多重PCR检测耐除草剂转基因作物

为建立耐除草剂转基因作物的高通量检测方法,本试验以目前生产上广泛应用的5种除草剂抗性基因dmo、pat、CP4EPSPS、bar和aad1为靶标进行多重PCR(MPCR)研究。通过引物适用性测试、反应体系中的不同引物浓度和反应程序中的退火温度测试、灵敏度和特异性验证等,建立了能同时检测5种除草剂抗性基因的MPCR检测方法。结果表明,当dmo、pat、CP4EPSPS、bar、aad1基因的检测引物终浓度分别为0.2、0.2、0.3、0.4、0.2μmol·L^-1,退火温度为63℃时5种靶标扩增效果较好,且特异性条带清晰且均一。此外,MPCR检测方法具有较好的特异性,对每种靶标的检测灵敏度均可达到0.1%。适用性测试结果显示,MPCR检测方法可对含有5种除草剂抗性基因的多种转基因作物的单个品系或多个品系混合物进行筛选检测。无假阳性和假阴性结果表明,MPCR检测方法对实际样品具有很好的适用性。本试验结果为筛选高效耐除草剂转基因作物检测技术提供了一定的理论依据。     

应用多重荧光PCR快速筛查作物中转基因成分研究

通过对我国批准进口的和获得农业转基因生物安全证书的转基因玉米转化体的序列分析发现,除DAS40278-9和BLVA430101外,CaMV35s启动子、NOS终止子、Cry1Ab/Ac基因和pat基因覆盖了21种玉米转基因转化体。通过引物组合筛选、反应体系优化、灵敏度测试、适用性测试等实验,建立了基于4个通用筛选元件及zSSIIb内源基因的五重荧光PCR和基于转化体特异性序列的二重荧光PCR检测转基因成分方法体系。方法参数测定结果表明,此方法特异性强、稳定性好,检测灵敏度达到0.05%。同时,此方法体系不仅适用于转基因玉米成分筛查,对大豆、水稻等多种作物进行转基因成分筛选鉴定也有良好的适用性。     

转基因大豆MON89788检测质粒标准分子的构建与应用

[目的]构建适用于转基因大豆MON89788检测的质粒标准分子。[方法]利用定性PCR和连接、转化等分子克隆技术,将大豆内标准基因lectin、MON89788的3′端特异性序列和5′端特异性序列依次克隆到pMD18-T载体上,获得质粒标准分子pMD-LM3M5,并进行适用性验证。[结果]获得了3700bp的质粒标准分子,其中重组DNA片段1029bp。该质粒标准分子的定性PCR检测灵敏度达到10copy。[结论]该研究构建的质粒标准分子pMD-LM3M5能替代MON89788基体标准品,用于MON89788大豆及其产品的定性PCR检测。     

转Bt基因玉米幼苗残体中Ory1Ab杀虫蛋白田间降解动态

【目的】研究间苗后留在田间地表的转Bt基因玉米幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白的降解规律,比较两种Bt玉米幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白的降解速度。【方法】以两种表达Cry1Ab杀虫蛋白的转Bt基因抗虫玉米MON810和Bt11为材料,采用ELISA方法测定各取样时期中幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白残留量。【结果】转Bt基因玉米幼苗残体中杀虫蛋白降解是逐渐的,且降解速度较快,到50d时幼苗残体已经完全腐烂,Bt11幼苗残体中的杀虫蛋白已经完全降解,在MON810中还能检测到微量的杀虫蛋白。两种转基因玉米幼苗残体中的Bt杀虫蛋白的初始含量差异不显著,但在同一时间段的Bt杀虫蛋白降解速度存在差异均显著,在30d前MON810幼苗残体中Bt杀虫蛋白降解速度比Bt11降解的快,30d后,则降解趋势相反,到50d取样结束时MON810和Bt11分别降解了初始含量的99.81%和100%。【结论】两种转Bt基因玉米间苗后留在田间的幼苗残体中的Cry1Ab杀虫蛋白降解速度不同,在50d完全腐烂时,其中的杀虫蛋白完全降解或仅有微量残留。     

转基因大豆MON89788检测质粒标准分子构建与应用

[目的]构建适用于转基因大豆MON89788检测的质粒标准分子.[方法]利用定性PCR和连接、转化等分子克隆技术,将大豆内标准基因lectin、MON89788的3'端特异性序列和5'端特异性序列依次克隆到pMD18-T载体上,获得质粒标准分子pMD-LM3M5,并进行适用性验证.[结果]获得了3 700 bp的质粒标准分子,其中重组DNA片段1 029 bp.该质粒标准分子的定性PCR检测灵敏度达到10 copy.[结论]该研究构建的质粒标准分子pMD-LM3M5能替代NON89788基体标准品,用于MON89788大豆及其产品的定性PCR检测. Abstract： [Objective] The aim was to construct a plasmid reference molecule (PRM) for detection of transgenic soybean MON89788.[Method]the lectin gene sequence,3'-junction and 5'-junction sequence between host plant DNA integrated DNA of MON89788 soybean were amplified independently,and the three fragments were cloned into the cloning vector pMD18-T in order through molecular manipulation method to construct pMD-LM3M5,the applicability of the constructed novel PRM was tested. [Result] Sequencing confirmation result showed that the PRM was 3 700 bp in length,containing 1 029 bp of recombined DNA fragment.The limits of qualitative detection of the PRM were 10 copies,[Conclusion]The PRM constructed in this study was suitable for the identification of MON89788 event.     

第二代抗草甘膦大豆PCR检测方法研究

为建立转基因大豆Roundup RReady2Yield"(RR2Y)转化体特异性定性PCR检测方法,以lectin基因作为内参照基因,根据RR2Y外源插入片段5'端与植物基因组连接区序列设计特异性引物,从RR2Y中特异性地扩增出223bp的预期产物.对该方法进行重现性、特异性、灵敏度、稳定性和可重复性测试,结果显示:陔方法能够特异性检测出RR2Y转化体;将100%RR2Y基因组DNA用A3244基因组DNA进行梯度稀释,以100 ng DNA为模板,该方法的检测灵敏度达到0.05%,约为40个起始模板拷贝;以RR2Y DNA含量为10%、1%、0.1%的样品为模板,进行稳定性和可重复性,假阴性率为0.结果表明:此方法适用于RR2Y的转化体特异性定性PCR检测.     

转EPSPS基因大豆植株中蛋白的表达

采用ELISA定量测定法研究了转EPSPs基因大豆不同生长时期不同器官中CP4 EPSPS蛋白含量的变化.结果表明:转EPSPS基因大豆不同器官在不同牛育期CP4 EPSPS蛋白含量表现出较大的差异,R8期籽粒中的CP4EPSPS蛋白含量在所有时期和所有组织中蛋门含世最高;上位叶和下位叶中CP4 EPSPS蛋白除V3～V5期和R8期外的表达趋势一致,茎上部和茎下部中CP4 EPSPS蛋白在不同时期表达动态趋势基本一致,根中CP4 EPSPS蛋白含量存V3～V5期下降,然后逐渐升高,R1～R8期有一个大幅度的下降过程.从V1期至R8期,随着植株的不断生长,各组织中CP4 EPSPS蛋白的含量有明显的变化.     

正交实验法优化转基因玉米中植酸酶的提取工艺

采用正交实验法研究pH值、料液比和提取时间等因素对酶提取效率的影响,探索超声提取转基因玉米中植酸酶最佳提取条件。结果显示,最佳提取条件为提取液pH值5.5,料液比为1∶4,提取时为15 min。     

转基因大豆MON89788转化体特异性定性PCR检测

[目的]建立MON89788大豆转化体特异性定性PCR检测方法。[方法]利用TAIL-PCR技术分离MON89788大豆的3′端旁侧序列,据此序列设计特异性引物进行PCR检测,并对该方法的特异性和灵敏度进行测试。[结果]获得了1142bp的3′端旁侧序列;依据该序列建立的PCR检测方法能特异性从MON89788大豆中扩增出170bp的产物,检测灵敏度达到0.05%,约为40个起始模板拷贝。[结论]该研究建立的方法特异性强、灵敏度高,可适用于MON89788大豆检测。     

不同类型玉米组织对亚洲玉米螟幼虫存活和生长发育的影响

亚洲玉米螟[Ostriniafurnacalis(Guenée)]是中国玉米生产上最重要的害虫,严重影响玉米的产量和质量。由于不同类型玉米对亚洲玉米螟的抗性程度不同,影响玉米螟的存活和生长发育,同一品种的不同组织器官对玉米螟的存活和发育影响也不相同。笔者在室内研究了高油玉米、糯玉米、甜玉米和普通玉米等的不同组织对亚洲玉米螟幼虫存活、生长和发育的影响。结果表明,不同类型玉米在不同生育期的组织器官对亚洲玉米螟幼虫的存活、生长和发育的影响不同。高油玉米298的心叶组织最适合玉米螟幼虫的存活和生长发育,而心叶期抗螟品种邢抗2号和的心叶不利于玉米螟幼虫的存活、生长和发育。玉米螟幼虫在高油玉米、甜单8号和白糯4号的雄穗上存活率高,幼虫体重较重,而在邢抗2号雄穗上的存活率和幼虫体重最低。甜单8号玉米苞叶总体上比较适合亚洲玉米螟幼虫生长和发育,而白糯4号和邢抗2号的苞叶对亚洲玉米螟幼虫生长发育有明显的不利影响。甜单8号、农大108和高油298的花丝适宜玉米螟幼虫生长和发育。而超甜2号和邢抗2号2个品种的花丝对玉米螟幼虫生长和发育有不利影响。超甜2号玉米的穗轴适宜玉米螟生长和发育,玉米螟幼虫在甜单8号和白糯4号穗轴上取食存活率和化蛹率高,但蛹重较轻。邢抗2号穗轴对玉米螟生长发育有不利影