静原鸡AK1基因序列分析及真核表达载体的构建

目的 探究宁夏地方品种静原鸡前期转录组测序筛选出的AK1基因编码蛋白的结构与功能,构建其真核表达载体。方法 根据GenBank上已公布的原鸡AK1基因序列,针对其CDS区设计特异性引物,通过克隆测序对AK1基因CDS区SNPs进行快速筛查,构建AK1基因的真核表达载体,并进行编码区生物信息学功能分析。结果 AK1基因编码区全长585 bp,编码194个氨基酸;AK1蛋白无跨膜结构域,存在2个CpG岛,18个磷酸化位点,10个抗原表位,为稳定的水溶性蛋白,空间结构以α–螺旋和无规则卷曲为主。亚细胞定位结果显示,AK1蛋白主要位于细胞质内;GO富集分析发现,AK1基因同样富集在细胞质中,与亚细胞定位结果一致。基因共表达分析发现,在与AK1互作的基因中,AK1与AMPD1、PKM2基因存在共表达,共表达系数分别为0.116和0.063。成功构建出AK1-pEGFP-N1载体。结论 该研究结果为后续AK1蛋白功能以及AK1作为肌苷酸相关基因的深入研究提供了科学依据。     

介导分泌表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组杆状病毒的构建

应用杆状病毒表达系统,将猪圆环病毒2型 ORF2 基因插入供体质粒pFastBac^TMDual pH启动子控制下的多克隆位点,引入EGT信号肽取代 ORF2 原有核定位信号肽以实现在昆虫细胞中分泌型表达,并在C端融合6个组氨酸标签以便于后期的纯化.将构建质粒转化DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭载体,提取重组Bacmid质粒.将阳性重组Bacmid质粒转染Sf9昆虫细胞,72 h收集培养上清液获得重组杆状病毒.间接免疫荧光试验和Western-blot表明,该重组杆状病毒可以在昆虫细胞实现猪圆环病毒2型Cap蛋白的分泌表达.     

油菜菌核病菌激发子基因SsXYN克隆及表达载体构建

以核盘菌菌株NGA₄提取的总RNA为模版,利用RT-PCR技术扩增获得SsXYN基因的全长cDNA片段,将其克隆到pMD19-T载体上,菌落PCR、酶切鉴定和cDNA测序结果表明成功克隆了核盘菌SsXYN基因。从pMD19-T : SsXYN载体上,用BamH I和Sal I 双酶切切下目的基因片段,将该基因片段连接到原核表达载体pET32a中。菌落PCR和酶切鉴定结果显示成功构建了表达载体pET32a : SsXYN。利用热击法将该重组表达载体导入大肠杆菌BL21,获得携带SsXYN基因的大肠杆菌菌株,为进一步研究激发子诱发植物抗病性机理奠定了基础。     

黑曲霉分泌表达载体的构建以及绿色荧光蛋白的表达

采用PCR扩增得到糖化酶基因启动子（PglaA-g）、色氨酸合成酶基因终止子（TtrpC）和潮霉素抗性筛选标记基因,依次连接这些基因元件,获得黑曲 Aspergillus niger 分泌表达载体pPHT. EGFP 基因与黑曲霉表达载体pPHT连接,得到重组表达载体pPHT-EGFP.pPHT-EGFP表达载体通过原生质体转化法转化黑曲霉,经潮霉素抗性筛选、基因组PCR鉴定阳性重组转化子.荧光显微镜观察表明,绿色荧光蛋白成功表达,而且荧光的分布具有一定的规律,主要集中在菌丝顶端、膈膜以及培养基中;固体培养基发出绿色荧光,表明绿色荧光蛋白分泌到培养基中,属于分泌性表达,蛋白分泌的部位主要位于菌丝顶端.     

TRIM8基因在小鼠组织和早期胚胎中的表达及其功能初探

【目的】研究TRIM8基因在小鼠组织和早期胚胎中的表达情况及其沉默后对早期胚胎体外发育的影响。【方法】采用RT-PCR、免疫印迹分别检测TRIM8基因及其编码的蛋白在小鼠不同组织（心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、肌肉、子宫、卵巢和睾丸）中的表达情况,采用免疫组化技术对TRIM8在卵巢中进行定位。利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、免疫印迹法检测TRIM8基因及其编码的蛋白在小鼠早期胚胎（1-细胞胚胎、2-细胞胚胎、4-细胞胚胎、8-细胞胚胎、桑葚胚和囊胚）中的表达规律,用免疫荧光结合激光共聚焦显微镜技术对TRIM8在早期胚胎中进行定位。利用RNA干扰技术沉默TRIM8基因,研究该基因沉默对小鼠早期胚胎体外发育的影响。【结果】TRIM8基因及其编码的蛋白在小鼠不同组织中均表达,但在子宫、卵巢和睾丸中表达水平相对较高。在卵巢中,TRIM8蛋白主要定位在不同发育阶段的卵母细胞中。TRIM8基因及其编码的蛋白在早期胚胎中均有表达,但其mRNA表达水平在1-细胞到4-细胞期胚胎中的表达水平显著高于8-细胞到囊胚期胚胎。TRIM8蛋白主要定位在不同时期胚胎的胞质中。TRIM8基因沉默组的囊胚率显著低于对照组(P<0.05)。【结论】TRIM8基因及其编码的蛋白在小鼠各组织及早期胚胎中均有表达,主要定位在早期胚胎的胞质中;沉默TRIM8基因会显著降低囊胚发育率。TRIM8可能参与调控小鼠早期胚胎的发育进程。     

斑马鱼ddx27基因对tp53基因的调控作用

为探究斑马鱼ddx27基因对tp53基因表达的影响,根据NCBI网站在线数据库中分析得到的ddx27基因编码序列（coding sequence,CDS）,利用同源重组技术构建斑马鱼ddx27真核表达载体pCMV-3×Flag-ddx27。通过亚细胞定位试验和蛋白质免疫印迹技术验证ddx27基因的表达,并利用双荧光素酶试验验证ddx27基因的过表达对tp53基因转录活性的影响。结果显示,ddx27 CDS区及阳性克隆的电泳片段大小以及测序比对均与预期结果一致。蛋白质免疫印迹显示Ddx27重组质粒可正常表达,且蛋白大小与预测结果一致。亚细胞定位显示Ddx27蛋白表达于HEK293T细胞的细胞核中。而且,过表达pCMV-3×Flag-ddx27真核表达载体能够显著增强 tp53启动子报告基因载体pGL3-tp53-Luc的活性,为对照组的1.8倍（P<0.05）。以上结果表明,斑马鱼pCMV-3×Flag-ddx27真核表达载体构建成功,能够在哺乳动物的细胞核中表达,且ddx27基因可以促进tp53基因的表达。     

新疆卡拉库尔羊Fas基因原核表达载体的构建及表达

根据GenBank的羊Fas细胞凋亡因子序列设计1对特异性引物，将EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点引入到引物两端，同时加上保护性碱基。利用RT-PCR技术，从新疆卡拉库尔羊外周血淋巴细胞总RNA中扩增出特异性基因片段。将分离纯化后的PCR产物与pMD-18T载体进行连接，利用双酶切反应与菌液PCR对阳性重组克隆进行鉴定筛选，然后进行序列测定。使用原核表达载体pET28a来完成Fas的定向克隆，成功构建重组融合表达质粒pET-28a-Fas，然后将质粒转化至E.coli BL21感受态，设置不同IPTG浓度和诱导温度，选择最佳的表达条件，然后初步纯化重组融合蛋白。结果表明，在pET28a表达载体中，Fas基因的插入方向和读码框均正确；同时Fas基因也完成在E.coli BL21融合表达的目的，融合蛋白分子质量为39.7 ku。     

GhCDPK4基因的克隆和功能分析

为了研究棉花中GhCDPK4基因在响应非生物胁迫中所起的作用,通过PCR的方法克隆GhCDPK4基因,利用基因重组技术,构建植物过表达载体,采用农杆菌介导的叶盘法转化模式植物烟草,分析干旱和盐胁迫处理对转基因烟草表型和生理生化指标的影响。本研究成功克隆了属于棉花CDPK家族的基因GhCDPK4,构建了植物过表达载体pCAMBIA2300-GhCDPK4。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测发现转基因烟草中GhCDPK4基因高水平表达,并且转基因烟草相比于野生型烟草表现出较强的耐旱和耐盐性,其中SOD、POD和CAT活性显著升高,而相对电导率和MDA含量降低。研究结果表明GhCDPK4基因可正向参与应答干旱和盐胁迫。     

新疆野生核桃 JfDREB1A基因的克隆与原核表达分析

为探究 DREB1A基因在新疆野生核桃响应低温胁迫中的作用及表达特性,以新疆野生核桃群体中的‘小矩圆’类型为试验材料,根据同源克隆的方法得到 JfDREB1A基因的cDNA全长序列,利用荧光定量PCR检测其在低温胁迫条件下的表达水平;将该基因片段重组到pET-28a(+)原核表达载体上,转化到大肠杆菌（DE3）感受态细胞中诱导表达。结果表明,获得了新疆野生核桃中的DREB1A,将其命名为 JfDREB1A,该基因的开放读码框长度为645 bp,具有典型的 DREB1/CBF转录因子结构特征,JfDREB1A蛋白与其他植物DREB1蛋白具有高度保守性,与核桃亲缘关系最近。RT-PCR分析显示在4 ℃低温胁迫下, JfDREB1A基因的表达量迅速上调,8 h时达到最大。成功构建了pET-28a-JfDREB1A重组表达质粒,得到大小约为29 ku的融合蛋白,与预测蛋白大小相符,该蛋白在大肠杆菌中最佳诱导条件是诱导剂IPTG浓度为0.5 mmol/L,诱导2 h。     

绵羊MSTN基因慢病毒表达载体的构建及其对成肌细胞的分化作用

【目的】构建新疆细毛羊MSTN基因慢病毒表达载体,研究其在细毛羊成肌细胞分化中的作用,并探讨其作用机制。【方法】采用RT-PCR技术,扩增MSTN编码区序列,克隆入plex-mcs慢病毒表达载体,构建plex-MSTN慢病毒表达载体,并进行酶切及测序鉴定。将plex-MSTN包装成plex-MSTN慢病毒。用酶消化法分离培养新疆细毛羊成肌细胞,慢病毒感染制备MSTN过表达成肌细胞系,通过马血清诱导分化,Western blotting检测分化细胞MSTN基因的表达,免疫荧光分析分化肌管的融合率及肌管直径,Realtime RT-PCR检测分化相关基因的表达。【结果】 克隆的新疆细毛羊MSTN基因编码区全长序列（1 128 bp）与NCBI上公布的序列99.9%同源,仅在外显子2上存在单碱基突变;Western blotting检测结果显示,MSTN过表达成肌细胞过表达MSTN蛋白;免疫荧光检测表明,MSTN过表达成肌细胞的肌管融合率与肌管直径分别为5.69%和12.35 μm,显著低于非转化成肌细胞（10.21%和18.5 μm）（P<0.05）;Realtime RT-PCR结果显示,MSTN过表达成肌细胞中的Myogenin、p21、MyoD-基因表达显著下调,Smad3基因表达极显著上调（P<0.01）。【结论】 成功构建了细毛羊MSTN基因慢病毒表达载体,MSTN基因对细毛羊成肌细胞的分化具有显著的抑制作用,确定了MSTN基因与Myogenin、p21、MyoD及Smad3基因在成肌细胞分化过程中的调控关系。     

牛乳头瘤病毒2型L1基因真核表达载体的构建及真核表达

为在真核细胞中表达牛乳头瘤病毒2型(BPV2)衣壳蛋白L1基因。采用PCR方法从奶牛皮肤肿瘤病料中扩增BPV2沙湾分离株L1基因,克隆入pMD18-T载体中,测序后进行序列分析。以pcDNA 3.1(+)为真核表达载体构建重组表达质粒,转染入BHK-21细胞,通过间接荧光免疫试验检测BPV2-L1蛋白的表达。本研究成功构建pcDNA3.1(+)-BPV2-L1重组真核表达质粒,证实能表达出BPV2-L1蛋白,为BPV2DNA疫苗的研发提供了前期基础。     

表皮葡萄球菌8-32-B 株aap基因domain B的原核表达

为获得表皮葡萄球菌aap基因domain B片段的原核表达产物,采用PCR方法扩增引起新疆南疆地区奶牛乳房炎的表皮葡萄球菌株aap基因domain B片段,并克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组质粒pET-32a(+)-aap,将重组质粒转化至宿主菌E.coli BL21中诱导表达。结果表明,克隆得到aap基因domain B片段为2 316bp,Aap蛋白分子质量184.5ku。在宿主菌E.coli BL21中表达的最佳诱导时间为4h,IPTG最佳诱导浓度为0.75mmol/L;纯化时洗杂缓冲液中咪唑浓度为40mmol/L,洗脱缓冲液中咪唑浓度为200mmol/L时可以获得单一Aap蛋白。     

拟南芥At4g05060基因的酵母双杂交诱饵表达载体的构建、表达及自激活检测

为研究At4g05060基因功能,采用PCR扩增拟南芥VAMP(vesicle-associated membrane protein)家族基因At4g05060的ORF序列,定向克隆至酵母双杂交诱饵表达载体pGBKT7,经酶切鉴定并测序后将其转化至酵母Y187细胞;然后采用Western blotting技术分析At4g05060基因在酵母中的表达水平,通过缺陷型培养基培养进行自激活检测。结果表明,成功构建酵母诱饵表达载体pGBKT7-At4g05060,并在酵母细胞正确表达,表达产物对报告基因无自激活作用。     

OjCHS原核表达载体的构建及重组蛋白的纯化

查尔酮合酶（chalcone synthase,CHS）是类黄酮生物合成过程中的第一个关键酶,也是限速酶,它直接影响并限制类黄酮的合成与积累。在克隆得到日本蛇根草CHS基因（OjCHS）基础上,将该基因插入原核表达载体pET-28a,完成重组表达质粒pET28a-CHS的构建。随后,利用冻融法将上述质粒转入大肠杆菌BL21感受态细胞中用于重组蛋白的表达。选择不同IPTG 浓度、诱导温度及诱导时间对重组菌进行诱导,确定了可溶性重组蛋白的最佳诱导表达条件。最后,通过洗脱、纯化、透析与浓缩完成重组蛋白的纯化。结果显示,成功构建原核表达载体pET28a-CHS,可溶性重组蛋白最佳诱导条件为：IPTG 浓度0.45 mmol·L^-1,25 ℃下诱导12 h。最后大量制备并纯化获得符合预期大小的可溶性蛋白,为深入研究OjCHS的生物学功能奠定了基础。     

解鸟氨酸拉乌尔菌ZK4菊酯农药降解酶基因BioH的克隆及原核表达

为挖掘新的拟除虫菊酯类农药降解基因，在大肠杆菌中实现异源高效表达，以本课题组前期筛选出的降解谱广泛、降解率较高的菌株解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)为研究对象，克隆其菊酯类农药降解酶基因BioH,在大肠杆菌中表达。通过解鸟氨酸拉乌尔菌全序列进行基因组注释、蛋白注释和通路注释，和已有菊酯类农药降解基因序列比对，筛选出潜在的具有菊酯类农药降解功能的基因；以解鸟氨酸拉乌尔菌基因组DNA为模板，根据功能基因序列设计特异性引物进行PCR扩增，回收目的片段后与pMD19-T载体连接，筛选阳性克隆并鉴定；酶切回收目的片段后和pET32a(+)表达载体连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，将验证正确的重组菌经IPTG诱导表达，通过SDS-PAGE分析蛋白表达情况。结果表明：通过筛选得到BioH基因，该基因具有水解酶的作用，同时也具有其他菊酯类农药降解基因序列中存在的保守五肽motif-GXSXG,PCR扩增后得到大小为783 bp的条带，通过重组技术获得阳性克隆，PCR扩增、酶切和DNA测序进行验证，重组菌经0.2 mmol/L IPTG诱导4 h后获得约为...     

山葡萄PAL基因原核表达载体的构建及表达蛋白纯化

山葡萄苯丙胺酸解氨酶（PAL）是苯丙烷途径的关键酶,在果皮着色中能够调控花色苷合成途径。构建PAL基因原核表达重组质粒pET28a-PAL,并对重组蛋白表达条件进行优化,以山葡萄DNA扩增PAL并连接到pMD18-T,筛选得到阳性克隆后连接到pET28a原核表达载体上,重组质粒转化至E.coli BL21后经不同浓度的IPTG、不同诱导温度、不同诱导时间处理,通过DPS设计正交试验优化重组蛋白的表达条件,并将重组蛋白纯化。结果显示,正交试验不同处理下的蛋白表达差异显著（P<0.05）,诱导因素的影响程度从强到弱分别为IPTG浓度、温度和时间。IPTG诱导浓度对其影响最显著（P=0.015<0.05）,且IPTG浓度为0.6 mmol·L^-1,诱导温度为22℃,诱导时间为5 h时,诱导重组蛋白PAL的效果最佳。成功构建其原核表达载体并使其在大肠杆菌中得到高效表达,为探究PAL蛋白的表达提供参考。     

同步抑制棉籽 FAD2 1 与FatB基因表达的RNAi载体构建

采用PCR技术,分别扩增获得靶标基因 FAD2 1 与FatB的功能区域片段426与501 bp,通过PCR引物引入特定的酶切位点,采用DNA标准重组技术与Gateway技术相结合的方法,以表达载体pBI121及RNA干扰载体pANDA35HK为基础,利用种子特异性启动子,成功构建出棉籽特异抑制双基因表达的RNAi载体。     

雪莲类PEBP基因在毕赤酵母中的表达及鉴定

为了构建雪莲类PEBP基因真核表达载体,在毕赤酵母中表达并鉴定.将雪莲类PEBP基因开放阅读框序列克隆到真核表达载体pPIC9k上,转化到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115细胞内,利用筛选到的Muts(methanol utilization slow)重组酵母株进行表达,经SDS-PAGE分析,表达产物置于低温条件下进行抗冻试验.结果在培养基上清液中含有一明显的特异性蛋白条带,大小为20 kD,与预期相符,上清液抗冻检测表明PEBP具有一定的抗冻性,表明该基因在毕赤酵母GS115中得到了表达.该研究成功构建了真核表达载体pPIC9k-PEBP,获得了表达产物,并为进一步研究雪莲类PEBP基因的抗冻功能打下基础.     

新城疫病毒Roakin株HN基因的克隆及真核表达载体的构建

克隆新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)Roakin株HN基因,并构建真核表达载体.应用RT-PCR扩增出NDV Roakin株HN基因,将其克隆入pMD18-T载体,并进行了测序鉴定和HN基因的序列分析.然后分别将NDV的HN基因和选择标记基因-二氢叶酸还原酶(dhfr)基因插入到真核表达载体pCI-neo中,通过PCR扩增、酶切分析和测序分析等鉴定所构建的重组真核表达载体.RT-PCR扩增的NDV Roakin株HN序列与GenBank中标准毒株(登录号AY289000)HN序列同源性为99.8%,构建了HN基因的真核表达质粒pCI-HN-D.成功构建了含有NDV Roakin株HN基因和dhfr基因的真核表达载体.