仔猪黄白痢大肠杆菌耐药性检测及ERIC图谱分析

以47株黄白痢临床分离大肠杆菌为材料,通过Kirby-Bauer法检测细菌耐药表型并用PCR扩增Ⅰ型整合酶基因,进而对不同耐药谱菌株进行以肠杆菌科基因间重复一致序列为引物的聚合酶链反应(ERIC-PCR)基因分型并用统计分析软件SPSS 16.0聚类.耐药表型检测结果显示:47株大肠杆菌均呈多重耐药,共9种耐药表型;Ⅰ型整合子阳性菌株检出率为95.7%(45/47);ERIC-PCR扩增出现稳定可重复的基因指纹图谱,耐9~13种药物菌株(85.1%,40/47)的ERIC指纹图谱分别显示出2种主要谱型,各代表1个猪场的菌株类型.聚类分析提示,相同耐药谱的来自同一猪场和不同猪场分离株的平均相似率分别为68.7%和53.5%,显著高于47株菌的平均相似率37.3%.说明菌株耐药性可能与特定的ERIC指纹图谱相关,ERIC指纹图谱分析可作为考察猪源致病性大肠杆菌多重耐药表型与基因型特征的新视角.     

武汉市市售淡水小龙虾中副溶血性弧菌的分离鉴定及多位点序列分型

采集武汉市各大农贸市场52份小龙虾(即克氏原螯虾,Procambarus clarkii)样品,利用1%氯化钠碱性蛋白胨水(APW)和TCBS对小龙虾样品中副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)进行分离和初步鉴定,用PCR扩增副溶血性弧菌具有种特异性的tl基因来验证疑似菌株。PCR检测方法共检出14株副溶血性弧菌,检出率为26.92%。在小龙虾中分离得到的14株副溶血性弧菌,对其进行基于dna E-gyr Brec A-dtd S-pnt A-pyr C-tna A的多位点序列分型。其中dtd S的多态性位点比例均高于其他6个基因,为5.2%。7个基因串联后将14株副溶血性弧菌分为12个序列型,其中7株序列型未知,分辨力达0.967。可知武汉市市售淡水小龙虾中副溶血性弧菌呈现出较大的多样性。Neighbor-joining系统进化树将分离得到的14株副溶血性弧菌分为2个群,VP2、VP13、VP7和VP14同属一个群,其他10株则属于另外一个群。其中VP13和已知的临床分离株ST3在进化树上表现出较高的亲缘性(69%)。     

环介导等温扩增技术检测克氏螯虾样品中的副溶血性弧菌

建立了环介导等温扩增技术检测副溶血性弧菌的方法。以副溶血性弧菌tlh基因作为靶基因,设计特异性引物,建立了环介导等温扩增(LAMP)检测方法,并分别采用LAMP检测方法和国家标准方法(GB/T4789.7-2008)对克氏螯虾样品中的副溶血性弧菌进行检测。结果表明,建立的LAMP方法最低检出限为1×101 cfu/mL;对6种细菌共8株菌进行LAMP法扩增,仅3株副溶血性弧菌得到阳性扩增。建立的LAMP检测方法与国家标准检测方法检测结果一致,准确度高。     

腹泻仔猪肠道菌群的ERIC-PCR指纹图谱分析

【目的】分析腹泻仔猪周围环境菌群变化规律,为仔猪腹泻的诊断和治疗提供支持。【方法】采集健康对照和腹泻仔猪粪便、口腔以及产床和母猪乳头等样品,采用ERIC-PCR技术分析其菌群结构特征,并对粪便样品中的细菌进行分离和鉴定。【结果】对照组4类样品细菌ERIC-PCR指纹图谱十分相似,腹泻组各类样品之间电泳条带差异较大,出现了异常亮度的电泳条带,与对照组优势条带位置不同,其中口腔和母猪乳头部位电泳条带数显著低于对照组(P0.05),菌群多样性指数降低,优势度指数升高。从粪便样品中分离出2株可疑菌株b1和b2,细菌染色和生化试验初步证明分离株b1和b2分别符合大肠杆菌和奇异变形杆菌的特征;利用ERIC-PCR技术分析分离株b1和b2的指纹图谱,发现分离优势细菌的ERIC-PCR指纹图谱包含于粪便样品的ERIC-PCR图谱中,证明样品的ERIC-PCR指纹图谱能够反映出优势菌群的特征;测序结果显示,分离株b1与大肠杆菌基因组同源性为99%,分离株b2与奇异变形杆菌基因组同源性为98%。【结论】腹泻仔猪周围环境菌群发生明显变化,ERIC-PCR技术可以快速、准确地监测和诊断菌群结构的变化,有助于细菌性仔猪腹泻的诊断和治疗。     

混合培养对副溶血性弧菌致病株和非致病株生长的影响

以9∶1和1∶1的比例对致病性副溶血性弧菌(ATCC 33847:tdh+/trh-/tlh+;ATCC 17802:tdh-/trh+/tlh+)和非致病性副溶血性弧菌(G2:tdh-/trh-/tlh+;G8:tdh-/trh-/tlh+)在TSB培养基和熟虾中分别进行了混合和37℃10 h的混合培养,通过菌落原位杂交技术和PCR技术检测致病性菌株在混合培养前后的比例。结果显示,在TSB和熟虾中,致病菌比例均出现了下降。在熟虾样品中致病菌株下降的比例更高,其中ATCC17802和G8在熟虾样品中以9∶1比例混合并混合培养10 h后,致病菌比例从90%降为0。表明混合培养对致病性副溶血性弧菌菌株生长产生不利的影响,是造成水产样品中副溶血性弧菌感染频发却很难分离到致病性菌株的原因之一。     

腹泻仔猪肠道菌群的ERIC-PCR指纹图谱分析

【目的】分析腹泻仔猪周围环境菌群变化规律，为仔猪腹泻的诊断和治疗提供支持。【方法】采集健康对照和腹泻仔猪粪便、口腔以及产床和母猪乳头等样品，采用ERIC-PCR技术分析其菌群结构特征，并对粪便样品中的细菌进行分离和鉴定。【结果】对照组4类样品细菌ERIC-PCR指纹图谱十分相似，腹泻组各类样品之间电泳条带差异较大，出现了异常亮度的电泳条带，与对照组优势条带位置不同，其中口腔和母猪乳头部位电泳条带数显著低于对照组（P＜0.05），菌群多样性指数降低，优势度指数升高。从粪便样品中分离出2株可疑菌株b1和b2，细菌染色和生化试验初步证明分离株b1和b2分别符合大肠杆菌和奇异变形杆菌的特征；利用ERIC-PCR技术分析分离株b1和b2的指纹图谱，发现分离优势细菌的ERIC-PCR指纹图谱包含于粪便样品的ERIC-PCR图谱中，证明样品的ERIC-PCR指纹图谱能够反映出优势菌群的特征；测序结果显示，分离株b1与大肠杆菌基因组同源性为99%，分离株b2与奇异变形杆菌基因组同源性为98%。【结论】腹泻仔猪周围环境菌群发生明显变化，ERIC-PCR技术可以快速、准确地监测和诊断菌群结构的变化，有助于细菌性仔猪腹泻的诊断和治疗。     

副溶血性弧菌的检测研究

[目的]对toxR进行副溶血性弧菌特异性检测,探讨toxR靶基因能否准确检测副溶血性弧菌,从而消除其他研究者对该基因特异性的疑虑。[方法]采用SN/T1870—2016中副溶血性弧菌toxR的引物探针对副溶血性弧菌和其亲缘关系接近的弧菌标准菌株进行检测。[结果]采用实时荧光PCR方法证实该引物探针只能扩增出副溶血性弧菌,其他弧菌诸如溶藻弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌等未得到扩增。[结论]证实SN/T1870—2016中toxR的引物探针特异性高。该研究可为各检测机构提供数据支持,为副溶血性弧菌的检测与研究奠定更为坚实的基础。     

副溶血性弧菌分子检测与分型研究进展

副溶血性弧菌是一种革兰氏阴性嗜盐菌,常通过食用被该菌污染的食品导致食物中毒。该文综述了副溶血性弧菌的分子检测技术如PCR、环介导等温扩增、免疫捕获等,及分型技术如RAPD-PCR、ERIC-PCR、PFGE、核糖体分型、RFLP等,这些方法将为副溶血性弧菌食物中毒提供重要的检测与分型手段,对预防与控制副溶血性弧菌食物中毒具有重要意义。     

PMA在副溶血性弧菌检测中的应用

在我国,副溶血性弧菌被认为是海产品衍生疾病的主要因素,因此急需一种能快速、灵敏、特异、准确地检测食品中副溶血性弧菌的方法。传统培养法一直是检测的金标准,但是其检测周期较长;分子生物学方法如聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR(qPCR)、环介导等温扩增技术(LAMP)已被广泛用于食品中副溶血性弧菌的检测,但是这些方法不能区分死菌和活菌的DNA,容易造成假阳性。而叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,简称PMA)等核酸染料的使用可以有效地消除这一弊端。研究者们将PMA处理与PCR(qPCR)结合,应用于食品中多种食源性致病菌活菌的检测,但是关于PMA在副溶血性弧菌检测中应用的报道并不多见。因此,拟对PMA应用于食品中副溶血性弧菌检测的可行性进行分析,以便为进一步开展相关研究提供参考。     

湛江市海水鱼中副溶血性弧菌的分离 鉴定及致病性分析

为了解湛江市海水动物副溶血性弧菌的带菌感染率及其致病性,从湛江市水产品市场随机采集海水鱼样品30份,根据中华人民共和国国家标准和进出口标准规定的副溶血性弧菌的检验方法,结合科玛嘉弧菌显色培养基分离试验,对采集样品进行了副溶血性弧菌的分离与鉴定;并用神耐川试验、溶血试验和脲酶试验检测了分离菌株的致病性。结果显示：30份海水鱼样品分离得到10株副溶血性弧菌,检出率为33.33%。其中,神耐川试验溶血强阳性5株,弱阳性2株,阴性3株;在3.5%NaC l兔血琼脂平板上,本试验分离到的10株副溶血性弧菌均呈现较强溶血作用;10株分离菌株脲酶试验均为阴性。     

福州市售水产品中副溶血性弧菌污染状况调查

调查福州市售水产品中副溶血性弧菌的污染状况,预防由水产品引起的食源性疾病的发生,并为食品安全监管部门提供参考。随机采集360份市售水产品,按照国家标准(GB 4789.7-2013 《食品微生物学检验》)进行副溶血性弧菌的分离培养,采用全自动微生物鉴定仪VITEK 2Compact鉴定,并用多重荧光PCR方法进行毒力基因检测。360份样品中共检出115株副溶血性弧菌,阳性检出率为31.94%。其中鱼类检出率31.67%,贝类检出率42.50%,甲壳类检出率21.67%。农贸市场采集的水产品副溶血性弧菌检出率显著高于超市(P=0.0030.01,χ2=8.637)。7月份至9月份副溶血性弧菌的阳性检出率处于高峰,12月份、1月份至3月份阳性检出率处于低谷。毒力基因tlh携带率为100%,tdh携带率为29.57%。福州市售水产品都不同程度地受到副溶血性弧菌污染,建议食用时进行彻底加热烹煮,同时避免不同种类水产品间的交叉污染,降低感染的可能性。     

利用PCR技术快速检测水产品中副溶血性弧菌

[目的]对副溶血性弧菌的检测进行研究。[方法]采用聚合酶链式反应（PCR）,以标准菌株（单增李斯特菌、哈氏弧菌）作为阴性对照对3株副溶血性弧菌进行特异性扩增,扩增引物采用副溶血性弧菌如基因中的tlh-3和tlh-4,同时利用PCR对人工污染的白对虾中的副溶血性弧菌进行检出限测定。[结果]结果表明,通过PER扩增,副溶血性弧菌在约449bp处扩增出特异性条带,单增李斯特菌、哈氏弧菌均未出现任何条带,扩增片段表现出极好的特异性。菌液稀释到3．3×10^2cfu／ml时,将其污染到白对虾中作PCR仍可扩增出目的片断。[结论]该研究表明PER检测方法快捷、特异性好、敏感性高,可以作为副溶血性弧菌辅助检测方法。     

复合探针实时荧光PCR技术快速检测海产品中 副溶血性弧菌方法的建立

副溶血性弧菌是一种食源性致病菌,海产品和其制品海鲜酱油等最容易被副溶血性弧菌污染,而副溶血性弧菌寄生于鲜虾、海鲜酱油等复杂的食品基质中有时却很难被检测出。以快速检测食品中的副溶血性弧菌为目的,针对副溶血性弧菌的tlh基因,设计引物和复合探针,采用实时荧光PCR方法检测鲜虾和海鲜酱油中的副溶血性弧菌,得出以下结论,该方法检测副溶血性弧菌具有较强的特异性和灵敏度,当鲜虾(固体)中的样品菌含量为10~3cfu·g~(-1)或海鲜酱油中的样品菌含量为10~3cfu·m L~(-1)时,无需增菌培养,即可快速检出。增菌6~8 h即可检出鲜虾(固体)或海鲜酱油(液体)的1cfu的副溶血性弧菌。     

南美白对虾养殖底泥细菌多样性研究

【目的】研究南美白对虾养殖池一个养殖周期的底泥细菌多样性,为指导水产养殖提供参考。【方法】于2011年7-9月,采集上海市金山区水产养殖基地南美白对虾养殖池塘的底泥,提取底泥中细菌的总DNA,扩增细菌16SrDNA的V3可变区,采用DGGE指纹图谱技术以及基因测序技术,对该养殖周期的底泥细菌多样性进行研究。【结果】不同月份虾池底泥中存在一定数量的共有优势菌群,7月和8月的共有优势菌群分别为黄杆菌属和绿弯菌门细菌,8月和9月共有优势菌群为梭菌属细菌,7月份和9月份共有优势菌群为拟杆菌门细菌和硫酸盐还原菌;同时,7-9月底泥中还各自分布有除硫单胞菌属、蛭弧菌属、δ-变形菌门、酸杆菌门、厚壁菌门、聚球藻属等细菌。【结论】南美白对虾养殖底泥中细菌多样性丰富。     

虾源副溶血弧菌致病基因检测与ERIC-PCR分型

为了监测上海市养殖对虾中副溶血弧菌致病基因的携带情况及潜在致病株流行情况,采用PCR方法对上海地区不同对虾养殖单位中分离获得的19株副溶血弧菌分离株及1株标准菌株进行6种致病基因的检测筛查,并采用ERIC-PCR方法进行基因分型分析。结果发现:19株副溶血弧菌中未检测出携带tdh、ORF8基因,只有1株携带trh基因,而tox RS/new基因携带率较高,19株中有14株检出阳性,基因携带率为73.7%。对能够引起对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)的副溶血弧菌特异性质粒基因的检测中发现,AP1和AP2基因均有3株检测出阳性,基因携带率均为15.8%。通过ERIC-PCR分型技术将20株副溶血弧菌分成7个不同的类群,其分辨力指数DI值为0.811,表明ERIC-PCR具有较好的基因分型能力,分型结果发现该方法能够有效区分不同时间段获得的菌株,而对不同地理位置获得的菌株区分并不明显。以上结果表明从养殖对虾中分离得到的副溶血弧菌致病基因携带率总体偏低,但存在一定的流行风险,需要防范一些新的致病株的流行,这些可以为对虾养殖单位中副溶血弧菌致病流行株的预防控制提供相关参考。     

实时定量PCR法快速检测水产品中的副溶血性弧菌

副溶血性弧菌是一种广泛存在于水产品中的食源性致病菌,可污染食物,引起严重的食物中毒。利用实时定量PCR方法建立一种快速检测水产品中副溶血性弧菌的方法,根据随机扩增多态性分析(RAPD)鉴定特异性片段,设计特异性引物。采用建立的实时定量PCR方法检测市售水产品20份,检出阳性食品6份,最小检测灵敏度为50 fg DNA,与传统微生物检测结果相比无显著差异。该检测方法特异性强,灵敏度高。     

差状态活品虾夷扇贝电子鼻指纹图谱的建立

以活品虾夷扇贝为研究对象,研究了采用金属氧化物传感器电子鼻检测虾夷扇贝在常温干露条件下挥发性气味特征与其存活状态的相关性,从而建立了差状态电子鼻指纹图谱。主成分分析能够将A～I批虾夷扇贝进行分类,同一批样品能够很好地聚集在一起,不同批次样品根据其样品的气味品质进行聚类,最后3批样品在散点图中分布非常集中,根据其存活率,将最后3批作为差状态模板建立指纹图谱。通过将未知待测样品T、N与差状态指纹图谱的相似性分析,结果发现它们和差状态指纹图谱与D、E样品之间的标准欧式距离和相关系数指数都比较接近,这与待测样品T、N的存活状态是一致的,表明通过建立活品虾夷扇贝差状态指纹图谱能够对未知待测样品的品质进行判别和评价。     

水稻种质资源指纹与多样性分析的分子标记体系研究

应用2个抗性基因同源序列(RGA)标记:C-末端富亮氨酸重复序列(CLRR)与核糖核酸酶抑制因子亮氨酸重复序列(RLRR),及2个Seoulin研究所生命科学通用引物标记(SRILS):SRILS6与SRILS8,通过这4个分子标记所产生的指纹图谱,菲律宾国家水稻所水稻种质资源库中265个地方品种的遗传差异及亲缘关系得到了确立。DNA指纹图谱结果显示,引物CLRR分辨能力最高,共扩增出了48条多态带,平均每个品种28.6条,因而是快速DNA指纹图谱分析最有效的标记。从群体整体水平上来看,RGA与SRILS两套引物对265份材料的平均多态带率分别为60.6%与60.5%,表明两种标记体系具有相似的多态性检测能力。根据4个引物的DNA指纹谱带数据,进行单个及合并聚类分析,计算出7个极为相似的聚类系统树图:将样品主要聚成两个大类群,类群Ⅰ与Ⅱ。聚类分析的结果表明,RGA与SRILS标记体系各自均能完全鉴别出所有265个品种,而且揭示了一个相对高的群体遗传多样性。7个聚类系统树图的聚类分布以及类群的组成均极为相似,有88%～97%的相似度,这说明采用的RGA及SRILS引物扩增的基因组区域可能已经发生了一定程度的变异以致表现出高度一致的遗传系谱。     

香菇挥发性风味成分的气相色谱-离子迁移谱分析

利用气相色谱-离子迁移谱(gas chromatography-ion mobility spectrometry,GC-IMS)技术分析不同香菇干样挥发性组分的指纹图谱。根据离子迁移数据利用热图聚类和主成分分析不同样品间的差异。热图聚类分析可将27份香菇材料分为2大类;PCA分析表明,前2个主坐标的方差贡献率分别为30.2%和26.9%。结果表明气相色谱偶联离子迁移谱技术对构建香菇挥发性物质指纹图谱及挥发性组分数据库具有潜在的应用价值。     

基于Seoulin研究所生命科学通用引物标记的水稻种质资源快速DNA指纹图谱分析

用两个Seoulin研究所生命科学通用引物标记即SRILS6与SRILS8,通过建立相应的指纹图谱,对菲律宾国家水稻所水稻种质资源库中265个地方品种的遗传亲缘关系进行了分析。DNA指纹图谱结果显示,两个引物在整个群体材料中共扩增出了55条多态带,每个品种平均33.3条,而平均多态带率达60.5%。根据两个引物的DNA指纹谱带数据,进行单个及合并聚类分析,计算出3个极为相似的聚类系统树图:将样品主要聚成两个大类群,类群Ⅰ与Ⅱ。聚类分析的结果表明,两个SRILS标记便能完全鉴别出所有265个品种,而且揭示了一个相对高的群体遗传多样性。3个聚类系统树图的聚类分布以及类群的组成均极为相似,有91%~95%的相似度,这说明SRILS引物扩增的基因组区域可能已经发生了一定程度的变异以至于表现出高度一致的遗传系谱。SRILS分子标记体系可成为水稻种质资源快速指纹图谱及多样性分析的理想工具,因而是水稻资源管理方面的重要助手,如进行资源鉴定、生物多样性分析以及核心种质构建等。