溶解性多糖单加氧酶CBP21的高效分泌表达及与几丁质酶的协同作用研究

为实现溶解性多糖单加氧酶CBP21在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达,并对其与几丁质酶的协同作用进行研究,以大肠-枯草芽孢杆菌穿梭质粒p WB980为基本骨架,溶解性多糖单加氧酶为目的蛋白,构建了信号肽筛选载体,依据信号肽结构特征(正电荷与疏水性的差异)对Sec途径的13个信号肽进行了筛选,结果显示信号肽Ylq B引导分泌溶解性多糖单加氧酶的效率最高,其发酵液上清对胶体几丁质结合活力最高,上清中结合蛋白占总蛋白浓度为32.39%。进一步分别对CBP21和来自糖苷水解酶18家族粘质沙雷菌几丁质酶及来自糖苷水解酶19家族的嗜水气单胞菌几丁质酶Chi92的协同作用进行分析,表明CBP21对几丁质酶和Chi92活力均有促进作用,其中使粘质沙雷菌几丁质酶活力提高1.85倍,使Chi92(嗜水气单胞菌)活力提高2.35倍。上述研究为该溶解性多糖单加氧酶的工业应用奠定了基础。     

启动子及信号肽筛选提高普鲁兰酶在地衣芽孢杆菌中的表达

普鲁兰酶(pullulanase)是一种淀粉脱支酶,在淀粉糖化加工等工业生产中具有重要的应用价值。选用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) BL10作为表达宿主,为了提高其中的普鲁兰酶产量,对来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 168和地衣芽孢杆菌BL10中的15种不同信号肽以及4种不同启动子进行筛选,构建了不同的重组工程菌株,最终发现在以P43为启动子、apr为信号肽的条件下,上清液中普鲁兰酶的表达量最高,酶活可达12 U/m L,且测得其最适反应温度为60℃,最适p H为4.5。结果表明通过对启动子及信号肽进行筛选是提高重组工程菌株中目的蛋白表达量的一种有效手段。     

苏云金芽孢杆菌kurstaki亚种几丁质内切酶基因的生物信息学分析

以苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种（Bacillus thuringiensis subsp kurstaki）基因组DNA为模板,利用1对特异性引物通过Touchdown PCR方法扩增了长为2576bp的几丁质酶kchi基因序列（GenBank登录号：AY189740）。生物信息学分析发现：该序列包含1个完整的开放阅读框,编码688个氨基酸,推测是分子量约为75820。等电点pI=5．89的几丁质酶前体。序列和结构比较分析结果表明：Kchi属于几丁质内切酶,包括几丁质酶催化区、粘蛋白Ⅲ型同源区和几丁质结合区3个结构域,在N端还有1个分泌信号肽。除与胁巴基斯坦亚种几丁质酶同源性较低（相似性为61．3％）外,与Bt其他亚种的同源性都较高（≥92．0％）。     

猕猴桃几丁质酶基因克隆及生物信息学分析

为研究几丁质酶在猕猴桃抗果实熟腐病中的功能及抗性利用,对猕猴桃几丁质酶基因进行克隆并分析其蛋白结构。以猕猴桃抗病品种‘金艳’果实为材料,接种果腐病菌(Botryosphaeria dothidea),72 h后提取果实总RNA。使用引物对Ac C-F/Ac C-R和RT-PCR技术,扩增几丁质酶基因。克隆、测序和序列分析表明,该基因(命名为Ac CHI1,基因登录号MH580296)开放阅读框为795 bp,编码264个氨基酸,与茶树(Camellia sinensis)几丁质酶蛋白序列同源性最高,为81%。生物信息学分析表明,该蛋白属于I类几丁质酶,分子质量28.6 ku,等电点8.58,为亲水性稳定蛋白,含有信号肽,无跨膜结构,二级结构主要由无规则卷曲构成,三级结构与I类几丁质酶同源模板(4tx7.1.A)结构相似性为69.7%。研究结果为进一步开展猕猴桃几丁质酶基因功能研究和应用提供了理论依据。     

地衣芽孢杆菌BL03脂肪酶基因LIP的克隆及序列分析

[目的]克隆地衣芽孢杆菌BL03的脂肪酶基因LIP并对其序列进行分析。[方法]以地衣芽孢杆菌BL03基因组核酸为模板,PCR扩增得到地衣芽孢杆菌脂肪酶基因,用pMD19-T载体克隆后进行PCR鉴定及序列测定和生物信息学分析。[结果]测序结果表明该片段完整开放阅读框大小为615 bp,与已发表的地衣芽孢杆菌LTP基因(GeneID:3098655)相比,核酸序列相似为99.67%;推导编码氨基酸序列相似性为99.02%。[结论]该基因的获得为其异源表达及相关研究奠定了基础。     

少孢节丛孢菌XJ-A1几丁质酶基因的克隆及生物信息学分析

为研究捕食线虫性真菌几丁质酶的功能,在国内首次对少孢节丛孢菌XJ-A1几丁质酶AO-801和AO-483基因进行扩增、克隆及测序,并对其编码蛋白信号肽、疏水性与亲水性、高级结构、功能域进行预测和分析。结果显示,2个不同蛋白均具有典型的几丁质酶催化区保守序列SXGGW和DGXDXDWE,属于糖苷水解酶18家族几丁质酶,无信号肽序列,表明这2个蛋白为非分泌型蛋白,二级结构以无规则卷曲、α-螺旋和β-折叠为蛋白的主要结构元件,三级结构中有(α/β)8的圆桶形结构。系统发育分析表明,几丁质酶AO-801和AO-483与昆虫病原真菌几丁质酶的亲缘关系更为接近,说明它们所产生的几丁质酶在侵染宿主的过程中发挥着类似的功能,并且不同来源真菌几丁质酶根据分子质量的差异形成3个不同的进化分枝。     

烟草Ⅰ型几丁质酶的生物信息学分析（英文）

旨在对烟草Ⅰ型几丁质酶进行生物信息学分析,了解其生物学特征,为下一步研究烟草Ⅰ型几丁质酶在烟草抗病过程中的作用奠定基础。采用生物信息学的方法,对已在NCBI上登陆的烟草、拟南芥、水稻、菜豆的Ⅰ型几丁质酶(chitinase,ChiⅠ)氨基酸序列特征和进化关系进行了预测和分析。结果表明,这4种植物Ⅰ型几丁质酶的分子量大小在28~37 k Da之间,均具有信号肽,结构域高度保守,均具有几丁质结合区(Cht BD1)和催化功能区(Glyco_hydro_19);烟草中的3种Ⅰ型几丁质酶序列相似性较高,可以聚为一类;烟草与拟南芥和菜豆中的一种ChiⅠ遗传距离较近,而与水稻中ChiⅠ的遗传距离较远。通过分析发现,烟草Ⅰ型几丁质酶有着与其他植物中该酶相同的特性,为进一步研究烟草抗病蛋白提供理论依据。     

苏云金芽孢杆菌几丁质酶基因chiA在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

[目的]研究来源于苏云金芽孢杆菌的几丁质酶基因chiA在枯草芽孢杆菌中的表达情况。[方法]以苏云金芽孢杆菌染色体DNA为模板,PCR扩增获取几丁质酶基因chiA,将其与枯草芽孢杆菌表达载体pHSG连接,构建重组菌,经IPTG诱导后,检测培养液中的几丁质酶活性。[结果]扩增得到几丁质酶基因chiA大小为2.5 kb。构建的重组菌对底物[4-MU-(GlcNAc)3]显示出一定的水解活性,培养液酶活约为2.8 U/ml,而pHSG空质粒转化子在同样条件下其培养液没有明显酶活。该重组酶的最适pH值为6.5,最适反应温度为50℃,与苏云金芽孢杆菌自身产生的几丁质酶性质一致。[结论]几丁质酶基因chiA能在枯草芽孢杆菌中成功表达,表达产物可成功分泌到细胞外。     

产几丁质酶芽孢杆菌的筛选鉴定和酶活力测定

从103份采自中国各地的土样中分离得到了312株芽孢杆菌，用平板透圈法筛选到3株产几丁质酶菌株G1、G2和G3。经鉴定，G1为短芽孢杆菌（Bacillus brevis）；G2为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）；G3为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。它们的几丁质平板上的透明圈直径以G1＞G3＞G2 ，在以Schales‘法测定壳聚糖酶活力时，其摇瓶发酵上清液的酶尖力以G3＞G1＞G2为序。本文首次报道短芽孢杆菌产生几丁质酶和壳聚糖酶。     

全基因组预测枯草芽孢杆菌BEST195的分泌蛋白

枯草芽孢杆菌BEST195作为纳豆菌的一种,是纳豆生产的重要菌株之一。利用Signal P、Prot Comp、TMHMM、Phobius、Lipo P、Tat P等预测程序对该菌中4 456条蛋白质序列进行分泌蛋白找寻,同时,对上述分泌蛋白的氨基酸分布、信号肽长度大小、信号肽切割位点等性质进行分析。结果表明:枯草芽孢杆菌含有分泌蛋白102个,其氨基酸长度、信号肽长度与植物病原菌不同;信号肽切割位点属于A-X-A类型,与其他已经报道的植物病原真菌、细菌以及卵菌中分泌蛋白信号肽切割位点一致。通过上述生物信息学分析方法有效地实现了枯草芽孢杆菌BEST195分泌蛋白的预测,分泌蛋白的信号肽切割位点具有物种保守型特点。     

全基因组预测枯草芽孢杆菌XF-1的分泌蛋白

枯草芽孢杆菌XF-1对诸多植物病原菌具有抑制作用,是农业生产上重要的生防菌之一。利用SignalP、ProtComp、TMHMM、Phobius、LipoP、TatP等预测程序对枯草芽孢杆菌中3 853条蛋白质序列进行分泌蛋白的预测研究,并对所获得的分泌蛋白开展氨基酸分布、信号肽长度、切割位点等性质进行分析。结果表明,该菌含有分泌蛋白为104个,其氨基酸长度、信号肽长度与植物病原菌不同;信号肽切割位点属于A-X-A类型,与其他已经报道的植物病原真菌、细菌以及卵菌中分泌蛋白信号肽切割位点一致。通过上述生物信息学分析方法有效地实现了枯草芽孢杆菌分泌蛋白的预测,分泌蛋白的信号肽切割位点具有物种保守型特点。     

基于gyrB基因的地衣芽孢杆菌PCR快速检测方法的建立

根据地衣芽孢杆菌的gyrB基因序列设计一对引物,扩增片段大小为507bp的基因片段,该方法对地衣芽孢杆菌DNA的扩增结果为阳性,对照菌株扩增结果均为阴性,对地衣芽孢杆菌检测的灵敏性为1pg总DNA量,成功建立了地衣芽孢杆菌PCR检测方法,该方法具有快速、灵敏度高、特异性强等优点,为地衣芽孢杆菌的分离及鉴定奠定了良好的基础。     

烟草Ⅰ型几丁质酶的生物信息学分析

旨在对烟草Ⅰ型几丁质酶进行生物信息学分析,了解其生物学特征,为下一步研究烟草Ⅰ型几丁质酶在烟草抗病过程中的作用奠定基础。采用生物信息学的方法,对已在 NCBI上登陆的烟草、拟南芥、水稻、菜豆的Ⅰ型几丁质酶（chitinase,ChiⅠ）氨基酸序列特征和进化关系进行了预测和分析。结果表明,这4种植物Ⅰ型几丁质酶的分子量大小在28~37 kDa之间,均具有信号肽,结构域高度保守,均具有几丁质结合区（ Cht BD1）和催化功能区（Glyco_hydro_19）;烟草中的3种Ⅰ型几丁质酶序列相似性较高,可以聚为一类;烟草与拟南芥和菜豆中的一种 ChiⅠ遗传距离较近,而与水稻中 ChiⅠ的遗传距离较远。通过分析发现,烟草Ⅰ型几丁质酶有着与其他植物中该酶相同的特性,为进一步研究烟草抗病蛋白提供理论依据。     

1株耐高温纤维素酶产生菌的分离与鉴定

从环境样品中筛选得到1株耐高温纤维素酶产生菌A13。形态及生理生化特征测定结果表明,A13菌株与芽孢杆菌属(Bacillus)中地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的特征基本一致。测定了该菌株的16S rDNA序列并根据16S rDNA构建了系统发育树,在系统发育树中,A13菌株与地衣芽孢杆菌形成一个类群,序列同源性为90%。最终确定该菌株为地衣芽孢杆菌。     

灵芝尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因 的电子克隆与生物信息学分析

尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)是灵芝多糖合成途径的关键酶,用电子克隆方法得到灵芝UGPase基因,并利用生物信息学软件对UGPase基因编码蛋白的理化性质、亚细胞定位、亲/疏水性、信号肽、蛋白结构域、蛋白高级结构以及系统进化树的构建等方面进行了预测和分析。结果表明:UGPase基因全长1691 bp,包含一个1515 bp的完整开放阅读框,编码504个氨基酸;该蛋白不存在信号肽和跨膜结构域,它是定位于细胞质内的一种亲水性稳定蛋白酶;它的高级结构主要是由α螺旋结构和无规则卷曲结构所组成;同源比对分析显示,该酶基因编码的氨基酸序列和其他动植物的UGPase酶相比在序列组成、高级结构方面具有一定的相似性。     

灵芝尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的电子克隆与生物信息学分析

尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)是灵芝多糖合成途径的关键酶,用电子克隆方法得到灵芝UGPase基因,并利用生物信息学软件对UGPase基因编码蛋白的理化性质、亚细胞定位、亲/疏水性、信号肽、蛋白结构域、蛋白高级结构以及系统进化树的构建等方面进行了预测和分析。结果表明:UGPase基因全长1691 bp,包含一个1515 bp的完整开放阅读框,编码504个氨基酸;该蛋白不存在信号肽和跨膜结构域,它是定位于细胞质内的一种亲水性稳定蛋白酶;它的高级结构主要是由α螺旋结构和无规则卷曲结构所组成;同源比对分析显示,该酶基因编码的氨基酸序列和其他动植物的UGPase酶相比在序列组成、高级结构方面具有一定的相似性。     

不结球白菜BcGAPDH的生物信息学分析

采用生物信息学方法对克隆测序的不结球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis)Bc GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)蛋白质的理化性质、跨膜区、亲水性、亚细胞定位、所含模体及蛋白质结构进行了预测。理化性质分析表明,该酶含有328个氨基酸,相对分子量为35 161.2,p I值为9.03。TMpred跨膜分析表明,该酶没有跨膜螺旋区,这与Prot Scale预测的该酶为亲水性蛋白质相吻合。用Target P server程序预测该酶定位于线粒体上,结构域分析表明该酶含有多种磷酸化位点,二级结构以α-螺旋和随机卷曲为主。借助SWISS-MODEL软件对该酶进行了三维同源建模。     

短小芽孢杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因克隆、表达及其酶特性研究

提取短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)基因组,通过PCR克隆了短小芽孢杆菌β-葡聚糖酶基因全长序列.结果表明:该基因全长754 bp,ORF为717 bp,编码239个氨基酸,计算分子量为26.98 kD,等电点为6.08.经Blast分析,该序列与地衣芽孢杆菌同源性最高(91%),该基因首次在GenBank上登录(登录号AY164456).在克隆载体上亚克隆基因全长,构建重组表达载体pET-pum,导入大肠杆菌BL 21中表达.SDS-PAGE电泳表明:在27 kD左右有表达带,酶活较低(7.24 U/mL),仅为出发菌酶活的16%,其最适温度为50 ℃左右,最适pH在5左右.     

产甲酸草酸杆菌oxc基因的克隆及其蛋白结构预测

参考GenBank中已公布的产甲酸草酸杆菌(Oxalobacter formigenes,OxB)的参考序列(M77128)设计了一对扩增OXC酶蛋白基因的引物,对产甲酸草酸杆菌(ATCC 35274)的DNA抽提物进行扩增,获得了特异性的扩增片段.运用Lnternet网络上的数据库及程序,对OXC酶蛋白的理化性质、结构和功能进行生物信息学分析.结果显示克隆序列与参考序列的核苷酸序列以及推导的氨基酸序列的同源性达到99.9%和99.6%,预测该酶蛋白是分泌到胞外行使生物学功能的胞外酶,具有良好的抗原性和亲水性,二级结构是以α-螺旋为主的混合型蛋白而且其二级结构预测显示OXC酶蛋白属于硫胺素焦磷酸依赖酶家族,和其它酶家族成员一样能够发挥降解草酸的功能.     

宋河酒曲中产淀粉酶芽孢菌的分离鉴定及产酶特性

为了有效控制宋河酒曲的制曲过程和发酵进程,对宋河酒曲中产淀粉酶芽孢菌进行了分离鉴定并研究筛选菌株的产淀粉酶特性。结果表明:从宋河酒曲中共分离到12株产淀粉酶芽孢菌,均属革兰氏阳性杆状菌,初步鉴定归为1个属5个种,即芽孢杆菌属(Bacillus)、坚硬芽孢杆菌(Bacillus firmus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium),其中,坚硬芽孢杆菌是宋河大曲产淀粉酶芽孢菌的数量优势菌群,获得1株地衣芽孢杆菌SQ2为中温型高产淀粉酶菌株,其液态发酵产酶特性为37℃培养,前24h产酶较弱,此后,酶活力迅速上升,72h达到最大值为89μg/(mL.min),产酶旺盛期发生在菌体成熟期和衰亡初期,产酶过程pH值先稍偏酸性后接近中性。