态（长梭形）、细胞生长曲线（呈S形）、群体倍增时间（随培养时间增加逐渐缩短）和细胞接种率（细胞贴壁率及存活率在24 h内逐渐升高,并达到最高值125%）等均具有正常绵羊成纤维细胞的生物学特征;（2）阳性细胞经冷冻复苏后具有与新鲜阳性细胞相似的生物学特征;（3）PCR检测结果显示,pIRES2-EGFP-4S在阳性细胞的基因组中整合。【结论】获得具有在绵羊皮肤特异表达,且便于检测的转蜘蛛拖丝蛋白4S的绵羊成纤维细胞株。     

水稻OsCERK2转基因植株的获得及初步分析

以水稻粳稻品种日本晴为研究材料,利用拟南芥CERK1的蛋白质序列检索,在水稻基因组候选了与拟南芥CERK1同源的水稻基因OsCERK2,通过RT-PCR分离了该基因的全长cDNA。生物信息学分析显示,OsCERK2是一种含有信号肽的质膜蛋白,胞外结构域含有LsyM基序,激酶结构域含有酪氨酸蛋白激酶结构域。构建了由35S启动子驱动该基因的过表达遗传转化载体和由玉米的泛素基因的启动子驱动的RNA干涉（RNAi）的遗传转化载体,利用农杆菌介导的遗传转化技术,将OsCERK2基因导入水稻,得到T0代转基因植株。对T0代植株进行了PCR检测和半定量RT-PCR检测,获得了OsCERK2有效表达的转基因植株。     

转拟蜘蛛牵丝蛋白基因新疆美利奴细毛羊成纤维细胞系的建立及初步鉴定

[目的]建立合有拟蜘蛛牵丝蛋白基因的新疆美利奴细毛羊成纤维细胞系.[方法]采用脂质体转染,将表达拟蜘蛛牵丝基因的质粒pKap-EGFP4S转入新疆美利奴细毛羊成纤维细胞,通过G418毒性筛选获得阳性细胞系,并采用PCR、RT-PCR检测重组细胞中的目的基因表达.[结果]对体外分离培养的成纤维细胞观察表明细胞形态均为长梭形、活性良好（细胞生长曲线呈S型）、染色体数目为2n =54;通过G418筛选出共43株单克隆细胞系,经PCR鉴定拟蜘蛛牵丝蛋白基因随机整合的细胞系15株,其中挑选4个阳性细胞系经过RT-PCR检测目的基因已转录为mRNA.[结论]成功建立了拟蜘蛛牵丝蛋白基因的新疆美利奴细毛羊成纤维细胞系,为进一步通过体细胞核移植技术制备被毛含转拟蜘蛛牵丝蛋白基因克隆羊奠定基础.     

黄芪皂甙对斑点叉尾鮰非特异性免疫和抗病力的影响

分别向基础饲料中添加黄芪皂甙Astragalus membranaceus0（对照组）、300（低剂量组）、500（中剂量组）、800 mg/kg（高剂量组）制备4种试验饲料,饲喂同一家系的1龄斑点叉尾鮰Ictalures punctatus,饲喂期为60 d。以斑点叉尾鮰血清溶菌酶（LSZ）、碱性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）活性以及肝脏、脾、头肾组织中Toll样受体——TLR2、TLR3表达水平为指标,结合嗜水气单胞菌攻毒试验,探讨了不同剂量的黄芪皂甙对斑点叉尾鮰免疫抗病力的影响。结果表明：中、高剂量组斑点叉尾鮰血清中LSZ、AKP活力均显著高于对照组和低剂量组（P〈0.05）,其中高剂量组血清LSZ活力显著高于其它各组（P〈0.05）,具有明显的剂量效应;与对照组相比,各试验组斑点叉尾鮰血清中SOD活力有所提高,但无显著性差异（P〉0.05）;黄芪皂甙可以显著提高TLR3基因在肝脏中的表达量,低、中、高剂量组斑点叉尾鮰肝脏中TLR3基因的表达量均显著高于对照组（P〈0.05）;高剂量黄芪皂甙可以显著提高TLR3基因在脾、头肾组织中的表达量（P〈0.05）,呈现较为明显的剂量效应;与对照组相比,黄芪皂甙中、高剂量组斑点叉尾鮰脾中TLR5表达量均有显著性提高（P〈0.05）;黄芪皂甙对TLR5基因在肝脏、头肾组织中的表达具有剂量效应,中、高剂量黄芪皂甙可以显著提高TLR5基因的表达水平（P〈0.05）,低剂量组与对照组相比无显著性差异（P〉0.05）。攻毒后试验鱼累积死亡率表明,摄食含有不同剂量的黄芪皂甙饲料以后,斑点叉尾鮰抵抗嗜水气单胞菌感染的能力显著增强,对照组斑点叉尾鮰的最终累积死亡率（61.11%±6.94%）显著高于中、高剂量组（31.11%±3.75%、30.01%±5.34%）（P〈0.05）。上述结果说明：特定剂量的黄芪皂甙可以显著提高斑点叉尾鮰机体的非特异性免疫力,黄芪皂甙可以作为一种安全高效的口服免疫增强剂应用于斑点叉尾鮰健康养殖及病害防治。     

转基因油菜W-4 T-DNA旁侧序列分析与事件特异性检测

W-4是通过农杆菌介导法将fad2基因的反向重复序列表达框转入甘蓝型油菜Westar后获得的转基因高油酸油菜品系.为建立W-4的转基因事件特异性PCR检测技术,应用温度不对称PCR（TAIL-PCR）扩增获得转基因油菜W-4的T-DNA插入位点的左、右旁侧序列.其中右边界旁侧序列长度为290 bp,其碱基组成G＋C含量为31.27％、A＋T含量为68.73％;左边界旁侧序列长度为365 bp,其碱基组成G＋C含量为32.6％、A＋T含量为67.4％,表明该T-DNA整合在富含AT区.序列比对结果发现,该转基因事件中,T-DNA左边界序列完全整合到油菜基因组中,仅有1个碱基由G转换成了A.而右边界则缺失了包括RBborder在内的62个碱基.结果表明：转基因高油酸油菜T-DNA的整合是一次无载体序列的整合.依据左、右边界旁侧序列和转基因载体的T-DNA左右边界序列设计了2对特异性引物TLF/TLR和TRF/TRR,能从W-4基因组DNA中扩增出大小分别为485和405 bp的预期产物,而在其他转基因油菜、非转基因油菜的基因组DNA和空白对照中均无特异性扩增产物,据此建立了W-4的转基因事件特异性PCR检测技术.应用该检测技术可以从含有0.1％ W-4基因组DNA的混合样品中扩增出特异产物,检测灵敏度达0.1％.可对W-4的转基因事件进行特异性检测.     

玉米抗草甘膦基因(sxglr-11)的构建与表达

将现有的抗草甘膦基因(sxglr-11)和带有Ubiquitin启动子的载体进行连接,用壮观霉素(spectino-mycin)抗生素标记,构建携带抗草甘膦基因(sxglr-11)的大肠杆菌。然后利用三亲杂交法,将构建的真核表达载体转入根瘤农杆菌菌株LBA4404。对菌落进行PCR检测以及质粒双酶切产物进行电泳检测,并用构建的工程菌转化玉米试管苗。研究结果表明,表达载体成功转入根瘤农杆菌LBA4404。