农杆菌介导海岛棉茎尖遗传转化体系的建立

为建立高效的海岛棉遗传转化体系,本实验以新疆海岛棉(Gossypium barbadense L.)品种新海13号、新海14号、新海16号茎尖为转化受体,采用农杆菌介导法,研究不同苗龄茎尖、菌液浓度、侵染时间及共培养时间对基因转化的影响,建立了农杆菌介导海岛棉茎尖遗传转化体系。最佳转化体系为:将生长4 d的无菌苗茎尖浸入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌液浓度OD600为0.5的菌液中,浸染10 min,共培养48~72 h后,移至卡那霉素浓度为150 mg/L的选择培养基进行筛选,25 d后转移到生根培养基培养,获得抗性苗,经嫁接或者直接移栽,获得29株抗性植株;经过PCR和RT-PCR检测,初步证明抗除草剂5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase,EPSPS)已导入海岛棉基因组中。该转化体系的建立为海岛棉的转基因育种提供了技术支持。     

利用农杆菌侵染花柱头法进行海岛棉遗传转化

[目的]探索一种更为高效、简便的海岛棉遗传转化技术,为海岛棉转基因育种提供技术支持。[方法]采用农杆菌侵染花柱头法,在不同时间侵染对4个海岛棉品种进行遗传转化,分析其对海岛棉的成铃率,田间卡那霉素抗性率及PCR阳性株率的影响。[结果]农杆菌侵染花柱头法的平均成铃率为12.60%,田间卡那霉素检测的平均抗性率为9.87%,PCR鉴定的平均阳性株率为1.72%。花后12 h进行转化,成铃率、抗性率和阳性株率均最高,分别为20.25%、11.68%和2.59%。[结论]在花后12 h利用农杆菌侵染花柱头法进行海岛棉遗传转化,转化效率最高。     

棉花抗枯萎病相关GhB301基因对烟草的遗传转化及功能分析

[目的]ERF是乙烯信号传导途径中的重要转录因子,在植物与病原菌互作中发挥着重要的调控作用.棉花抗枯萎病相关GhB301基因是从棉花中获得的ERF-B3亚组基因,探索该基因在烟草异位表达后的功能,为进一步研究其在棉花抗枯萎病中的功能奠定基础.[方法]以pPZP35S表达载体为基础,构建GhB301的过表达载体;采用农杆菌介导法转化烟草并获得转基因植株.[结果]经卡那霉素筛选、PCR和RT-PCR检测,获得3株转基因阳性植株;qPCR分析显示,转基因阳性植株中部分病程相关蛋白基因的表达量较野生型明显升高.[结论]棉花抗枯萎病相关基因GhB301在烟草中异位表达后可能会通过增强部分病程相关蛋白基因的表达来提高植株抗病性.     

基因枪介导的海岛棉(Gossypium barbadense L.)茎尖遗传转化体系的建立

以新疆海岛棉品种新海13号的茎尖为转化受体,采用基因枪介导法,研究DNA包裹浓度、微载体种类、前渗处理时间、轰击条件、筛选方法等对茎尖转化的影响,建立了基因枪法介导的海岛棉茎尖转化体系。研究结果表明,采用1.5μg·μL-1的质粒DNA包裹1.0μm金粉微载体,前渗处理12 h,轰击压力为7.584 MPa(1100 psi),轰击距离为6 cm,后渗处理16 h,恢复处理24 h,在120 mg·L-1卡那霉素浓度下直接筛选35 d。在添加4g·L-1活性炭粒的生根培养基中诱导抗性幼苗生根,获得抗性再生植株。通过PCR和RT-PCR检测,共得到5株转抗除草剂基因EPSPS的阳性植株。该研究体系的建立为海岛棉的遗传转化奠定了基础,为海岛棉的育种工作提供了材料。     

棉花抗枯萎病相关转录因子基因GhERFB101的克隆与表达分析

为了探究ERF转录因子家族与棉花枯萎病抗性之间的关系,也为海岛抗枯萎病品种的选育工作提供新的基因资源,从Solexa高通量测序技术建立的棉花基因表达谱中筛选探针序列,通过电子克隆结合RT-PCR技术从高抗枯萎病的棉花品种中棉所12中克隆到一个新的ERF-B1亚组转录因子基因,命名为Gh ERFB101(Gen Bank:KF850521)。序列分析表明,该基因开放阅读框738 bp,编码245个氨基酸,含有一个保守的AP2/ERF结构域,在进化上与拟南芥At ERF11的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析显示,枯萎病菌诱导后,Gh ERFB101基因在抗病品种根中的表达量呈现下降趋势;而在感病品种中,该基因呈上调表达,随着病菌处理后时间延长,其表达量呈现先增加后降低的变化趋势,在病菌处理后12 h表达量达到最大,在48 h下降到最低。乙烯和茉莉酸诱导后,该基因表达量均呈现明显的先增加后降低的变化趋势,在乙烯处理后2 h基因的表达量达到最大;茉莉酸则在处理后1 h基因的表达量达到最大;而水杨酸诱导后基因的变化幅度不大;推测该基因可能通过茉莉酸、乙烯信号传导途径参与对枯萎病菌的防御反应。     

枯萎病菌诱导感、抗陆地棉品种的转录因子表达变化

以陆地棉抗病品种中棉所12和感病品种新陆早7号为材料,利用Solexa高通量测序技术调查枯萎病菌诱导后不同时间感、抗陆地棉品种转录因子家族及转录因子的表达情况。结果表明,枯萎病菌诱导后,抗病品种中棉所12有39个转录因子家族的433个转录因子在至少一个比对组中表达活性发生变化;感病品种新陆早7号则有52个转录因子家族的588个转录因子在至少一个比对组中表达活性发生变化。新陆早7号对枯萎病菌响应的转录因子及转录因子家族的数目明显多于中棉所12,且2个品种的下调基因数目均多于上调基因。随着枯萎病菌诱导后时间延长,两品种对枯萎病菌诱导响应的转录因子家族及转录因子数量均呈现先增加后降低的变化趋势,中棉所12在枯萎病菌诱导后6 h达最多,而新陆早7号在诱导后3 h达最多。在6个比对组中,表达活性均发生变化的重叠转录因子,中棉所12中有9个,隶属于6个转录因子家族;新陆早7号中有31个,隶属于17个转录因子家族。不同抗病性品种对枯萎病的响应有较强的品种特异性,除37个共有的转录因子家族外,2个转录因子家族是中棉所12所特有,15个转录因子家族是新陆早7号所特有。     

应用Solexa测序技术分析棉花不同抗病品种的数字表达谱

棉花枯萎病是一种危害严重的世界性病害,构建棉花枯萎病不同抗病品种的基因表达谱将为进一步研究棉花抗枯萎病的分子调控机制及筛选抗枯萎病相关基因奠定基础.本研究选用高抗枯萎病的陆地棉品种中棉所12和高感枯萎病的陆地棉品种新陆早7号为材料,利用Solexa高通量测序技术分析棉花幼苗根部组织中的基因表达情况.Solexa高通量测序后构建了多达350万个reads的标签文库,根据已知序列信息,显著差异表达基因1 080个,其中上调基因302个,下调基因778个.基因功能分析表明,已注释的显著差异表达基因可划分为分子功能、生物过程和细胞组件3个功能注释本体,并进一步细分为37个功能类别.鉴定出112条代谢通路,注释了1 238个显著差异表达基因,共涉及氨基酸代谢、多糖的生物合成和代谢、脂类代谢、能量代谢及信号转导等方面.在植物激素信号转导通路分析中,涉及到26个已知功能基因,4个基因编码AP2/ERF转录因子,4个基因与LRR类受体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶或蛋白激酶有关,5个基因与蛋白磷酸酶2C有关,而这些基因都参与植物的抗病反应.随机抽取5个基因进行实时荧光定量PCR验证,其结果与测序结果一致.本研究初步揭示了棉花枯萎病抗感品种在转录组水平上的表达差异,获得了大量差异表达基因.     

海岛棉丛生芽的诱导及再生

[目的]探索最佳海岛棉丛生芽诱导及再生的激素组合,为海岛棉的遗传转化奠定基础.[方法]以海岛棉品种新海13号、新海14号和新海16号的茎尖为材料,研究不同激素浓度和激素配比对海岛棉茎尖丛生芽诱导和生根的影响.[结果]在MSB培养基中添加1.0 mg/L的6-BA时,丛生芽生长状况最好,平均丛生芽率最高,为41;;在1/2 MSB培养基中添加浓度为0.3 mg/L的NAA和3.0 mg/L的IBA,平均生根率达到60;.[结论]不同品种海岛棉丛生芽的诱导存在一定差异,但均可获得再生植株.