PolyI：C体外诱导草鱼PKR基因的克隆与表达

[目的]克隆草鱼的PKR基因,为草鱼抗病毒基因研究奠定基础。[方法]依据GenBank上斑马鱼（AJ852023.1）和鲫鱼（AY293929.1）的PKR基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计了3对简并引物;采用100μg/ml PolyI：C体外分别处理草鱼肾细胞（Ctenopharyngodon indellus kidney cells,CIK）12、36、48 h,并提取处理后细胞的总RNA,逆转录后用降落PCR方法扩增这3个处理时间细胞中PKR基因。[结果]处理12 h时未扩增出PKR基因,处理36和48 h时都扩增到了PKR基因,并且表达量随处理时间的增加有所升高,扩增到的部分序列与鲫鱼和斑马鱼的该段序列同源性分别为100.00%和81.48%。[结论]试验成功获得了草鱼PKR基因的部分序列,PolyI：C高效诱导草鱼PKR蛋白表达将有助于开创治疗草鱼类病毒病的一种新思路。     

PolyⅠ:C体外诱导草鱼PKR基因的克隆与表达

[目的]克隆草鱼的PKR基因,为草鱼抗病毒基因研究奠定基础.[方法]依据GenBank上斑马鱼(AJ852023.1)和鲫鱼(AY293929.1)的PKR基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计了3对简并引物;采用100 μg/ml Polyl:C体外分别处理草鱼肾细胞(Ctenopharyngodon indellus kidney cells,CIK)12、36、48h,并提取处理后细胞的总RNA,逆转录后用降落PCR方法扩增这3个处理时间细胞中PKR基因.[结果]处理12h时未扩增出PKR基因,处理36和48h时都扩增到了PKR基因,并且表达量随处理时间的增加有所升高,扩增到的部分序列与鲫鱼和斑马鱼的该段序列同源性分别为100.00％和81.48％.[结论]试验成功获得了草鱼PKR基因的部分序列,Polyl:C高效诱导草鱼PKR蛋白表达将有助于开创治疗草鱼类病毒病的一种新思路.     

斑马鱼不同发育时期血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2）基因表达的实时定量PCR分析（摘要）

[目的]探讨血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2）基因在斑马鱼不同发育时期的表达。[方法]采用Trizol法分别提取12、24、48、72和96h斑马鱼胚胎和仔鱼总RNA;再使用MMLV反转录酶将其反转录为cDNA;合成的cDNA用实时定量RT-PCR方法检测VEGFR-2基因的表达。实时定量RT-PCR扩增反应结束后,利用熔解曲线对扩增产物进行特异性分析。采用2^-△△Ct法进行数据分析。[结果]VEGFR-2基因表达量在12～72h呈上升趋势,在96h时有所下降。12h相对表达量最低,与其他发育期差异极显著（P〈0.01）,72h相对表达量最高,与12、24和96h差异极显著（P〈0.01）,与48h差异显著（P〈0.05）。[结论]斑马鱼血管发育至72h达成熟阶段,血管发育成熟前,VEGFR-2基因表达水平逐步增长;血管发育成熟后,VEGFR-2基因表达水平下降。     

大鼠OSP-1启动子克隆与表达检测

[目的]克隆大鼠卵巢特异性启动子（OSP-1）片段,并在细胞水平检测该启动子调控标记基因的组织特异性表达。[方法]参考已知大鼠OSP-1序列设计特异性引物,PcR扩增大鼠OSP-1启动子片段并与已公布的大鼠OSP—1序列进行比较。将OSP-1启动子定向克隆到去除CMV的pEGFP—N1载体,构建真核表达载体pOSP—1—EGFP．N1;重组质粒在脂质体LipofectamineTM2000介导下,分别转染水牛的颗粒细胞、乳腺上皮细胞和胎儿成纤维细胞,并于转染后12,24和48h在荧光显微镜下观察EGFP表达情况。【结果lOSP—l启动子扩增片段长480bp,与已公布的大鼠OSP-1序列的相似性达96％;应用启动子预测软件对所得序列分析表明,该扩增片段含有类似于TA—TAbox和CAATbox的核心启动顺式元件,并含有多个C／EBPbeta转录因子的结合位点;在颗粒细胞转染后12h可观测到绿色荧光表达,转染后24h荧光细胞增多,细胞形态均呈圆形、体积较大,48h荧光细胞数量骤减,且死细胞增多;在乳腺上皮细胞和胎儿成纤维细胞均未检测到EGFP基因表达。[结论]大鼠OSP-1启动子控制下的EGFP基因可在水牛颗粒细胞中特异表达,为构建水牛卵巢特并性表达转基因载体奠定了基础。     

斑马鱼不同发育时期血管内皮生长因子受体2基因表达的实时定量PCR分析

[目的]探讨血管内皮生长因子受体2（VEGFR2-）基因在斑马鱼不同发育时期的表达。[方法]分别从12、24、48、72和96 h的斑马鱼胚胎和仔鱼中提取总RNA,用实时定量RT-PCR方法检测VEGFR2-基因表达,采用2^-△△Ct法进行数据分析。[结果]VEGFR2-基因表达量在12-72 h呈上升趋势,在96 h有所下降。12 h表达量最低,72 h表达量最高,与其他发育期均有显著差异。[结论]斑马鱼血管发育至72 h达成熟阶段。血管发育成熟前,VEGFR2-基因表达水平逐步增长;血管发育成熟后,VEGFR2-基因表达水平下降。     

抗浪鱼MC4R基因的PCR扩增及序列分析

[目的]对抗浪鱼MC4R基因进行PCR扩增。[方法]采用PCR方法,依据鲫鱼的黑素促黑素受体-4（MC4R）基因保守区的核苷酸序列,采用引物设计软件,对抗浪鱼的MC4R基因设计出一对引物进行PCR扩增和纯化测序,并利用phylip软件对抗浪鱼和其他已知MC4R基因序列的鱼类构建基因进化树。[结果]抗浪鱼MC4R基因的扩增长度为1001bp。9种鱼类的MC4R核苷酸序列聚为2大类。其中,比目鱼单独聚为一类;斑剑尾鱼、舌齿鲈、白斑角鲨、斑马鱼、抗浪鱼、黑青斑河豚、中华多纪豚和红旗东方豚聚为一类。[结论]抗浪鱼与斑马鱼的亲缘关系最近,与比目鱼的亲缘关系最远。     

草鱼抗病毒基因Mx全长cDNA的克隆、序列分析与真核表达载体构建

Mx蛋白是一类由I型干扰素(IFN)诱导表达的抗病毒蛋白。以PolyI∶C诱导的草鱼(Ctenopharyngodon indellus)肾细胞(CIK cells)为材料,抽提细胞总RNA,通过RT-PCR的方法扩增出Mx基因cDNA全序列,连接至pMD20-T载体上,构建重组质粒pMD20-T-Mx,并测序进行序列分析。用限制性内切酶从克隆的重组质粒pMD20-T-Mx上切下Mx基因,插入到质粒pEGFP-C1中,构建真核表达载体pEGFP-C1-Mx。结果显示,该基因cDNA全序列为1 921 bp,阅读框共编码627个氨基酸,分子量约为71.1 ku,理论等电点pI为8.33,其编码的Mx蛋白具有脊椎动物Mx蛋白共有的结构特征:一个三联体GTP结合区域和一个发动蛋白家族的典型结构特征序列。生物信息学分析表明,草鱼Mx基因所编码的蛋白质以亲水区域为主,具有丰富的B细胞抗原位点,但无明显的核定位序列,空间结构包括N端的GTP酶结构域(GTPase domain)、中间的中央相互作用结构域(central interactive domain,CID)和C端的GTP酶效应结构域(GTPase effector domain,GED)。同源性分析显示,草鱼Mx蛋白氨基酸序列和其他物种的相似性为45.1%～99.7%。此外还成功构建了含草鱼Mx基因cDNA全序列的真核表达载体pEGFP-C1-Mx。研究亮点:首次通过干扰素诱生剂PolyI∶C诱导草鱼肾细胞的方法克隆得到了草鱼抗病毒基因Mx cDNA全序列,并且借助生物信息学软件对其编码的氨基酸进行了序列分析,还成功构建了真核表达载体pEGFP-C1-Mx,为进一步研究草鱼Mx蛋白的生物学活性及其在抗鱼类病毒性疾病中的应用奠定基础。     

牛整合素β5亚基基因的构建与原核表达

[目的]构建牛整合素β5亚基（ITGB5）基因,并进行原核表达。[方法]扩增目的基因,将其重组到pET-32a（＋）质粒中,将经鉴定为阳性的重组克隆,转化大肠杆菌感受态细胞表达蛋白后纯化。[结果]从牛甲状腺、扁桃体扩增到目的基因ITGB5;ITGB5基因表达产物的SDS-PAGE结果显示,在88 KD处出现表达产物及纯化后的蛋白;W estern-blot分析表明,抗血清可与原核表达的蛋白特异性结合。[结论]表达、并纯化了ITGB5蛋白。     

猪核转录因子C/EBPβ基因3′末端部分序列的克隆

[目的]研究猪核转录因子C/EBPβ,扩增C/EBPβ3′非翻译区（3′UTR）部分序列。[方法]以报道的猪C/EBPβ基因片段（DQ450678.1）为模板设计引物,应用3′末端快速扩增技术（3′RACE技术）进行扩增。[结果]成功克隆猪核转录因子C/EBPβ的3′UTR,并获得GenBank登录号：FJ869121。[结论]与GenBank中报道的其他哺乳动物相应序列进行比较分析,猪核转录因子C/EBPβ的3′UTR序列与人C/EBPβ基因核苷酸序列BLAST比对,同源性为93%,为克隆其基因组全长及分析其功能奠定了基础。     

草鱼PepT2基因的克隆及其表达分析

采用RT–PCR和cDNA末端快速扩增技术克隆草鱼(Ctenopharyngodon idellus) II型小肽转运载体(PepT2)基因全长cDNA序列,对其进行生物信息学和共线性分析,并采用实时荧光定量PCR技术检测分析健康草鱼PepT2基因在不同组织中的表达情况。结果表明：草鱼PepT2基因的cDNA序列全长为2733 bp,包括开放阅读框2169 bp(编码722个氨基酸残基),5′非编码区82 bp和3′非编码区482 bp;草鱼PepT2基因结构含有20个外显子和19个内含子;预测蛋白相对分子质量为8.032×104,等电点为6.01,该蛋白具有与哺乳动物同源蛋白类似的12个螺旋跨膜结构,并且在跨膜区9和10之间有1个大的外环,跨膜区氨基酸高度保守,含有6个蛋白激酶C磷酸化位点和3个N–糖基化位点;预测的PepT2蛋白三级结构包含有18个α–螺旋和21个β–折叠;氨基酸序列同源性分析结果显示,草鱼PepT2氨基酸序列与斑马鱼(Danio rerio)的同源性最高,为86.65%,与其他所比较的物种的同源性则为52.83%~68.15%;系统进化树分析表明,草鱼与斑马鱼的亲缘关系最近;与斑马鱼相比,草鱼PepT2所在的染色体保留着大多数基因,具有保守的基因块;实时荧光定量表达分析表明,草鱼PepT2在肠道中的表达量最高,在肾脏中的表达量次之。     

多菌灵杀菌剂对青海弧菌和斑马鱼的急性毒性研究

[目的]研究农药对农田环境及非靶标有益生物的影响。[方法]选取青海弧菌Q67和斑马鱼作为受试生物,研究多菌灵杀菌剂对其的急性毒性,从而初步评价该杀菌剂农业生产应用中对水生生物的潜在风险。[结果]22%多菌灵杀菌剂对青海弧菌Q67的EC_(50)为7.70 mg/L,pEC_(50)为2.11;22%多菌灵杀菌剂对斑马鱼的24、48、72、96 h LC_(50)分别为8.53、8.39、8.07和7.64 mg/L;斑马鱼的安全浓度为0.76 mg/L。[结论]根据《化学农药环境安全评价试验准则》"鱼类急性毒性试验"对鱼类毒性评价标准,判断22%多菌灵杀菌剂对斑马鱼的毒性属中毒。     

铅对斑马鱼生殖系统毒性作用研究

[目的]研究Pb对斑马鱼生殖系统的毒性作用。[方法]将成年斑马鱼(3月龄)随机分为4组,分别为对照(蒸馏水)组和低(0.4mg/L)、中(0.8 mg/L)、高(1.6 mg/L)剂量PbAc染毒组,每组20条,连续染毒7 d。染毒结束后,测定雌性斑马鱼产卵数和雄性斑马鱼产精子体积以及精子密度。[结果]与对照组相比,0.4和0.8 mg/L Pb染毒组斑马鱼产卵数较低,差异均有统计学意义(P<0.05);1.6mg/L Pb染毒组斑马鱼已不产卵。随着染毒剂量的增高,斑马鱼产卵数呈减少趋势。各Pb染毒组雄性斑马鱼精子密度与对照组比较,差异均无统计学意义。与对照组比较,0.4、0.8和1.6 mg/L Pb染毒组雄性斑马鱼精子体积均较低,差异有统计学意义(P<0.05)。置换交配试验结果也是类似。[结论]Pb染毒可对成年斑马鱼产生生殖毒性。     

利用RAPD标签分析3种鲤科鱼群体的遗传变异

[目的]利用RAPD技术对草鱼、鲢鱼和鲫鱼群体遗传变异进行初步研究。[方法]用20种10 bp长的随机引物对草鱼、鲢鱼和鲫鱼进行RAPD-PCR扩增,从20种引物扩增出来的DNA条带中筛选条带清晰的6种引物,分析这3种鱼的遗传变异。[结果]结果表明:草鱼与鲢鱼的RAPD指纹图谱带型差别不明显,草鱼与鲢鱼、鲫鱼品种间的带纹相似系数分别为0.375和0.416,遗传距离分别为0.625和0.584;鲢鱼与鲫鱼品种间带纹相似系数为0.366,遗传距离为0.634。[结论]RAPD是一种非常灵敏的种间鉴定技术,特别是对鱼种类的鉴定有重要意义。     

三苯基锡和五氯酚对斑马鱼急性毒性作用和过氧化物酶活性的影响

[目的]研究三苯基锡（TPT）和五氯酚（PCP）对斑马鱼过氧化物酶（POD）活性的影响,探讨TPT和PCP对斑马鱼的毒性作用。[方法]以斑马鱼为受试生物,采用半静态法对斑马鱼进行驯养和试验,测定TPT和PCP对斑马鱼的LC50、联合毒性作用类型和对POD活性的影响。[结果]TPT和PCP对斑马鱼的96 hLC50分别为12.313和61.195μg/L,毒性顺序为TPT〉PCP。TPT和PCP暴露1 d胁迫斑马鱼POD为诱导-抑制效应,暴露7 d胁迫斑马鱼POD为抑制效应。且暴露1 d和暴露7 d酶活性变化均显著。[结论]TPT和PCP为剧毒物质,TPT和PCP联合作用类型为协同作用;TPT和PCP单一胁迫斑马鱼POD活性变化显著,可为有机物污染对水生生物毒性机理研究提供参考。     

1-萘酚在斑马鱼体内富集规律研究

[目的]研究1-萘酚在斑马鱼体内富集规律。[方法]试验采用半静态水质接触染毒法,研究了不同浓度1-萘酚暴露下斑马鱼体内1-萘酚含量的变化,并分析了1-萘酚的富集系数和染毒浓度的相互关系。[结果]在0.1和0.5 mg/L 2个浓度点下进行富集效应时,1-萘酚在鱼体中的富集速度较快,富集系数随染毒浓度的增加而减小,且均在第4天达到富集稳态,富集系数BCF0.1 mg/L=21、BCF0.5 mg/L=13;96 h半致死浓度值为3.963 mg/L,属高毒污染物。[结论]1-萘酚在低浓度条件下鱼类更容易对污染物产生富集作用。     

青蛤MAPK/p38基因的克隆及Poly∶Ic胁迫下的表达分析

[目的]克隆青蛤MAPK/p38基因,并分析其在Poly:Ic胁迫下的表达情况。[方法]利用转录组测序获得青蛤MAPK/p38基因的序列信息,采用生物信息学软件分析该基因在近缘生物间的进化关系;利用巢式及荧光定量PCR技术克隆青蛤MAPK/p38基因的结构域序列,并在Poly:Ic胁迫后立即分析该基因在青蛤各组织中的表达情况以及血淋巴中的时序性表达情况。[结果]克隆得到青蛤MAPK/p38基因的结构域序列,分析发现该基因在物种进化中很保守,其在青蛤的血淋巴、肝脏、外套膜、闭壳肌和鳃中均有表达,其中在血淋巴中表达量最高,腮中表达量最低。Poly:Ic胁迫3 h后该基因的表达量达到最大值,与对照组差异极显著(P0.01)。[结论]MAPK/p38基因所表达的产物是青蛤重要的免疫信号通路蛋白。     

草鱼模拟肠液的开发及其在仿生消化仪上的应用

[目的]研制草鱼模拟肠液配方。[方法]根据草鱼成鱼的肠道淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶活性,pH以及钠离子环境,研制了一套草鱼成鱼的模拟肠液配方,并研究其在仿生消化仪上的应用。[结果]利用配制的草鱼模拟肠液进行体外仿生消化试验,发现饲料中干物质和粗蛋白的消化率与真实值的绝对差值均在10%左右,达到仿生消化的目的与要求。此外,经过仿生消化,外源植酸酶能够显著提高干物质消化率、粗蛋白消化率和代谢能值,促进植酸磷的释放。[结论]该研究结果可为草鱼的体外模拟消化提供更可靠的试验数据,并为水产其他动物模拟肠液的开发提供参考。     

黄芪多糖和香菇多糖对草鱼非特异性免疫功能的影响

[目的]为黄芪多糖和香菇多糖在水产饲料中的推广和应用提供参考。[方法]在草鱼饲料中分别添加不同剂量的黄芪多糖和香菇多糖,分析其对草鱼非特异性免疫功能的影响。[结果]与对照组相比,黄芪多糖能提高血清溶菌酶、血清碱性磷酸酶、血清超氧化物岐化酶活性、补体C3含量和白细胞吞噬活性,降低丙二醛含量。但是,低剂量黄芪多糖不能提高血清溶菌酶活性和补体C3含量。香菇多糖能提高血清溶菌酶活性、血清碱性磷酸酶、补体C3含量和白细胞吞噬活性,降低丙二醛含量,但不能提高血清超氧化物岐化酶活性。[结论]饲料中添加黄芪多糖和香菇多糖均对草鱼的非特异性免疫功能具有一定的促进作用。