免疫球蛋白G(IgG)三种提取方法比较

比较3种提取猪血清中免疫球蛋白IgG方法的提取效果。分别用辛酸沉淀法,硫酸铵分步沉淀法,辛酸-硫酸铵沉淀法粗提猪血清免疫球蛋白IgG,并通过SDS-PAGE凝胶电泳、AlphaEaseFC凝胶成像分析软件、Bradford蛋白浓度测定法等比较3种方法的提取纯度和得率,同时比较3种方法的时效性和经济性。辛酸沉淀法提取IgG所用时间最短,只需1h,得率较高但纯度不高;硫酸铵盐析法提取的IgG纯度较高、得率也高,但时间较长;辛酸-硫酸铵分步沉淀法所得IgG纯度很高,但所用时间较长,得率也较低。3种提取方法各有特点,可根据不同的实验条件和目的选择不同的提取方法。     

西农萨能羊凝乳酶原基因的克隆与原核表达

【目的】克隆西农萨能羊凝乳酶原基因并进行原核表达,对表达产物凝乳酶原复性后进行活性检测,为西农萨能羊凝乳酶制剂的微生物发酵生产奠定基础。【方法】从西北农林科技大学西农萨能羊原种场新生公羔羊的皱胃组织中提取总RNA,通过RT-PCR方法获得西农萨能羊凝乳酶原前体的编码序列,纯化后与pMD-18T载体连接,转化大肠杆菌JM109,通过双酶切和序列测定,获得了凝乳酶基因全长编码区序列。将该基因连接到原核表达载体pET-30a中,构建重组菌pET-30a/Chymosin,经酶切、测序鉴定后进行凝乳酶的小量表达、大量表达、Western杂交鉴定、纯化、复性和活性测定。【结果】通过RT-PCR方法获得了西农萨能羊凝乳酶原前体的编码序列,并构建了重组菌pET-30a/Chymosin;通过体外原核表达获得了西农萨能羊凝乳酶原,将酶原进行复性后测得重组菌酶活力为93.2U/mL。【结论】利用西农萨能羊凝乳酶原基因,通过构建原核表达载体和体外表达可以得到凝乳酶原,通过蛋白纯化和复性可得到有活性的凝乳酶。     

卵黄抗体五种提取工艺比较及初步应用

为了得到较优的卵黄抗体提取工艺,试验改良了辛酸法、水稀释法、氯仿法、硫酸铵沉淀法与聚乙二醇沉淀法5种提取方法。IPGT诱导表达重组猪致病性大肠杆菌(Escherichia coli)毒素STxB蛋白(rSTxB),与佐剂71VG乳化制备免疫原免疫蛋鸡,利用改良的聚乙二醇沉淀法提取高免卵黄抗体,采用SDS-PAGE电泳检测抗体纯度,通过Western blot检测卵黄抗体和血清抗体效价。结果表明,辛酸法、水稀释法、氯仿法、硫酸铵沉淀法、聚乙二醇沉淀法提取效率分别为96.00、81.99、155.50、65.34、46.00 mg/mL,其中聚乙二醇沉淀法的提取纯度最高。重组STxB蛋白分子量大小约25 kDa,血清中抗体效价最高达到64 000倍,卵黄抗体最高稀释倍数为16 000倍。综合评估,聚乙二醇的提取法相对较优,且提取的卵黄抗体具有良好的免疫活性。     

微小毛霉凝乳酶的分泌表达、产物纯化及鉴定

采用基因工程的方法对微小毛霉(Mucor pusillus)凝乳酶进行分子改造,获得适于乳品工业生产用的凝乳酶,克隆到了微小毛霉凝乳酶基因,构建了酵母表达质粒pPIC9K/M。线性化后电击转入毕赤酵母GS115,在甲醇诱导下进行凝乳酶的初步发酵试验,通过pH反应及酶抑制反应试验证明,重组凝乳酶获得了分泌表达。SDS-PAGE分析表明重组凝乳酶的分子量约为46 kD,与理论值(45.3 kD)基本相符,培养基上清液中凝乳酶的活性为311.8 U/mL,纯化的总回收率为51.89%,纯度达到92%。     

鸡血清IgG纯化方法研究

[目的]为了获得高纯度鸡免疫球蛋白(Ig),并保持其生物学活性。[方法]比较几种纯化鸡血清免疫球蛋白(IgG)的方法。用饱和硫酸铵(NH4)2SO4沉淀法或乙醇沉淀法提取鸡血清IgG,经透析除盐,将初提物过sephadexG-200柱进一步分离IgG,经免疫电泳和SDS-PAGE电泳进行纯度鉴定。[结果]结果表明:在该试验条件下,(NH4)2SO4盐析和乙醇沉淀法获得的鸡IgG经sephadexG200柱分离获得高纯度的鸡IgG。[结论]该研究为找到较好的纯化鸡血清IgG方法提供了试验依据。     

海带中褐藻糖胶的不同提取纯化方法的研究

[目的]探讨提取条件对褐藻糖胶得率的影响,比较CTAB沉淀法和传统的乙醇沉淀法纯化褐藻糖胶的效果。[方法]以采自山东青岛海域的海带为原料,以褐藻糖胶得率为指标,考察了热水酸提法单因素实验的时间,温度,pH值,V/W(用水体积/干海带质量)4个因素对褐藻糖胶得率的影响;以褐藻糖胶得率和纯度为指标,比较了乙醇沉淀法和CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)沉淀法这2种纯化方法。[结果]褐藻糖胶得率随着时间的延长,pH值升高,V/W增大呈先升高后下降的趋势;而随着温度的上升,褐藻糖胶得率则不断升高。CTAB沉淀法所得的多糖得率和纯度分别为1.44%和45.3%,均高于乙醇沉淀法的。[结论]CTAB沉淀法提取褐藻糖胶优于传统的乙醇沉淀法。     

两种纯化苏云金杆菌HD-73毒素蛋白方法的比较研究

以苏云金杆菌HD 73伴胞晶体为活性蛋白,经胰蛋白酶酶解后分别用阴离子交换柱分离纯化法和等电点纯化法进行纯化,纯化后得到的样品进行SDS-PAGE分析,结果表明,两种分离纯化都获得67kDa的毒素蛋白,但是离子交换柱纯化法样品消耗量大,得率低;而等电点沉淀法样品消耗少,得率高。     

苍白杆菌SY286抑菌活性蛋白稳定性分析

利用饱和硫酸铵沉淀法从苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)SY286发酵滤液中提取抑菌活性蛋白,通过温度、酸碱度、紫外线以及蛋白酶对活性物质的影响,测定活性物质的稳定性。结果表明,经60%饱和硫酸铵溶液盐析出的活性蛋白对葡萄霜霉病菌的抑菌活性最强,抑制率达81.98%。温度、酸碱度以及紫外线对抑菌粗提蛋白的活性均有一定影响。抑菌粗提蛋白在50℃以下和pH 4～10条件下抑菌活性相对稳定。抑菌粗提蛋白的抑菌活性受蛋白酶的影响较大,蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶均对其活性具有较大影响。     

微小毛霉凝乳酶干酪素的制备及应用性能研究

以新鲜牛奶为原料,采用自制微小毛霉Mucor Pusilius凝乳酶作为脱脂牛奶凝固剂,经过离心脱脂、巴氏杀菌、凝乳、热烫、离心脱乳清、水洗、干燥、粉碎过筛等步骤获得凝乳酶干酪素,考察工艺参数对干酪素得率及应用性能的影响.实验结果表明,凝乳酶添加量、凝乳pH值、热烫温度对凝乳酶干酪素得率无显著影响,热烫温度对产品的融化...     

茶苗叶片低温诱导蛋白提取分离研究

本文研究冷驯化过程中茶苗叶片细胞膜相对透性和可溶性蛋白含量的变化,采用不同方法提取分离冷驯化茶苗叶片的低温诱导蛋白.结果表明:(①与高体叶片相比,冷驯化茶苗叶片更适宜用来分离茶树低温诱导蛋白,其表现为质膜相对透性变化不大,而且可溶性蛋白含量保持在较高水平.②与丙酮沉淀法、TCA/丙酮沉淀法、硫酸铵沉淀法和直接提取法相比,改良Tris-HCl法最适于冷驯化茶苗叶片低温诱导蛋白的分高提取,其特点是蛋白样品得率高、蛋白条带多且清晰、杂质干扰程度少、操作步骤简易.另外,在冷驯化蛋白提取样品中还发现了大小分别为25、35和90 KDa的蛋白差异条带.     

茶多酚制取工艺的研究

用乙酸乙酯、乙醇、丙酮和甲醇分别抽提绿茶中的多酚类物质，对其得率、茶多酚含量及其抗氧化活性进行比较；并对酒精制取茶多酚的工艺进行了深入研究．乙醇和乙酸乙酯粗提物得率较高，各自茶多酚含量为53％、64％，且具有较高抗氧活性；利用正交试验法，酒精提取，最佳工艺条件为：70％酒精，浸出温度45℃，浸出时间1h．     

用柱层析法检测中国龙虾主要变应原的研究

为分离、纯化和鉴定中国龙虾的主要变应原,采用硫酸铵沉淀法和等电点沉淀法对变应原粗浸液进行初分,在蛋白核酸检测仪检测控制下,用DEAE-52离子交换层析柱进行阶段洗脱和葡聚糖凝胶G-100柱层析,斑点ELISA确定其免疫活性.结果表明:中国龙虾变应原蛋白的硫酸铵沉淀范围在35％～60％之间,pH等于4.7、4.5时的等电点沉淀蛋白质有明显的变应原活性;离子交换层析中具变应原活性蛋白质峰含分子质量为15000、20 700、34 000、60 000、83 200 u的蛋白质;葡聚糖凝胶G-100层析后具变应原活性蛋白峰SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示只有34000 u相对分子质量的蛋白条带,纯度为91.5％.本试验分离、纯化鉴定出中国龙虾相对分子质量为34000 u的主要变应原,对于变应原的标准化、提高食物变态反应性疾病诊断和治疗水平具重要意义.     

不同沉淀方法提取柚皮果胶的研究

柚皮经盐酸溶液提取而得果胶提取液，分别以醇沉法和盐析法从提取液中沉淀果胶．研究并获得了两种沉淀方法的最佳沉淀条件，比较了不同沉淀方法的乙醇消耗量，探索了不同沉淀方法对果胶沉淀得率和品质的影响．结果表明：醇沉法所消耗的乙醇量几乎为盐析法乙醇消耗量的两倍．盐析法能大大降低乙醇使用量，省去稀酸提取液浓缩工序和减少乙醇回收量，节省能耗，降低生产成本．并能保证较高的沉淀得率和果胶品质。     

茶多酚的提取工艺初步探讨

茶多酚是茶叶的主要活性化合物,有效提取茶多酚、实现其综合利用具有十分重要的现实意义。初步探讨了有机溶剂萃取法、离子沉淀提取法和树脂吸附分离法对茶多酚的提取工艺,结果表明:有机溶剂萃取法以40%乙醇较好,(2)离子沉淀法中,Zn2+沉淀茶多酚的效果最佳;(3)树脂吸附分离法以70%乙醇的洗脱得率最高。     

乙醇沉淀法提取柚皮果胶的工艺研究

[目的]优化乙醇沉淀法提取柚皮果胶的工艺。[方法]采用乙醇沉淀法提取柚皮果胶,探讨柚皮提取液浓缩程度、沉淀用乙醇的浓度和用量、沉淀时间、洗涤用乙醇的浓度和用量、洗涤次数对果胶沉淀得率及产率的影响。[结果]当柚皮浓缩液与原提取液体积比为2∶5时,果胶沉淀得率为75.56%,且产品的表观品质较好。沉淀用乙醇与柚皮提取液体积比以1∶2较合适,沉淀用乙醇浓度取80%。混合体系中果胶浓度为3.678 mg/ml,乙醇与水的体积百分含量分别为44.4%和55.6%。当沉淀时间为30 min时,果胶沉淀得率达98.55%。沉淀粗果胶洗涤1次即可,洗涤用乙醇浓度选40%,洗涤用乙醇与柚皮提取液体积比为1∶5。[结论]在该研究确定的工艺条件下,乙醇沉淀法提取的柚皮果胶的品质较好。     

米酒凝乳酶酶学性质研究

采用乙醇沉淀法提取米酒中凝乳酶的粗酶液,对其酶学性质进行了分析.试验结果表明:米酒中凝乳酶的最适反应温度为60 ℃,但该温度条件下的酶活稳定性较差,60 ℃下处理60 min,酶活性仅存15%.在实际干酪生产中,选择最适酶促反应温度45 ℃;米酒凝乳酶的最适反应pH值在4～5.5左右,此范围内具有较高的酶活稳定性;添加0.4 g/L CaCl2,间接加快酶促反应速率,增强凝乳硬度.     

生防细菌A57的鉴定及拮抗蛋白理化性质的研究

通过培养形态、生理生化特征以及16S rDNA的分子序列同源性分析,16S rDNA测序结果在GenBank数据库进行同源性比较,确定A57为短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)。采用不同浓度硫酸铵沉淀法提取拮抗蛋白。以枯萎病菌作指示菌,A57在70%的硫酸铵饱和度下拮抗蛋白的拮抗活性最大,抑制率为23.7%。对A57拮抗蛋白理化性质研究,结果表明该拮抗蛋白对热均稳定,对氯仿均不敏感,对胰蛋白酶敏感;A57拮抗活性最佳pH值为5～7,强酸(pH3)和强碱(pH9)条件下仍具有部分的拮抗活性。     

乳清中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白分离制备技术研究

本研究采用不同分离方法对牛乳乳清中的主要成分α-乳白蛋白和β-乳球蛋白进行逐级分离纯化。利用两步硫酸铵沉淀法对乳清蛋白进行初级分离,使蛋白含量提高了4倍;响应面法优化PEG1500/硫酸铵双水相萃取系统的最佳工艺参数,萃取后蛋白组分被进一步纯化,蛋白浓度提高到815.6 mg/g,达到浓缩主要蛋白的目的;萃取蛋白经Sephadex G-75和DEAE离子交换层析后,所获得的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白样品纯度达到85%。     

微小毛霉凝乳酶基因的克隆及在毕赤酵母GS115中的表达

以微小毛霉基因组为模板,PCR扩增得到凝乳酶结构基因,经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后,连接穿梭载体pPIC9K,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,并测定其核苷酸序列。测序结果证实扩增得到的片段为凝乳酶基因,与GenBank报道的序列（No.X06219）存在6对碱基的区别。将重组质粒电转化毕赤酵母GS115,构建重组菌P.pastorisGS115/pPIC9K-m cp,通过筛选得到抗G418浓度达到3.0 mg/m l、具有多拷贝基因的整合重组菌pPIC9K-m cp-03。用甲醇诱导进行初步发酵试验,测得该重组菌凝乳酶活力为5 660 U/m l,比微小毛霉发酵液提高50多倍,且发酵液电泳结果表明毕赤酵母自身分泌的蛋白很少,只能看到约38.5 ku的凝乳酶蛋白条带。     

Plackett-Burman法优化荞麦壳总黄酮提取工艺及抗氧化活性分析

以乙醇为提取溶剂对荞麦壳黄酮的提取工艺进行优化,同时考察了黄酮得率与抗氧化活性的相关性。基于Plackett-Burman试验设计考察了各因素对荞麦壳黄酮得率、DPPH和ABTS自由基清除活性的影响。试验结果表明,提取次数是影响黄酮得率和抗氧化活性的显著因素(P0.05),乙醇体积分数对3个响应值均无显著影响。最佳提取条件为乙醇体积分数30%,料液比(g∶m L)1∶20,提取时间10 min,提取3次,在此条件下荞麦壳的黄酮类化合物的得率为2.381%,且抗氧化活性较强。荞麦壳黄酮得率和抗氧化活性的相关性分析结果表明,荞麦壳对ABTS自由基及DPPH自由基的清除活性均与黄酮得率呈正相关,DPPH自由基的清除活性与黄酮得率相关度高,相关系数为0.703。