农杆菌介导转化蝴蝶兰遗传体系的研究

为建立蝴蝶兰植株的高效遗传转化体系,以蝴蝶兰花梗腋芽诱导的类原球茎体为受体材料,利用农杆菌侵染并在侵染前后辅以超声波及负压处理的方法将gus基因导入到蝴蝶兰中,经过近90 d的筛选,获得了69个抗卡那霉素抗性PLB,经X-gluc组织化学染色法观察检测,表达率最高达39%,并获得了50株再生蝴蝶兰,其中17株PCR检测呈阳性。初步建立了蝴蝶兰遗传转化体系。另外,我们在农杆菌侵染前后辅以超声波及负压处理,可以提高转化效率。     

农杆菌介导的紫穗槐茎段愈伤组织遗传转化研究

采用农杆菌介导法对紫穗槐茎段诱导的愈伤组织进行遗传转化研究。确定了卡那霉素临界耐受浓度为40mg/L。菌液浓度与侵染时间的正交试验结果表明:侵染菌液OD600为0.8、侵染时间为30min时转化效率最高,达17.95%。GUS染色检测分析表明:含pBI121-GUS质粒DNA农杆菌侵染转化的愈伤组织其抗性不定芽和再生植株根和叶均呈蓝色。转化植株叶PCR检测结果表明外源GUS基因已整合到紫穗槐基因组中。以上结果表明建立了以茎段诱导愈伤组织为转化受体、农杆菌介导的紫穗槐高效遗传转化体系。为了验证其可重复性,又进行了pBI121-GFP基因的转化,T0代再生植株PCR检测整合率达85%,在488nm蓝光源激发下转化株的顶芽产生绿色荧光,说明转入的基因在35S启动子下过量表达。此遗传转化体系可应用于转基因育种。     

天山雪莲遗传转化体系建立

采用根癌农杆菌介导法进行GFP基因的遗传转化,建立了农杆菌介导天山雪莲遗传转化体系。以天山雪莲胚性愈伤组织为受体;40 mg/L的卡那霉素为胚性愈伤组织筛选质量浓度;胚性愈伤组织预培养2 d后用含100μmol/L AS和500 mg/L脯氨酸的感染工程菌液侵染25 min,能够取得比较理想的转化效果。对8株卡那霉素抗性植株进行PCR及GFP荧光蛋白检测,共获得6株阳性植株。结果表明GFP基因已整合到天山雪莲的基因组中并得到表达。     

绿色棉花再生体系研究(摘要)(英文)

[目的]对农杆菌法介导的绿色棉花茎尖转化体系进行筛选优化,为基因工程辅助彩棉育种提供参考。[方法]以天然绿色棉花的茎尖作为受体,采用农杆菌介导的转化方法,筛选绿棉茎尖再生体系的最佳条件,包括茎尖外植体最佳苗龄的筛选,激动素(KT)最适浓度的筛选,卡那霉素(Kan)敏感浓度的筛选,农杆菌菌液最佳侵染浓度的筛选以及真空渗透条件的优化筛选。[结果]3日龄的绿棉茎尖为最佳转化外植体;在OD600值为0.5的农杆菌菌液中侵染10min,同时辅助真空渗透的侵染效果最佳;在茎尖最适培养基MS+lmg/LKT,pH值5.8上共培养24h,转至Kan浓度梯度为30、50、70mg/L的筛选培养基上选择培养,茎尖分化苗阳性率达34.6%,并获得了绿棉9804的Kan阳性苗。[结论]绿色棉花比白色棉花更有利于进行遗传转化。     

根癌农杆菌介导Barnase基因转化‘美人指’葡萄的研究

以'美人指'葡萄离体叶片及叶柄为农杆菌介导转化Barnase基因的受体,对农杆菌侵染时间、共培养时间、预培养时间、卡那霉素选择压以及头孢霉素浓度等因素进行了研究.结果表明:最佳的农杆菌介导'美人指'葡萄遗传转化体系为农杆菌侵染4 min,共培养3 d,预培养3 d,卡那霉素选择压3.0 mg·L-1,头孢霉素质量浓度250 mg·L-1.采用此体系对'美人指'葡萄进行转化,共获得了12株抗性苗,农杆菌感染后的不定芽再生率为1.78%.利用GUS组织化学染色、PCR扩增的方法进行检测,结果表明,其中只有2株GUS染色呈阳性,阳性率为16.67%;有3株通过了PCR检测,初步证实Barnase基因已经整合进入'美人指'葡萄基冈组中.     

农杆菌介导的中华补血草遗传转化体系的建立

[目的]为利用转基因技术培育中华补血草新品种奠定基础。[方法]对农杆菌介导的中华补血草转化体系中的各种影响因素进行了系统研究,以构建中华补血草的遗传转化体系。[结果]中华补血草叶片对卡那霉素敏感,以50 mg/L卡那霉素作为补血草叶片转化受体较为适宜。400 mg/L特美汀能有效抑制农杆菌,而500 mg/L头孢曲松钠则不能。菌株EHA105对中华补血草的转化率达15%,远高于菌株LBA4404和GV3101。对于侵染中华补血草无菌苗叶片的重悬菌液,以OD600为0.7~1.0为宜。4 d共培养的效果较好,15.6%外植体可分化成芽。PCR检测结果表明30株卡那霉素抗性植株均为阳性,而阴性对照未扩增到条带,表明NPTⅡ外源基因已整合到受体植物基因组中。[结论]影响中华补血草转化率的关键因素是农杆菌菌株的选择。     

MdSPDS1基因导入毛白杨的遗传转化体系优化研究

为了建立农杆菌介导的高效毛白杨遗传转化体系,并大量获得转MdSPDS1基因的转基因毛白杨,对MdSPDS1基因导入毛白杨的遗传转化体系中关键转化因子进行了优化。获得的优化转化体系如下:叶片预培养3d后,用OD600为0.4的菌液侵染7min,再共培养3d。卡那霉素抗性芽的二次筛选中,卡那霉素的选择压分别为20和50mg/L。实验获得毛白杨卡那霉素抗性植株共43株,经PCR检测,其中9株呈阳性,占抗性植株总数的20.9%,优化转化系统的阳性植株转化率达到9.38%。本研究为下一步鉴定基因功能和转基因植株耐盐性的分析奠定了基础。     

农杆菌介导甜高梁转Bt cry1Ah的研究

[目的]建立一套高效、稳定的甜高梁农杆菌遗传转化体系,并在甜高梁中验证来源于苏云金芽胞杆菌新型杀虫基因cry1Ah表达产物的杀虫活性.[方法]以甜高粱幼穗愈伤组织为转化受体,通过农杆菌介导法将密码子优化过的Bt cry1Ah导入2个甜高梁品种"BABUSH"和"MN-3025"中.对获得的再生植株进行 PCR检测、RT-PCR分析及除草剂抗性、目的蛋白表达水平和抗虫性鉴定分析.[结果]对336块幼穗愈伤组织块进行了农杆菌侵染,经双丙氨膦(Bialaphos)梯度筛选后共获得66株再生植株,PCR鉴定在8个转化事件中有22株为阳性植株,平均转化率为2.38%.RT-PCR检测结果表明,cry1Ah在T.甜高梁转基因植株中能够正常转录.Western blotting分析和ELISA定量测定显示,有5株可检测到Bt蛋白,但Bt蛋白含量差异较大,最高可达165.69ng·g-1叶片鲜重(FW),最低的仅为1.93 ng·g,-1叶片鲜重(FW),平均为87.50 ng·g-1FW.饲虫试验表明,有2株转基因甜高粱植株对亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)表现为抗性.[结论]利用建立的以甜高粱幼穗为外植体的农杆菌遗传转化体系,可获得具有玉米螟抗性的转基因甜高粱植株,其后代遗传稳定性还有待于进一步的研究.     

绿色棉花再生体系建立的研究

[目的]对农杆菌法介导的绿色棉花茎尖转化体系进行筛选优化,为基因工程辅助彩棉育种提供参考。[方法]以天然绿色棉的茎尖作为受体,采用农杆菌介导的转化方法,筛选绿棉茎尖再生体系的最佳条件。[结果]3日龄的绿棉茎尖为最佳转化外植体;在OD600值为0.5的农杆菌菌液中侵染10 min,同时辅助真空渗透的侵染效果最佳;在茎尖最适培养基MS＋l mg/LKT,pH值5.8上共培养24 h,转至Kan浓度梯度为30-50-70 mg/L的筛选培养基上选择培养,茎尖分化苗阳性率达34.6%,并获得了绿棉9804的Kan阳性苗。[结论]绿色棉花比白色棉花更有利于进行遗传转化。     

根癌农杆菌介导欧美杨108遗传转化体系的优化

[目的]优化根癌农杆菌介导的欧美杨108遗传转化体系。[方法]以欧美杨108无菌苗的叶片为外植体,通过农杆菌介导法对其遗传转化体系进行优化研究。[结果]试验获得的优化转化体系如下:农杆菌介导欧美杨108遗传转化的潮霉素最佳叶片分化浓度为2mg/L,生根浓度为1 mg/L。优化筛选的最适转化条件为:预培养48 h,菌液浓度OD600为0.4,侵染15 min,共培养48 h。试验共获得18个抗性愈伤和抗性芽,转化频率为4.3%;经PCR检测初步证明TCS基因已整合至欧美杨108再生植株中。[结论]该研究建立了高效欧美杨108叶片农杆菌介导的遗传转化体系。     

昆虫抗冻蛋白转基因植物表达载体的构建及转基因棉花T_1代的检测

【目的】为了提高转基因质粒的表达效果,基于pCAMBIA2300植物表达载体,改造并构建含有小胸鳖甲抗冻蛋白基因Mpafp149、双CaMV35S启动子、Ω增强子和NOS终止子的高效植物表达载体pCN2300-Mpafp149。【方法】将抗冻蛋白基因采用不同的注射方法对新疆北疆棉区主栽棉花品种进行了花粉管通道法遗传转化。对获得的转基因棉花T_1代植株进行PCR及RT-PCR检测。【结果】对Mpafp149、卡那霉素抗性基因NPTⅡ及CaMV35S进行PCR检测,3个结果的阳性一致率达到了80%。此外,通过磨短进样器针头的长度可大幅提高成铃率,直接注射新陆早42号的成铃率达到了37.59%。【结论】小胸鳖甲抗冻基因Mpafp149已转入T_1棉花。通过使用改造的进样器注射可大幅提高成铃率。     

干旱对特早熟陆地棉光合特性与产量的影响

[目的]为了解特早熟棉花光合特性及产量性状对干旱的适应性,以及光合特性与产量性状之间的关系.[方法]在正常灌溉和水分胁迫下,采用Li-6400光合测定系统对60个棉花种质资源功能叶片光合参数以及产量性状进行了研究.[结果]光合速率在水分胁迫下普遍有所下降,光合速率(Pn)在蕾期和花期变异较小,苗期和铃期的光合速率变异性较大.籽棉产量、单株铃数、皮棉产量对水分较为敏感,而单铃重和衣分变化不大;正常灌水时棉花籽棉产量性状与光合参数间无显著的关系,而干旱时,棉花籽棉产量与光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、胞间CO2浓度(Ci)和气孔导度(Gs)存在极显著的正相关.聚类分析表明正常灌溉和水分胁迫下的结果不同.[结论]在选育棉花抗旱品种时,将棉花资源材料在干旱条件下进行选择为好,可将干旱时花铃期光合速率作为抗旱的主要参数.     

不同棉花品种对棉铃虫发育和危害的影响

[目的]为新疆棉花抗虫育种及害虫防治提供依据。[方法]分别采用室内饲养与室外接虫的方法,研究棉铃虫对石河子地区12个棉花主栽品种（新陆早10、12、13、21、23、28、33、36号和中棉42、ZM-1、标杂A1、新炮台1号）的危害情况。[结果]各棉花品种田间2代棉铃虫卵量为（9.2～35.7）粒/100株;田间落卵量与棉花叶片茸毛密度并不完全呈正相关。室外网室鉴定结果表明,各棉花品种的平均蕾铃受害率为15.75%～28.50%,其中标杂A1受害最轻,新陆早21、33、36号受害较重。室内饲养结果表明,用新陆早36号和ZM-1饲养的棉铃虫死亡率最低,均为5%,用标杂A1饲养的棉铃虫死亡率最高,为55%。[结论]石河子地区棉花主栽品种对棉铃虫的耐害性均不高。     

新品种常棉1号生物学特性的研究

[目的]更好地发挥常棉1号的增产潜能,为其大面积栽培提供理论基础。[方法]以湘杂棉8号为对照,研究棉花新品种常棉1号根、茎、叶的生长特性及其分枝情况、现蕾特性、开花习性、结铃特性、吐絮情况、产量和抗性。[结果]常棉1号全生育期150d左右,根系为直根系,株高适中,110cm左右,叶呈掌状,中等大小,叶色深绿;株型塔型,分枝较多,果枝18~19盘;现蕾、开花、结铃、吐絮时间较早,蕾多、花量大、结铃性强,棉绒较长,棉纤维品质较好,有效铃占总铃数的86%,产量高于对照;抗病虫能力较强,在华中地区有较强的适应能力。[结论]常棉1号为中熟型高产品种,适宜在华中棉区推广。     

博尔塔拉州膜下滴灌棉田氮肥施用技术研究

[目的]探讨适宜博尔塔拉州滴灌棉区的氮肥施用技术.[方法]通过田间小区试验对滴灌条件下不同质地和不同肥力棉田氮肥施用技术进行研究.[结果]肥力较低的滴灌棉田氮素最佳经济用量为248.6 kg/hm2,最佳经济产量为2 158.9 kg/hm2;肥力较高的棉田氮素最佳经济用量为310.9 kg/hm2,最佳经济产量为2 236.5 kg/hm2.氮肥用量一致的条件下,适量基施有提高产量的作用,肥力较低的砂壤土滴灌棉田以30;作基肥,70;滴施效果最好,按照"前轻、中重、后补"的原则,从盛蕾期到铃期持续滴施对提高铃重、增加铃数进而提高产量有明显的作用;中高肥力的壤土上,集中在盛蕾期到花铃期持续滴施即可满足棉花的需氮要求.[结论]膜下滴灌棉田氮肥用量控制在尿素525.0～560 kg/hm2,可以获得较高的产量和收益.     

基因枪介导棉花成熟种子胚尖的遗传转化

为建立良好的棉花遗传转化系统,本研究采用基因枪轰击棉花成熟种子胚尖的方法,将本实验室克隆的抗黄萎病相关基因GhDAHPS转化到棉花中。抗生素抗性鉴定结果表明:在基因枪轰击的309个胚尖中,有90株为卡那抗性植株,进一步通过PCR检测这些抗性植株,其中有5株呈阳性,PCR阳性率为1.6%。结果表明:基因枪转化棉花成熟种子胚尖是可行的,相对于其他转化方法,具有操作简便,植株成苗较快,转化周期短等优点。     

沿江棉区杂交抗虫棉高产优质种植密度研究

[目的]研究在不同种植密度下棉花生长状况、棉铃特征和产量变化,为沿江棉区找寻高产优质的合理种植密度提供理论参考。[方法]以湘杂棉8号为试验材料,起始密度为12000株/hm2,密度梯度为9000株/hm2,共设6个处理。研究其生长周期、产量、棉铃、棉纤维等特征变化。[结果]密度对棉花的株高和其各生长周期影响不大,不同密度处理中籽棉衣分、纤维品质差异不明显,但对单铃重、＂三桃＂分布、蕾铃脱落率、僵烂比及产量等均有较大影响,且差异显著。基本规律为：棉花单铃重和伏桃比随着种植密度增加而降低,脱落率和僵烂比随着密度增加而增加;但都在处理5时表现最差。皮棉产量以处理2、3和4较高,最高的为处理3,密度最低的处理1产量最低。[结论]通过试验数据分析,在沿江棉区种植杂交抗虫棉以30000株/hm2的种植密度最佳。     

麦后直播短季棉地膜覆盖效应试验

[目的]探索短季棉麦后直播的地膜覆盖栽培技术。[方法]以中棉所50为试材,通过覆膜与不覆膜对照2个处理,研究了不同处理对土壤水分、地温、叶面积及产量的影响。[结果]地膜覆盖后,土温显著增。地膜覆盖45 d,5、101、5 cm各土层增加积温分别为123.74、105.75和87.5℃;土壤水分含量也有提高。与对照相比,地膜覆盖后麦后直播的短季棉苗期、蕾期的叶面积增长速度快,现蕾期早4 d,开花期早6 d,吐絮期早8~10 d,株高高3.1 cm,单株叶片多2.2个,果枝增加1.3个,蕾增加2.7个,霜前花率提高11.15%,比对照增产33.2%。[结论]短季棉麦后直播地膜覆盖可以明显增加单株铃数、单铃量、霜前花,显著提高皮棉产量。     

大豆子叶节对卡那霉素的敏感性研究

[目的]研究大豆子叶节对卡那霉素的敏感性,以期为大豆的遗传转化和抗性筛选提供试验依据。[方法]选用3个不同基因型大豆为试验材料,以黄化率和分化率为指标,研究了不同浓度的卡那霉素对大豆子叶节分化和丛生芽生根的影响。[结果]不同基因型大豆对卡那霉素的敏感性不同,子叶节分化的卡那霉素临界筛选浓度为:垦农18为40 mg/L、绥农14和垦农4为60 mg/L;丛生芽生根的卡那霉素临界筛选浓度为:垦农18为15 mg/L、绥农14和垦农4为20 mg/L。[结论]该研究结果为大豆的遗传转化和抗性筛选奠定了基础。