TAIL-PCR方法克隆约氏黄杆菌aroA基因序列（摘要）

[目的]研究草鱼烂鳃病病原约氏黄杆菌芳香氨基酸代谢途径的合成基因aroA基因的全序列。[方法]以草鱼烂鳃病病原M165菌株基因组DNA为模板,分别利用5′和3′的3个特异性巢式引物与随机引物,通过热不对称交错PCR（TAIL-PCR）扩增菌株M165的aroA序列基因,并对其序列进行分析。[结果]电泳检测结果表明,扩增产物与预期扩增结果相符;测序结果分析表明,aroA基因序列全长1230bp,编码410个氨基酸。aroA蛋白序列与Flavobacterium johnsoniae的aroA蛋白质序列,具有高度同源性。[结论]TAIL-PCR方法为基因全序列的克隆提供了一种简便、高效的方法。aroA基因全序列的获得为进一步阐明aroA等营养相关因子对鱼类烂鳃病病原的致病力的影响奠定基础。     

银龙鱼烂鳃病病原的分离和鉴定

[目的]对患烂鳃病银龙鱼开展病原分离和鉴定。[方法]采用人工回归感染试验确定分离菌株的致病性,利用生理生化试验和16S r DNA基因序列分析对病原菌进行鉴定。[结果]分离菌株YY-2017-3对斑马鱼具有致病性,其生理生化试验结果与柱状黄杆菌相一致;YY-2017-3菌株的16S r DNA基因序列与柱状黄杆菌聚为一支,对多种药物显示耐药。[结论]菌株YY-2017-3被鉴定为柱状黄杆菌,这是柱状黄杆菌引起银龙鱼烂鳃病在国内的首次报道。     

巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因的克隆和分析(英文)

[目的]获得巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因cDNA全长序列。[方法]以巴夫杜氏藻cDNA为模板,采用简并引物进行PCR扩增,获得533 bp特异cDNA片段。在此基础上,设计特异引物,采用5′-GenomeWalking和3′-RACE的方法,获得基因的5′-端DNA序列和3′-端cDNA序列,进而获得β-肌动蛋白基因cDNA全长序列。[结果]获得了巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因的特异cDNA片段、5′-端DNA和3′-端cDNA片段。经拼接后,扩增出全长cDNA。β-肌动蛋白基因cDNA全长1 754 bp,包括1 137 bp的开放读码框和617 bp的3′-非翻译区序列。氨基酸序列相似性分析发现,巴夫杜氏藻β-肌动蛋白氨基酸序列与杜氏盐藻、莱茵衣藻等的同源性较高。系统发育分析表明,巴夫杜氏藻β-肌动蛋白与杜氏盐藻的相似性最高。[结论]首次获得了巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因cDNA全长序列并发现巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因非常保守。     

巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因的克隆和分析

[目的]获得巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因cDNA全长序列。[方法]以巴夫杜氏藻cDNA为模板,采用简并引物进行PCR扩增,获得533 bp特异cDNA片段。在此基础上,设计特异引物,采用5′-GenomeWalking和3′-RACE的方法,获得基因的5′-端DNA序列和3′-端cDNA序列,进而获得β-肌动蛋白基因cDNA全长序列。[结果]获得了巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因的特异cDNA片段、5′-端DNA和3′-端cDNA片段。经拼接后,扩增出全长cDNA。β-肌动蛋白基因cDNA全长1 754 bp,包括1 137 bp的开放读码框和617 bp的3′-非翻译区序列。氨基酸序列相似性分析发现,巴夫杜氏藻β-肌动蛋白氨基酸序列与杜氏盐藻、莱茵衣藻等的同源性较高。系统发育分析表明,巴夫杜氏藻β-肌动蛋白与杜氏盐藻的相似性最高。[结论]首次获得了巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因cDNA全长序列并发现巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因非常保守。     

斑点叉尾鮰烂鳃病病原柱状黄杆菌的分离及鉴定

[目的]对从斑点叉尾鮰烂鳃病中分离的病原菌进行分类学地位鉴定。[方法]采用人工感染确定其病原性,常规生理生化鉴定和16SrRNA基因序列分析方法进行分析。[结果]该菌株为革兰氏阴性杆菌,滑行运动,无鞭毛,菌体大小为(0.3～0.5)μm×(5～10)μm,过氧化氢酶反应阳性,不能发酵和利用葡萄糖等多糖,不水解酪氨酸,不产生吲哚。所测16SrRNA基因序列经BLAST分析表明,与GeneBank上登录的柱状黄杆菌的16SrRNA序列同源性最高,其相似性达98.2%。基于16SrRNA基因序列构建的系统进化树表明,菌株GHS061212与柱状黄杆菌(AY841899)聚为1个分支,且置信度较高,为71.0%。[结论]菌株GHS061212被鉴定为柱状黄杆菌,这是国内首次报道斑点叉尾鮰烂鳃病病原为柱状黄杆菌。     

地黄肌动蛋白基因片段的克隆与序列分析

[目的]克隆与分析地黄肌动蛋白基因片段。[方法]根据与地黄相近物种肌动蛋白基因序列的保守区设计兼并引物,通过RT-PCR方法扩增地黄编码区肌动蛋白基因。[结果]扩增片段全长为724 bp,对应编码240个氨基酸。序列比对分析发现其与其他高等植物肌动蛋白基因核苷酸序列同源性在80%以上,氨基酸序列在90%以上。[结论]系统进化分析表明,扩增到的地黄肌动蛋白基因与烟草actin7基因有较近的亲缘关系。     

PolyI：C体外诱导草鱼PKR基因的克隆与表达

[目的]克隆草鱼的PKR基因,为草鱼抗病毒基因研究奠定基础。[方法]依据GenBank上斑马鱼（AJ852023.1）和鲫鱼（AY293929.1）的PKR基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计了3对简并引物; 采用100μg/ml PolyI：C体外分别处理草鱼肾细胞（Ctenopharyngodon indellus kidney cells,CIK）12、36、48h,并提取处理后细胞的总RNA,逆转录后用降落PCR方法扩增这3个处理时间细胞中 PKR 基因。[结果]处理12h时未扩增出PKR基因,处理36和48h时都扩增到了PKR基因,并且表达量随处理时间的增加有所升高,扩增到的部分序列与鲫鱼和斑马鱼的该段序列同源性分别为100.00%和81.48%。[结论]试验成功获得了草鱼PKR基因的部分序列,PolyI：C高效诱导草鱼PKR蛋白表达将有助于开创治疗草鱼类病毒病的一种新思路。     

PolyI：C体外诱导草鱼PKR基因的克隆与表达

[目的]克隆草鱼的PKR基因,为草鱼抗病毒基因研究奠定基础。[方法]依据GenBank上斑马鱼（AJ852023.1）和鲫鱼（AY293929.1）的PKR基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计了3对简并引物;采用100μg/ml PolyI：C体外分别处理草鱼肾细胞（Ctenopharyngodon indellus kidney cells,CIK）12、36、48 h,并提取处理后细胞的总RNA,逆转录后用降落PCR方法扩增这3个处理时间细胞中PKR基因。[结果]处理12 h时未扩增出PKR基因,处理36和48 h时都扩增到了PKR基因,并且表达量随处理时间的增加有所升高,扩增到的部分序列与鲫鱼和斑马鱼的该段序列同源性分别为100.00%和81.48%。[结论]试验成功获得了草鱼PKR基因的部分序列,PolyI：C高效诱导草鱼PKR蛋白表达将有助于开创治疗草鱼类病毒病的一种新思路。     

洋葱对草鱼细菌性烂鳃病的治疗效果试验

[目的]探讨洋葱对草鱼细菌性烂鳃病的治疗效果。[方法]在试验室内、人工控制条件下,通过对患典型细菌性烂鳃病的草鱼采取口服和泼洒相结合的方法,治疗1个疗程疗程。[结果]洋葱不同用药浓度对患病草鱼治愈率不同,其中口服法以药饵在饲料添加为1.0%~2.0%,遍洒法以药物浓度为2.0~5.0 g/m3时效果较好,治愈率可达70%~90%。[结论]表明洋葱对草鱼细菌性烂鳃病有治疗效果,可作为治疗草鱼细菌性烂鳃病的药物。     

TAIL-PCR方法扩增稀有放线菌小单孢菌中ΦC31的attB序列研究

[目的]为了研究链霉菌噬菌体ΦC31在小单孢菌40027菌株中的整合位点序列。[方法]以20 ng整合质粒pSET152的小单孢菌40027菌株基因组DNA为模板,利用3个特异性巢式引物(PF1、PF2和PF3)与随机引物AD2,通过热不对称交错PCR(TAIL-PCR)扩增稀有放线菌小单孢菌中ΦC31的attB序列,用1%琼脂糖凝胶电泳来检测扩增产物的大小。[结果]扩增结果表明,第三轮扩增产物250 bp左右的条带比第二轮对应带略小,第二轮扩增产物对应带比第一轮对应带略小,与3个特异性巢式引物预期扩增结果相符,第三轮扩增产物250 bp左右那一条带为阳性带,经回收后,进行克隆并测序。序列分析表明:该阳性带包含ΦC31在小单孢菌40027菌株中的attB序列。[结论]TAIL-PCR方法为attB序列的克隆提供了一种简便、高效的新方法。     

苏云金芽孢杆菌cry1Ac15基因的克隆及原核表达

[目的]为了分析苏云金芽孢杆菌cry1Ac15基因序列。[方法]以全长基因PCR产物的黏端定向克隆的方法,设计1对特异引物,分别引入SalⅠ和BamHⅠ酶切位点。以Ly30质粒DNA为模板扩增cry1Ac全长基因,与表达载体pUCM-T相应的酶切产物连接,转化大肠杆菌,获得含有cry1Ac基因的重组质粒pUCLy1Ac。[结果]cry1Ac基因编码区为3 564 bp,编码蛋白分子量为134 kD,含1 184个氨基酸,与cry1Ac3同源性最高,该基因经诱导获得高效表达,SDS-PAGE电泳检测到明显的134 kD蛋白带。[结论]诱导表达的cry1Ac蛋白对棉铃虫、甜菜夜蛾等鳞翅目害虫幼虫均有较高的杀虫活性。     

转基因大豆MON89788转化体特异性定性PCR检测（摘要）（英文）

[目的]建立MON89788大豆转化体特异性定性PCR检测方法。[方法]利用TAIL-PCR技术分离MON89788大豆的3′端旁侧序列,据此序列设计3条特异性引物用于旁侧序列的扩增。经过3轮PCR扩增,获得特异性扩增产物,将此产物回收后克隆到pMD-18T载体上测序,所得序列用Vector NTI分析,并提交NCBI进行序列比对。并对该方法的特异性和灵敏度进行测试。[结果]获得了1 142 bp的3′端旁侧序列。经Blast检索比对,该序列包括2部分,1 ～618 bp为载体序列（E9终止子部分序列和LB序列）,619 ～1 142 bp为大豆基因组序列;依据该序列建立的PCR检测方法能特异性地从MON89788大豆中扩增出170 bp的产物,检测灵敏度达到0.05%,约为40个起始模板拷贝。[结论]该研究建立的方法特异性强、灵敏度高,可适用于MON89788大豆检测。     

马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长克隆及序列分析

[目的]分离克隆马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长.[方法]根据其他松科植物α-蒎烯合成酶基因保守区域设计引物,扩增出基因的部分片段,再结合RACE技术分别扩增出基因3’端和5’端序列,通过序列拼接获得cDNA全长,结合生物信息学软件分析该基因编码蛋白的特性.[结果]马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长为2 103 bp,编码区1 980 bp,编码629个氨基酸,含有1个N端结构域、1个金属结合结构域和1个天冬氨酸富集基序（DDMYD）.[结论]该方法成功克隆了马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长序列,具有单萜烯合成酶基因的典型特征,序列提交至GenBank,获得登录号KF547035.     

香蕉水通道蛋白基因的克隆与表达分析

[目的]更好了解香蕉果实与水分代谢的关系。[方法]依据从抑制差减杂交文库(SSH)中获得的一个cDNA序列,设计5′和3′RACE引物,从香蕉果实中扩增基因5′和3′末端片段,并用RT-PCR的方法探讨该基因在香蕉各组织中的表达情况。[结果]获得一个1 132 bp的水通道蛋白全长基因,命名为MaPIPl;1。MaPIPl;1基因包含861 bp的完整阅读框架,编码的蛋白有6个跨膜结构及aspara-gine-proline-alanine(NPA)和aromatic/arginine 2个保守区。其与水稻水通道蛋白基因OsPIP1;2在氨基酸序列上有94.1%的一致性和97.9%的相似性。且MaPIP1;1在香蕉各器官中均稳定表达。[结论]MaPIPl;1可能与香蕉的水分代谢相关。     

木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基基因全长克隆

[目的]克隆木薯腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）小亚基基因cDNA全长序列,为木薯高淀粉品种的分子育种提供依据.[方法]根据木薯AGPase小亚基基因已知片段设计特异性引物,以木薯根、茎、叶为材料,利用PCR及RACE克隆木薯AGPase小亚基基因cDNA全长序列.运用生物信息学方法对其核苷酸序列和推导氨基酸的理化性质、蛋白质三级结构进行系统分析.[结果]克隆获得木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基cDNA全长1566 bp,其中包括1566 bp的完整ORF,编码一个含521个氨基酸的多肽.其理论蛋白质分子量57.01 kDa,等电点6.1,呈酸性.多重序列比较分析结果显示,木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基核苷酸序列与蓖麻、麻风树和杨树相应序列的相似性分别为87％、87％和86％.结合系统进化树分析结果推测,木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基在不同物种及进化过程中具有高度的保守性.蛋白三级结构分析结果表明,木薯AGPase小亚基蛋白具有15个α-螺旋、24个β-折叠和多个转角.[结论]木薯AGPase小亚基基因cDNA全长序列与蓖麻、麻风树和杨树等具有较高的同源性.     

百脉根LjIPT3启动子的克隆及表达载体的构建

[目的]为深入研究LjIPT3的表达调控和功能奠定基础。[方法]利用TAIL-PCR技术克隆百脉根IPT基因LjIPT3起始密码子的上游序列,利用生物信息学手段对其序列特征和潜在的调控元件进行分析,并构建启动子表达载体。[结果]利用TAIL-PCR技术成功克隆了LjIPT3基因5′端上游调控序列。将目的片段连接到pMD18-T载体上,获长度为1 910 bp序列,其3′端有部分序列与LjIPT3的5′端相同,证明克隆的片段为LjIPT3起始密码子ATG的上游区域。该序列含有1个TATA-box和3个CAAT-box,还包含光响应元件、MYB结合位点、不同的激素反应元件以及各种胁迫元件,说明该基因的表达可能受多种因素的调控。成功构建了驱动报告基因GUS的植物表达载体。[结论]该研究为研究植物细胞分裂素的合成代谢和植物生长发育的调控奠定了基础。     

苦荞中查尔酮合成酶全长基因的克隆及序列分析(英文)

[目的]该研究旨在克隆苦荞中查尔酮合成酶全长基因。[方法]选用乌克兰伊琳娜苦荞为试验材料,以从叶片中提取的RNA为模板,应用RACE技术结合CODEHOP引物设计方法克隆苦荞中查尔酮合成酶cDNA序列,通过电子合并获得其全长。设计基因全长特异性引物,以DNA为模板进行PCR扩增出基因序列。应用Clustalxl.81和MEGA4软件进行序列分析和进化树的建立;核酸和蛋白质序列同源性分析应用NCBI的Blastn和Blastp完成。[结果]生物信息学分析表明,该基因全长1906bp,具有一个463bp的内含子序列,编码区长度为1188bp,编码395个氨基酸。Blastn序列比对发现该试验所获得的CHS基因序列与相近物种Rheum palmatum(登录号:DQ205352.1)的CHS基因同源性达86%。[结论]该研究为阐明苦荞生物类黄酮合成的分子基础,探索提高苦荞生物类黄酮含量的有效途径奠定基础。     

大珠母贝金属硫蛋白cDNA克隆与序列特征分析

[目的]探讨重金属对大珠母贝苗种存活的影响。[方法]对大珠母贝金属硫蛋白基因进行克隆和序列分析。[结果]结果表明,通过构建大珠母贝外套膜全长cDNA文库,首次克隆得到大珠母贝金属硫蛋白（PmMT）全长cDNA序列。该序列全长599 bp,5′UTR（Un-translated region）为75 bp,3′UTR为296 bp,开放阅读框（Open reading frame,ORF）为228 bp,编码75个氨基酸。编码的氨基酸中半胱氨酸含量丰富,达29.3%;赖氨酸和甘氨酸含量也较高,均为9.3%;不含苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸和酪氨酸等芳香族氨基酸;含有软体动物等无脊椎动物金属硫蛋白的特征序列。序列特征分析表明,该序列具备金属硫蛋白的典型特征,是金属硫蛋白家族成员。[结论]该研究为海洋贝类金属硫蛋白的进化及功能研究提供基础资料。     

蓖麻RcAKT1基因的克隆与序列分析

[目的]对蓖麻Rc AKT1基因进行克隆和序列分析。[方法]提取盐胁迫处理的蓖麻新鲜叶片总RNA,采取RACE法克隆蓖麻Rc AKT1基因的3'末端和5'末端,利用生物信息学软件DNAman对两端序列进行拼接,最后设计一对特异性引物,从而获得蓖麻Rc AKT1基因的ORF全长序列,并对该序列进行生物信息学分析。[结果]该基因的开放阅读框序列长度为2 253 bp,推测可不间断编码751个氨基酸。选取其他植物的AKT1序列与蓖麻Rc AKT1序列进行比对,结果显示同源性很高,其一致性在84%~97%。[结论]经过生物信息学分析,发现蓖麻Rc AKT1属于ANK超级家族,是亲水性蛋白质。