反义CCoAOMT基因调控烟草木质素的生物合成

[目的]研究木质素的生物合成及调控,降低木质素的含量或改变其组分。[方法]用农杆菌介导法将苎麻反义CCoAOMT基因导入烟草,采用PCR及Southern印迹对获得的转基因植株进行分子检测,并测定移栽3个月转基因植株Klason木质素及纤维素含量。[结果]转基因烟草与野生型对照相比木质素平均含量降低了16.8%,纤维素平均含量升高了15.2%,并且植株生长正常。[结论]抑制植物CCoAOMT表达是反向调控转基因植物木质素生物合成的有效途径。     

苦豆子凝集素基因植物表达载体的构建及其对烟草的转化

[目的]了解苦豆子凝集素基因(SAL)的功能,将该基因构建到植物表达载体并转化烟草,获得转基因植株.[方法]利用RT-PCR技术,提取苦豆子总RNA进行反转录得到cDNA,通过PCR扩增得到苦豆子凝集素基因SAL,并将其克隆到植物表达载体pCAMBIA1301上,产生重组质粒pCAMBIA1301-SAL.采用农杆菌介导法将重组质粒转化烟草,并进行分析鉴定.[结果]构建了植物表达载体pCAMBIA1301-SAL,转化烟草后经筛选获得76株转基因植株,经抗性筛选及PCR和RT-PCR鉴定,其中27株显示为阳性植株.[结论]苦豆子凝集素基因已经在烟草中成功表达,为进一步研究验证转基因烟草的抗病效果奠定了基础.     

棉花热激转录因子GhHsf基因的表达及其烟草转化

[目的]了解棉花GhHsf基因的功能,分析该基因的表达模式,构建其植物表达载体并转化烟草获得转基因植株.[方法]利用半定量RT-PCR对棉花热激转录因子基因GhHsf的表达模式进行分析.构建pCAMBIA1301-GhHsf植物表达载体,采用农杆菌介导法转化烟草,并进行鉴定.[结果]棉花GhHsf基因在棉花各组织中为组成型表达;构建GhHsf基因植物表达载体pCAMBIA1301-GhHsf,转化烟草获得了转基因植株.[结论l棉花Gf基因在棉花的不同组织中是组成型表达,获得了转GhHsf基因烟草株,为进一步开展功能研究奠定基础.     

双价抗虫转基因水稻的育成及初步鉴定

[目的]构建双价抗虫基因表达载体并转化水稻,为选育广谱、高抗转基因抗虫水稻提供技术参考.[方法]构建半夏凝集素基因(pta)和苏云金杆芽孢菌基因(Bf)两个抗虫基因的双价表达载体pCAMBIA 1301-Bt-pta,利用大肠杆菌DH5α和根癌农杆菌LBA4404转化水稻恢复系辐恢838,同时对转化植株进行GUS染色及PCR鉴定.[结果]以构建的双价植物表达载体pCAMBIA 1301-Bt-pta为模板,PCR扩增到pta基因的部分片段,大小为807 bp,且该载体经Hind Ⅲ酶切后,能得到15854 bp的中间载体pCAMBIA 1301-Bt片段和2046 bp的pta基因片段.对转化植株进行GUS染色,得到3株转基因阳性植株,经PCR鉴定结果显示外源基因已成功导入水稻.[结论]通过构建双价抗虫基因表达载体并转化水稻,成功获得的转基因植株可用于水稻抗虫转基因恢复系及组合的研究,以提高其抗病虫害能力.     

棉花抗枯萎病相关GhB301基因对烟草的遗传转化及功能分析

[目的]ERF是乙烯信号传导途径中的重要转录因子,在植物与病原菌互作中发挥着重要的调控作用.棉花抗枯萎病相关GhB301基因是从棉花中获得的ERF-B3亚组基因,探索该基因在烟草异位表达后的功能,为进一步研究其在棉花抗枯萎病中的功能奠定基础.[方法]以pPZP35S表达载体为基础,构建GhB301的过表达载体;采用农杆菌介导法转化烟草并获得转基因植株.[结果]经卡那霉素筛选、PCR和RT-PCR检测,获得3株转基因阳性植株;qPCR分析显示,转基因阳性植株中部分病程相关蛋白基因的表达量较野生型明显升高.[结论]棉花抗枯萎病相关基因GhB301在烟草中异位表达后可能会通过增强部分病程相关蛋白基因的表达来提高植株抗病性.     

转基因抗虫植物研究进展

1983年第一例转基因植物诞生,1987年首次报道有抗虫性的转基因植物问世[1,2].在我国以转基因抗虫棉为代表的转基因抗虫农作物研究获得了相当的成功,引起了广泛关注.以下着重对当前所使用的各种抗虫基因进行归纳概述,对转化方法加以简单评价,就昆虫抗性问题进行一些探讨.     

作物抗虫转基因育种的现状及发展策略

随着植物生物技术的迅猛发展，转基因育种已成为抗虫育种的主力军。自1987年首次报道转基因抗虫作物以来，已有40多种不同的抗虫基因用于转基因抗虫育种。和常规抗虫育种相比，转基因抗虫育种具有明显的优势：一方面，极大地拓宽了抗虫基因的来源（如动物、植物、微生物和人工合成）；另一方面，提高了导入抗虫基因的精确性，[第一段]     

融合杀虫基因对甘蔗的遗传转化

[目的]利用MAR序列介导转基因表达及融合杀虫基因,以期克服外源基因失活,增强抗虫基因表达能力,延缓昆虫抗性的发生,获得高抗虫转基因甘蔗植株.[方法]以甘蔗品种ROC25为材料,进行愈伤组织、芽苗分化和生根的Hyg抗性筛选试验.利用农杆菌介导,将含MAR序列介导融合杀虫基因(AVAc-CpTI)导入甘蔗基因组.[结果]愈伤组织增殖、出芽时Hyg的最佳筛选浓度为50 mg/L,生根时Hyg的最佳筛选浓度为30 mg/L.获得13个MAR序列介导转基因表达基因系,48株Southern杂交阳性甘蔗植株;获得8个无MAR序列介导转基因表达基因系,7株Southern杂交阳性甘蔗植株.MAR序列介导转基因表达使转化过程中转基因系的获得数量提高了62.5%.[结论]建立了ROC25的潮霉素抗性筛选体系;MAR序列介导融合杀虫基因进行甘蔗遗传转化,可提高甘蔗外源基因转化效率.     

双价抗虫基因共转化烟草叶绿体的研究

 分别构建苏云金芽孢杆菌晶体毒蛋白基因 [BtCryIA(C) ]和水稻巯基蛋白酶基因 (Oryzacystatin ,OC)叶绿体转化载体 ,其中Bt基因叶绿体转化载体以烟草叶绿体基因trnH psbA trnK为同源片段 ,以水稻 (OryzasativaL .)叶绿体 psbA基因启动子和终止子为调控基因 ;OC基因叶绿体表达载体以烟草叶绿体基因片段 psbA ORF5 12为同源片段 ,以烟草叶绿体 16S启动子和终止子为调控基因 ;两载体均以壮观霉素抗性基因 (aadA)为筛选基因。利用基因枪方法 ,共转化烟草叶片 ,获得壮观霉素抗性植株。经Southern、Western检测、表达蛋白活性测定证明 ,双价抗虫基因己整合到烟草叶绿体中并得到表达。转基因植株抗棉铃虫试验表明 ,转基因植株具有显著杀虫活性     

CrylA杀虫基因的人工合成

苏云金芽孢杆菌(B.t.)杀虫蛋白,不仅专一性地杀死昆虫,而且对人、畜无毒无害。80年代中期,将酶切修饰后的B.t杀虫基因导入植物,获得了具有抗虫作用的转基因烟草及番茄植株,受到国内外科学家的高度重视。但导入棉花等植物后,由于表达量低,无抗虫效果。为了使原核B.t.杀虫基因能在真核植物体内有效地表达,使转抗虫基因植株获得抗虫能力,我们按照植物基因组优化密码子,在不改变B.t.杀虫蛋白氨基酸序列的前提下,完全人工合成了B.t.CryIA杀虫基因,经定性杀虫试验,具有生物杀虫活性。     

农杆菌介导BtCry1Ac、NTHK1双价基因转化烟草植株的研究

为探讨多基因植物转化载体p096899中外源基因BtCry1Ac和NTHK1在转基因植株中的表达情况,通过根癌农杆菌介导的叶盘转化法转化野生烟草,经卡那霉素筛选,初步获得了10株转基因烟草植株.经PCR鉴定,证明目的基因已被整合到烟草基因组中.利用荧光定量PCR和ELISA分析目的基因在转录水平和翻译水平的表达量,并对转基因烟草株系进行了抗虫试验和耐盐性试验.结果表明,目的基因在转录水平和翻译水平分别得到表达,但表达量存在差异,其中2号转基因株系毒蛋白表达量最高,其含量达可溶性总蛋白的0.028 5％;饲虫试验中,部分转基因烟草株系对斜纹夜蛾的毒杀作用明显高于未转化烟草,其中2号转基因株系的抗虫性最高,饲喂第6天斜纹夜蛾幼虫死亡率达到75.56％,与Bt毒蛋白表达量相一致;在盐胁迫下,转基因烟草的叶片生长状况均好于对照(非转基因)烟草的生长.证明BtCry1Ac基因和NTHK1基因的转入在一定程度上提高了烟草的抗虫性和耐盐能力.     

转cry2Ab4和vip3Aa11基因烟草对小地老虎杀虫效果研究

小地老虎严重危害农业生产,通过转基因技术提高作物对小地老虎的杀虫效果是一条切实可行的途径。cry2Ab4和vip3Aa11是从苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）中克隆到的两个杀虫基因。分别构建了pCS2Ab和pCSvip3A两种植物表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草（Nicotiana tabacum L.）NC89,并得到32株和35株阳性转基因植株。通过对其进行RT-PCR分析、Western杂交分子检测证实两种外源基因在烟草植株中可以正常表达。人工饲喂初龄小地老虎幼虫,对两种转基因植株进行生物活性检测,结果显示饲喂转基因叶片的小地老虎幼虫死亡率在82%以上,抗虫能力比对照显著提高,转vip3A植株抗虫效果优于转cry2Ab植株。     

转抗草甘膦基因烟草T-DNA侧翼序列的扩增与分析

[目的]研究抗草甘磷基因在烟草中的插入位点、T—DNA结构等整合情况。[方法]利用现有的3个转抗草甘膦基因的烟草材料,通过PCR Walking的方法扩增出携带抗草甘膦基因的T-DNA侧翼序列,并用DNAMAN、BLAST等生物信息学方法进行分析。[结果]对获得的PCR条带进行分析,结果表明这些侧翼序列均含载体骨架序列且结构各不相同。T-DNA和载体骨架序列都存在重组现象。[结论]研究在转基因植株中检测到了载体的骨架结构,说明转基因的同时有可能会造成非目的基因的转移,即转基因植物存在一定的风险,应对转基因植物转化载体和基因工程技术路线进一步改良。     

拟南芥两个MYB基因标签融合蛋白转基因植株的获得和鉴定

[目的]进行染色体免疫共沉淀（ChIP）试验,挖掘MYB类基因At3g11280和At5g05790所调控的下游基因。[方法]在构建了标签融合蛋白植物表达载体的基础上,利用农杆菌介导的转化将这些载体转入拟南芥植物中,获得转基因植株,并用Western blotting检测标签融合蛋白在转基因植株中的表达。[结果]拟南芥植株转基因的效率很高,4种标签蛋白融合载体的转化均获得了20株以上的转基因植株。随机对4种转基因植株的8株T1代植株进行Western blotting分析,结果表明4,种转基因植株中均鉴定出阳性植株。融合蛋白的条带大小在30 kD左右,将显色信号条带与Marker比对,显示条带大小与预测蛋白大小相符。[结论]这些有融合蛋白表达的转基因植株为ChIP试验的进行提供了重要材料。     

蜡梅凝集素基因克隆及其对蚜虫、蛞蝓抗性分析

 【目的】克隆蜡梅凝集素基因并研究其抗蚜虫和抗蛞蝓活性,为植物抗虫基因工程提供理论依据和试验材料。【方法】通过随机挑选克隆测序的方法,从蜡梅花cDNA文库中克隆蜡梅凝集素基因,并构建植物表达载体,用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,并对转基因植株进行抗蚜和抗蛞蝓试验。【结果】从蜡梅花cDNA文库中克隆到了一个凝集素基因CpLEC(GenBank登录号：DQ352145),该基因全长871 bp, ORF框长558 bp, 编码185个氨基酸。该基因DNA分析表明其不含内含子。具有单子叶植物甘露糖凝集素基因家族的特征,有2个典型的甘露糖结合位点(QXDXNXVXY),和1个变异的可能结合位点(HXGXNXVXY)。Southern杂交表明,该基因在蜡梅基因组中为多拷贝。构建了35S启动子控制下的CpLEC基因的植物表达载体pBI121-CpLEC,利用根癌农杆菌介导法转化烟草获得抗卡那霉素的植株。PCR和半定量RT-PCR分析表明,CpLEC基因已经整合到植物基因组中并在转录水平上得到了有效表达。抗蚜虫鉴定表明,转基因植株及其离体叶片有效地抑制了蚜虫的群体增长率,平均抑制率分别为60%和68%。抗蛞蝓试验结果表明转基因植株有明显的抗蛞蝓活性,转基因烟草虫害指数为0.17,远低于非转基因烟草的虫害指数0.96。【结论】克隆获得了蜡梅凝集素基因CpLEC,通过转基因手段分析其抗蚜和抗蛞蝓活性,结果表明该基因对抗虫基因工程有重要的应用价值。     

转基因拷贝数对农艺性状的影响

[目的]研究转基因拷贝数对转化植株农艺性状的影响。[方法]以农杆菌介导的遗传转化法获得的水稻转基因植株为材料,观察其株高、分蘖、扬花、籽粒形状及饱满度、抗虫性等。同时获取PCR为阳性的单株叶片进行Southern杂交,检测转入基因的拷贝数,研究转基因拷贝数对转化植株农艺性状的影响。[结果]T0代转基因植株的农艺性状有较多改变,如白化、矮化、分蘖少及种子畸型等。转基因植株的转基因拷贝数影响其农艺性状,拷贝数越多农艺性状改变越大,目标基因越容易受到抑制而不表达。在T0代表现感虫的转化植株其T1代也表现感虫。[结论]转基因植物商品化时,应选择单拷贝的转化植株。     

MAP30基因转化烟草的研究

通过转基因技术,利用农杆菌介导法,将pBIMAP30植物表达载体转化烟草,Kan筛选抗性苗,选择植株健壮、根系发达的抗性植株,提取叶片DNA进行PCR鉴定,获得阳性转基因烟草.采用RT-PCR方法证实MAP30基因能够在转录水平上正常表达.该研究为探讨具有药用价值的植物资源奠定理论基础,并为获得抗病毒、抗肿瘤功能性药物蛋白的植物新品系研发提供一定的技术支持     

糖基转移酶基因sm-Ngt1对水稻株高的影响

[目的]研究烟草中受甲基茉莉酸和水杨酸双重诱导的糖基转移酶基因sm-Ngt1过表达对水稻生长的影响。[方法]构建sm-Ngt1的植物表达载体,采用农杆菌浸染法转化籼稻粤泰B,对获得的阳性转基因植株进行高度检测。[结果]共获得117株阳性转sm-Ngt1植株。在成功转入sm-Ngt1基因后,水稻植株出现了不同程度的矮化,其中37%的转基因植株高度为71.4±9.8cm,27%的转基因植株高度为65.1±4.6cm,而未转基因的对照YTB的平均高度为130.0±4.3cm。[结论]为进一步研究sm-Ngt1的功能奠定了基础。     

转基因烟草中外源基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法,为转基因植物中外源基因拷贝数的检测提供参考.[方法]采用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法,检测转基因烟草中外源绿色荧光蛋白基因(GFP)的拷贝数,以烟草单拷贝的内源核糖核酸还原酶基因(RNR2)作为内参基因,建立相对定量的双标准曲线法检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法.[结果]构建RNR2基因、GFP基因实时荧光定量PCR的标准曲线,分别为y=-0.2858x+5.6695和y=0.2826x+2.1048,R2分别为0.9994和0.9989,相关性较高.在检测的5株转基因烟草中GFP基因的拷贝数分别为5、8、19、28和45,非转基因烟草植株的GFP基因拷贝数为0.[结论]建立的转基因烟草中外源基因SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法具有简单、快速、准确等优点,可用于基因工程中对优良转化植株的筛选及外源基因表达量的快速检测和定量分析.     

大豆GmGolS2-1基因高温胁迫诱导表达及转基因烟草鉴定

肌醇半乳糖苷合成酶(GolS)是棉籽糖系列寡糖(RFO)生物合成途径中的关键酶,在植物应对非生物胁迫过程中发挥重要作用.实时荧光定量RT-PCR结果显示,高温胁迫可以诱导GmGolS2-1在大豆幼苗中的表达.将GmGolS2-1基因构建到植物表达载体pRI101上并通过叶盘法转化烟草,经卡那霉素抗性筛选,PCR及qRT-PCR检测共获得6株阳性转基因烟草植株(OE1～OE6).对野生型烟草植株和GmGolS2-1转基因烟草植株进行高温胁迫处理,结果显示野生型烟草的电解质渗透率和丙二醛含量均高于转基因烟草.由此推测GmGolS2-1可以提高转基因烟草的耐热性.