绵羊GDF9基因G1突变可视化检测方法的建立

为了建立快速可视化检测绵羊生长分化因子9基因(Growth differentiation factor 9,GDF9)G1突变的方法,针对绵羊GDF9基因G1突变设计扩增阻滞突变系统(Amplification refractory mutation system,ARMS)特异性引物,并在其下游引物3′端的第2—4位碱基处设计额外的错配以筛选特异性最佳的引物对,将改良的ARMS与核酸染料SYBR GreenⅠ结合,可视化检测GDF9基因G1突变。结果显示,改良的ARMS特异性引物能够区分突变型和野生型,通过整合改良的ARMS与SYBR GreenⅠ可视化检测G1突变,发现已知突变型样本显示亮绿色,而已知野生型样本显示橙黄色,两者颜色变化明显。采用建立的可视化检测绵羊GDF9基因G1突变的方法检测25个小尾寒羊样本,结果表明,该方法能够准确区分绵羊GDF9基因G1突变的野生型和突变型,其检测结果与测序结果相符,准确度高达100%。可见,建立的可视化检测方法可用于检测绵羊GDF9基因G1突变。     

宁夏滩羊·小尾寒羊及滩寒杂交群体BMP15基因和GDF9基因多态性研究

[目的]研究宁夏滩羊、小尾寒羊及杂交群体的骨形态发生蛋白15（BMP15）和生长分化因子9（GDF9）基因多态性,为宁夏滩羊的保种及育种工作提供科学依据。[方法]以宁夏滩羊、小尾寒羊及滩寒杂交群体为研究对象,分别设计2对引物,采用PCR-RFLP方法和PCR-SSCP检测方法,检测BMP15基因和GDF9基因在宁夏滩羊、小尾寒羊及滩寒杂交群体中的多态性。[结果]BMP15基因的2对引物扩增结果的RFLP分析表明,不存在多态性位点;GDF9基因的2对引物扩增片段的SSCP分析结果表明,只有引物1扩增片段存在多态性位点,但未发现碱基序列发生改变。[结论]GDF9基因可能是控制小尾寒羊多胎性能的1个主效基因或是与之存在紧密遗传连锁的分子标记。     

日本白鲫BMP15和GDF9基因片段的克隆及组织表达分析

根据斑马鱼GDF9、BMP15基因的保守序列设计引物,采用RT PCR方法扩增获得日本白鲫GDF9、BMP15基因片段。日本白鲫GDF9基因片段长778 bp,编码145个氨基酸;BMP15基因片段长811 bp,编码270个氨基酸。氨基酸序列分析表明日本白鲫GDF9与斑马鱼的同源性最高,为78%,与其他物种的同源性在58%~78%之间;日本白鲫BMP15与斑马鱼同源性最高,为80%,与其他物种的同源性在30%~80%之间。系统进化树分析显示,鱼类的GDF9基因独立聚成一支,其中日本白鲫的GDF9基因与斑马鱼的GDF9基因聚成一支;鱼类的BMP15基因独立聚成一支,其中日本白鲫的BMP15基因与斑马鱼的BMP15基因聚成一支。半定量PCR结果显示,BMP15 mRNA在脾脏、肝脏、鳃、脑、心脏、肌肉、肾脏、卵巢中均有表达,其中卵巢中表达量最高;GDF9 mRNA在肝脏、脑、心脏、肌肉、卵巢中均有表达,而在脾脏、鳃、肾脏中表达量极低或不表达,在卵巢中表达量最高,为进一步研究日本白鲫GDF9与BMP15基因的结构与功能奠定了基础。     

湘东黑山羊GDF9B基因的克隆与测序分析

提取湘东黑山羊基因组DNA,根据绵羊基因组序列设计4对引物扩增湘东黑山羊GDF9B基因,并进行克隆测序分析,结果表明:克隆的山羊GDF9B基因包含外显子1～2序列和部分内含子,序列登录号分别为AY968810、AY947812.将湘东黑山羊GDF9B基因外显子1的序列与绵羊同区域同源性为99.1%;外显子2的序列与绵羊同区域同源性为98.2%.     

不同哺乳动物GDF9密码子偏性及聚类分析

为更好地认识哺乳动物GDF9基因在长期进化过程中为适应环境形成的密码子使用模式,通过Codon W软件计算不同哺乳动物GDF9基因的密码子偏性指标,利用SPSS软件对密码子偏好性影响因素的相关性进行分析,结合密码子偏性和最小进化法分析其亲缘关系。GCT、TGT、TTT、ATT、CCT、AGA、ACT为哺乳动物GDF9基因的最优密码子,该基因偏爱使用以A或T结尾的密码子;G、C含量和蛋白质亲水性是影响GDF9基因密码子偏性的主要因素;聚类分析提示不同哺乳动物间的同源性越高,GDF9基因密码子使用特征的相似性越高。     

绵羊GDF9基因FecTT突变检测

FecTT是冰岛Thoka绵羊GDF9基因外显子2编码区1279位发生的A→C突变(A1279C),导致编码GDF9蛋白C末端成熟肽第109位丝氨酸改变为精氨酸(S109R),该突变纯合子母羊不育,杂合子母羊产羔数比野生型多0.6只。本研究采用PCR-RFLP方法分析了GDF9基因FecTT突变在小尾寒羊、洼地绵羊、湖羊、考力代、白萨福克、黑萨福克、东弗里生、杜泊绵羊、特克塞尔、多赛特和中国美利奴11个绵羊品种中的分布。结果表明在11个绵羊品种中都没有检测到GDF9基因的FecTT突变,提示GDF9基因影响Thoka绵羊高繁殖力的FecTT突变对以上11个绵羊品种的繁殖力均没有显著影响。     

五个山羊品种GDF9基因部分片段的多态性分析

以影响Belclare羊和Cambridge羊高产性能的生长分化因子9基因(GDF9)的FecGH突变片段作为候选基因,采用PCR-RFLP方法研究其在麻城黑山羊、宜昌白山羊、马头山羊、南江黄羊、波尔山羊5个品种中的多态性,结果未在5个山羊品种中检测到GDF9的FecGH突变,说明所检测的GDF9片段序列比较保守。     

4个山羊品种GDF9、BMP15、FSHR基因的多态性分析

采用RFLP和SSCP 2种方法研究了生长分化因子9(GDF9)基因、骨形态发生蛋白15(BMP15)基因和促卵泡素受体(FSHR)基因在河北绒山羊、美姑黑山羊、承德黑山羊、河南槐山羊4个山羊品种中的多态性.结果显示,在4个山羊品种中未检测到GDF9的突变位点;BMP15基因出现1处突变位点(890 bp处,G→T),但未引起基因型改变;FSHR基因出现3种基因型HH、HK、KK,存在1处突变位点(1 568 bp处,C→G).河南槐山羊Hardy-Weinberg不平衡,且为中度多态.表明检测的FSHR基因在4个山羊品种中存在多态性.     

山羊生长分化因子9基因外显子2 的PCR-SSCP分析

【目的】寻找与产羔数相关的遗传标记，为山羊高繁殖力的标记辅助选择提供科学依据。【方法】以控制Belclare绵羊和Cambridge绵羊高繁殖力的生长分化因子9（growth differentiation factor 9, GDF9）基因为候选基因，根据绵羊GDF9基因序列设计4对引物，采用PCR-SSCP技术检测GDF9基因外显子2在高繁殖力山羊品种(济宁青山羊)以及低繁殖力山羊品种(波尔山羊、文登奶山羊、辽宁绒山羊、北京本地山羊)中的单核苷酸多态性，同时研究该基因对济宁青山羊高繁殖力的影响。【结果】山羊与绵羊的GDF9基因外显子2核苷酸序列同源性为99%(955/965)。引物1和引物4存在多态性。对于引物1扩增片段，5个山羊品种均检测到AA、AB和BB 3种基因型，测序分析发现外显子2第26 bp处有1个G→A的单碱基突变，但没有引起氨基酸改变；济宁青山羊A等位基因频率为0.9128，B等位基因频率为0.0872；AA基因型济宁青山羊产羔数最小二乘均值比AB基因型的多0.54只(P<0.01)，比BB基因型的多0.63只(P<0.01)。对于引物4扩增片段，5个山羊品种均检测到CC、CD和DD 3种基因型，测序分析发现外显子2第792 bp处有1个G→A的单碱基突变并且导致缬氨酸改变为异亮氨酸；济宁青山羊C等位基因频率为0.9266，D等位基因频率为0.0734；CC基因型济宁青山羊产羔数最小二乘均值比CD基因型的多0.57只(P<0.01)，比DD基因型的多0.62只(P<0.01)。【结论】初步表明GDF9基因可能是控制济宁青山羊多胎性能的一个主效基因或是与之存在紧密遗传连锁的分子标记。     

德国肉用美利奴羊BMPR-IB、BMP15和GDF9基因10个突变位点的多态性检测分析

以影响不同绵羊品种产羔数的BMPR-IB、BMP15和GDF9基因作为候选基因,采用连接酶检测反应(LDR)法,检测10个突变位点在德国肉用美利奴羊上的多态性及其对产羔数的影响。结果表明:在德国肉用美利奴羊中未发现BMPR-IB基因的FecB突变和BMP15基因的FecXI、FecXB、FecXL、FecXH、FecXG、FecXR突变及GDF9基因的FecGH(G8)、FecTT突变,但在GDF9上检测到G1突变,该突变处于Hardy-Weinberg平衡状态,达到中度多态水平,但其多态性与产羔数无显著性相关。     

生长分化因子9在兔卵巢中的免疫组织化学定位

［目的］探讨生长分化因子9（GDF9）在兔卵巢卵泡发生过程中的调控机制。［方法］采用免疫组织化学方法测定GDF9蛋白在兔卵巢中的表达定位情况。［结果］GDF9在原始卵泡中没有表达;在初级卵泡、次级卵泡和有腔卵泡卵母细胞及有腔卵泡颗粒细胞、透明带及卵泡液中均检测到GDF9蛋白;在黄体中也有GDF9的表达。［结论］GDF9不仅是卵母细胞分泌因子,而且是颗粒细胞的分泌因子,其表达随兔卵巢中卵泡发生呈时空动态变化,在兔卵巢卵泡发生过程中发挥了重要作用,参与了黄体活动的调节。     

绵羊高繁殖力候选基因GDF9的多态性分析

为寻找与绵羊产羔数相关的分子遗传标记,根据生长分化因子9(GDF9)基因序列设计引物,采用PCR-SSCP技术检测GDF9基因突变位点的多态性,研究不同基因型和小尾寒羊产羔数间的相关性.检测结果表明:小尾寒羊、白萨福克和特克赛尔绵羊都检测出AA、AB和BB 3种基因型,而在藏羊中只检测到AA、AB 2种基因型.测序结果表明,BB型为突变纯合型,其外显子2的75个碱基发生了C→T的突变(G2突变),没有引起氨基酸的改变,为沉默突变.小尾寒羊产羔数的最小二乘均值关系为AB>AA>BB,但3种基因型间差异不显著(P>0.05).GDF9基因的G2突变对小尾寒羊高繁殖力没有显著影响.     

安徽白山羊、波尔山羊GDF9和BMP15基因的RFLP分析

以绵羊高繁殖性能主效基因,生长分化因子9(growth differentiation factor 9,GDF9)和骨形态发生蛋白15(bone morphogenetic protein 15,BMP15)基因为候选基因,采用PCR-RFLP方法检测其在安徽白山羊、波尔山羊中的多态性。结果表明,均未能检测至GDF9基因的G8突变(C→T)及BMP15基因的B4突变(G→T)。这2个山羊群体中均为野生型,由此表明这2个候选基因检测位点在安徽白山羊、波尔山羊中没有多态性。     

绵羊BMP15和GDF9基因多态性与产羔性能间的关系

本研究采用PCR-RFLP和PCR-SSCP技术分别对骨形态发生蛋白15（BMP15）基因FecXG突变和FecXL突变、生长分化因子9（GDF9）基因外显子Ⅰ、外显子Ⅱ部分核苷酸多态性及其与小尾寒羊、中国美利奴（新疆型）绵羊多胎品系、肉用品系、体大品系、萨福克、无角陶赛特、中国美利奴（新疆型）和德国肉用美利奴产羔数间的关系进行了分析,结果发现：（1）利用PCR-RFLP技术分析了小尾寒羊等8个品种BMP15 FecXG突变,在该位点未发现多态性;（2）利用PCR-SSCP技术分析了小尾寒羊等8个品种BMP15 FecXL所在区域的多态性,在BMP15基因存在G1047A转换,但并不引起BMP15氨基酸序列的改变,该突变与FecXL（G962A）不同,是在BMP15中新发现的一个突变。G1047A突变对小尾寒羊等7个品种的平均产羔数无显著影响;（3）在小尾寒羊等8个群体的GDF9外显子Ⅰ均未发现多态性;（4）在小尾寒羊等8个群体中发现存在G4突变,该突变对绵羊平均产羔数均无显著影响。以上结果提示：上述2个基因的4个分析区域不宜用于小尾寒羊等7个品种绵羊多羔性状的分子标记位点。     

湖羊GDF9基因多态性和产羔性能的关系

[目的]研究湖羊GDF9基因多态性和产羔性能的关系。[方法]以湖羊为试验对象,对湖羊GDF9基因做PCR-SSCP多态性检测,分析多态性对湖羊产羔性能的影响。[结果]检测出3种基因型,定义为GG、AG、AA。基因型测序显示,在152 bp处发生了A被G碱基替换而发生突变。GG基因型频率、AG基因型频率和AA基因型频率分别为0.107、0.883和0.010。湖羊GG、AG和AA基因型的第1,2胎平均产羔数分别为2.068、2.025和1.500。3种基因型对第1胎产羔数没有影响;第2胎产羔数GG、AG与AA之间有显著性差异,表明GDF9基因对湖羊第2胎产羔数有影响。从第1、2胎的平均产羔数来看,差异不显著,但GG和AG基因型的产羔数相对AA基因型较高。[结论]GDF9基因对绵羊正常的繁殖是必需的,且该基因对湖羊产羔数有一定影响。     

AREG对绵羊卵丘细胞葡萄糖代谢的影响

为研究双调蛋白(AREG)对绵羊卵丘细胞(Cumulus cells,CCs)葡萄糖代谢的影响,采集来源于中腔卵泡和小腔卵泡的卵丘-卵母细胞复合体(COCs),利用荧光定量PCR检测中、小腔卵泡卵丘细胞葡萄糖代谢相关基因表达;添加AREG进行卵丘细胞的体外培养和卵母细胞的体外成熟(IVM),检测卵丘细胞的增殖,测定培养液或细胞中的葡萄糖、乳酸、NADPH和ATP含量。结果表明:1)来源于小腔卵泡的卵丘细胞G6PDH、PFKL和PFKM的mRNA表达量以及细胞增殖能力显著低于中腔卵泡卵丘细胞(P<0.05);2)较低浓度(10 ng/mL)的AREG显著提高了中腔卵泡卵丘细胞的增殖能力(P<0.05)而对小腔卵泡卵丘细胞无影响(P>0.05),在生长分化因子9(GDF9)和骨形态发生蛋白15(BMP15)的协同作用下,10 ng/mL AREG可以显著提高两者的增殖能力(P<0.05)且两者间差异不显著(P>0.05);3)在GDF9和BMP15的协同作用下,AREG可显著提高不同直径腔卵泡卵丘细胞培养液中的葡萄糖消耗、乳酸生成、NADPH生成以及细胞中的ATP含量(P<0.05);4)小腔卵泡卵母细胞的IVM培养液中添加AREG+GDF9+BMP15,显著提高培养液中的葡萄糖消耗、乳酸生成及卵丘细胞中的ATP含量(P<0.05)且显著高于中腔卵泡(P<0.05),显著提高了卵母细胞中的NADPH生成及ATP含量(P<0.05)且与中腔卵泡卵母细胞组差异不显著(P>0.05)。综上,在GDF9和BMP15的协同作用下,AREG可以增强绵羊卵丘细胞的葡萄糖代谢,并且对进行IVM的小腔卵泡COCs添加AREG+GDF9+BMP15可使其葡萄糖代谢达到中腔卵泡的水平。