反义4CL1基因转化烟草调控木质素生物合成

将控制木质素生物合成的关键限速酶 (香豆酸CoA连接酶 ,4CL)基因 4CL1反向插入植物表达载体pBI12 1构建表达载体 ,通过农杆菌叶盘法介导转化烟草 ,获得一批转基因抗性植株 .经PCR检测 ,证明 4CL1基因已成功反义转入到烟草植株中 .通过对转基因植株和对照植株的纤维素和木质素含量的对比分析 ,发现反义 4CL1基因转化植株的纤维素含量比对照提高了 11 4 % ,而木质素含量比对照降低了 19 1% .     

反义CCoAOMT基因转化烟草调控木质素生物合成

通过农杆菌介导法将美洲黑杨CCoAOMT cDNA反向导入烟草,获得一批转基因抗性植株.经PCR检测,证明CCoAOMT基因已成功反义转入到烟草植株中.通过对转基因植株和对照植株木质素含量的对比分析,大部分转基因株系木质素含量均有不同程度下降,下降最多的达9.2%.     

EuCAD基因不同位置片段RNAi对烟草木质素合成的调控效果

为尾叶桉GLU4无性系肉桂酰乙醇脱氢酶基因(EuCAD)调控其木质素的合成提供技术参考,以模式植物烟草为试验材料,采用生物信息学技术分析其EuCAD基因序列,根据保守结构域的分布情况选择EuCAD基因不同位置的4个片段(S1、S2、S3和S4)分别构建RNA干扰载体并转化烟草后获得转基因烟草植株(pS1、pS2、pS3和pS4),检测分析转基因烟草植株中CAD基因表达水平、茎部解剖结构、木质素及纤维素的含量变化。结果表明：S1和S2片段对木质素的调控效果最明显,其转基因烟草植株pS1和pS2的基因表达水平分别较野生型降低87.48%和87.30%,木质素含量较野生型降低15.26%和11.44%;S3和S4片段的调控效果较差,pS3和pS4多项表型检测结果与野生型相比降幅较小或无差异。     

GRP1.8融合反义4CL1基因调控烟草木质素生物合成

该研究成功地将从刺槐 (Robiniapseudoacacia)中克隆得到的定位于形成层表达的GRP1 8启动子 ,分别与GUS报告基因及从毛白杨 (Populustomentosa)中克隆的香豆酸连接酶 (4CL1)基因连接构建成GRP1 8 GUS和GRP1 8 anti 4CL1融合基因 ,转基因于烟草植物 .经组织化学检测分析 ,GUS基因成功地由GRP1 8启动子驱动定位于形成层表达 ;融合基因GRP1 8 anti 4CL1的表达明显地改变了转基因烟草植株的木质素和纤维素的含量和比例 .转基因烟草的木质素含量较对照平均降低了 13 7% ,而转基因植株的纤维素含量较对照升高了 15 6 % .     

抑制CCoAOMT表达对烟草木质素生物合成的影响

 通过农杆菌介导法将毛白杨CCoAOMTcDNA反向导入烟草。PCR、PCR Southern和Northern点杂交检测表明 ,CCoAOMTcDNA已反向整合到烟草基因组中并在转录水平表达。将转基因株系移栽温室 3个月后 ,以Klason法测下部茎木质素含量。与对照相比 ,大部分转基因株系木质素含量均有不同程度的下降 ,其中下降最多达 37%,表明抑制植物内源CCoAOMT的表达可有效地降低木质素含量。     

苎麻CCoAOMT基因干扰表达载体构建及对烟草的转化

根据已克隆的苎麻CCoAOMT(咖啡酰辅酶-A-氧甲基转移酶)基因cDNA序列,以其编码纤维素合成酶底物结合和催化合成结构域的 cDNA 序列为目标,采用PCR扩增方法引入克隆的酶切位点,分别将其正、反方向克隆到植物RNA干扰表达质粒PFGC5941 T-DNA上CHSA内含子两侧,构建了植物表达苎麻CCoAOMT基因的干扰重组Ti载体.将该载体转入根癌农杆菌LBA4404后,采用农杆菌介导法对木质素研究的模式烟草WS38进行了遗传转化,抗性筛选和分子检测表明,成功获得了转基因植株.转基因植株生长延缓,表明可能存在基因表达干扰现象.     

基因操作调控木质素含量和组分的研究进展

木质素作为木材的主要化学成分,在植物中具有重要的生物学功能。然而它的存在却制约了制浆造纸工业的发展,导致环境污染。因此,近来的试验期望通过调控木质素合成途径中的相关基因,来提高制浆造纸生产中原材料的质量。简要介绍了木质素生物合成中酶的调控对转基因植株木质素含量和组分,以及田间生长一定时期后的转基因植株对制浆影响的研究概况。适宜的低木质素含量和合理组分的转基因植株木材有望改善制浆造纸工业的经济和环境效益,实现该产业的可持续发展。     

‘砀山酥梨’果实CCoAOMT基因的克隆与表达分析

[目的]通过克隆‘砀山酥梨’(Pyrus bretschneideri ‘Dangshansuli’)果实中咖啡酰-辅酶AO-甲基转移酶(CCoAOMT)基因的全长序列,并对其进行生物信息学及基因表达差异分析,阐释了其在梨果实木质素合成途径的作用,以期为今后利用基因调控技术来改变果实中石细胞含量从而改善梨果实品质提供一定的理论依据。[方法]以15年生‘砀山酥梨’果实为试材,根据从NCBI数据库中搜索得到关于植物木质化的CCoAOMT基因序列与梨基因组数据库调取的序列比对,利用RT-PCR技术克隆得到了木质素生物合成途径中的一种关键酶基因PbCCoAOMT,GenBank登录号为KJ577544。[结果]该基因全长1133bp,具有1个744bp的完整开放阅读框(ORF),编码247个氨基酸。序列比对及系统进化树分析表明:CCoAOMT酶是氧甲基转移酶类,与其他植物CCoAOMT编码的蛋白序列有较高的相似性,尤其与枇杷的相似度最高,达到98.79%,且亲缘关系最近。利用荧光定量PCR技术对其在果实不同发育时期表达模式的分析发现,基因表达量呈先上升后下降的趋势,与梨果实中石细胞含量的变化趋势相似。[结论]初步认为从‘砀山酥梨’中克隆得到的PbCCoAOMT基因可能参与了梨果实中木质素的代谢。     

GRP1.8-反义pt4CL1基因对巨尾桉 木质素含量的影响

桉树是桃金娘科桉树属(Eucalyptus）植物的统称,是制浆造纸的主要原料之一,但是桉树中含有大量木 质素,木质素的存在会严重影响纸浆的质量。4-香豆酸颐辅酶A 连接酶(4CL）是木质素单体生物合成的关键酶之一, 抑制4CL 基因的表达,可以有效降低植物中木质素的含量。通过根癌农杆菌介导的叶盘转化法,将形成层定位启动 子GRP1.8 融合的杨树反义4-香豆酸:辅酶A 连接酶基因导入巨尾桉,经卡那霉素筛选和PCR 鉴定,获得9 株转基 因阳性植株。通过4CL 酶活性测定和木质素、纤维素含量的分析,发现转基因组培苗的4CL 酶活性比对照植株下降 了44%,温室转基因幼苗中硫酸木质素含量下降了16%。     

EuCAD 基因小片段 RNAi对烟草木质素合成的影响

【目的】深入研究尾叶桉(Eucalyptus urophylla)肉桂酰乙醇脱氢酶(CAD)基因序列中的关键片段并利用其进行木质素合成调控。【方法】采用生物信息学工具对EuCAD基因进行序列分析,根据编码蛋白保守结构域的分布情况进行筛选,获得一段44 bp关键序列用于构建RNA干扰载体并转化烟草,获得转基因植株并对基因表达水平、木质素含量等表型进行检测。【结果】获得28个转基因株系,转基因植株正常生长发育,与野生型无异,随机挑选3个株系进行检测,发现CAD基因表达水平均较野生型显著降低,以R1株系降幅最大,降至野生型的12.51%。对R1株系进一步检测发现,其茎部直径与野生型无异,但木质部厚度较野生型显著降低,其中第4节处降低11.75%,第6节处降低10.06%,茎部整体木质素含量较野生型降低15.26%。表明该RNAi片段显著抑制烟草中CAD基因表达并影响烟草木质素合成。【结论】通过序列分析筛选出的EuCAD基因小片段,可通过RNA干扰显著影响烟草木质素合成,为尾叶桉木质素合成调控研究提供了技术参考。     

桉树树皮化学成分分析

[目的]采用我国木材化学成分分析国家标准,对人工林桉树树皮的化学成分进行了测定和分析。[方法]测定桉树树皮的综纤维素、纤维素、木质素、灰分、抽提物含量,并与其他4种植物进行比较。[结果]人工林桉树树皮化学成分含量分别为,综纤维素79.35%,纤维素46.81%,木质素19.69%,1%NaOH抽提物19.83%,冷水抽提物5.30%,热水抽提物8.11%,苯醇抽提物2.63%,灰分2.82%。[结论]桉树树皮综纤维素、纤维素、灰分、抽提物含量较高,木质素含量较低。     

Energy Productivity Potential Assessment of Saccharum spontaneum L. Germplasm Resources

[Objective]The energy productivity potential of Saccharum spontaneum L.germplasm resources as energy plants was discussed in this paper.[Method]The energy productivity potential of Saccharum spontaneum L.germplasm resources collected from the wild was assessed from the aspects of cellulose,semicellulose,lignin and crude ash contents and caloric value.[Result]The total content of cellulose and semicellulose ranged from 41.75%to 69.13%,the lignin content ranged from 2.16%to 11.75%,the crude ash content ranged from 4.79%to 9.34%and the caloric value ranged from 16.00 to 17.69 MJ/kg among the 30 Saccharum spontaneum L.germplasms.Compared to other plants,Saccharum spontaneum L.had higher contents of cellulose and semicellulose,a higher caloric value but lower contents of lignin and crude ash.[Conclusion]From the perspective of producing fuel ethanol with lignocellulose,Saccharum spontaneum L.has a great potential for development as an energy plant.     

正义、反义、干涉调控肉桂酰辅酶A脱氢酶基因对烟草的影响

肉桂酰辅酶A还原酶(Cinnamoyl-CoA reductase,CCR)是在木质素合成途径中起到关键作用的酶,负责催化肉桂酰辅酶A类物质的还原反应生成相应的醛类化合物.分离得到毛白杨CCR基因的cDNA.将CCR基因以正义、反义和干涉的形式,通过农杆菌介导的方法转入烟草中,Southem杂交以确定转基因成功.在获得的转基因植株中,所有下调基因的植株都表现出可溶性酚酸含量下降,木质素含量也有明显的下降趋势,纤维素含量则有上升,可能是对木质素含量下降的一种代偿性增长.植物细胞壁组分的含量变化表明CCR基因可能是一个控制木质素代谢途径的一个很好的调控点.     

近红外光谱法快速测定河南烟叶中木质素的含量

[目的]实现对河南烟叶中木质素含量的快速测定。[方法]首先改进了烟叶中木质素含量的测定方法,并对该方法测定的准确性进行了评定(对同一样品,8次平行测定的RSD值为3.58%),随后用此方法测定了河南地区95个初烤烟叶样品中的木质素含量,然后用近红外光谱仪采集相应的光谱,进行二阶微分处理和平滑预处理后,用偏最小二乘法和完全交互验证方式建立相应预测模型。[结果]试验建立的烟叶中木质素预测模型的相关系数达到96.13%,内部交叉检验均方根误差(RMSECV)为0.104,说明烟叶中木质素含量和近红外光谱之间存在较好的相关性。[结论]采用近红外光谱法可以快速预测河南烟叶中木质素含量。     

产地·等级·部位·醇化时间对烟叶木质素含量的影响

[目的]研究产地、等级、部位、醇化时间对烟叶木质素含量的影响。[方法]以河南地区98个烟叶样品为研究对象,采用氢氧化钠/尿素-稀硫酸法测定其木质素含量,研究产地、等级、部位和醇化时间对烟叶木质素含量的影响。[结果]随着烟叶等级的升高(烟叶部位由上到下),总木质素含量呈增加趋势;随着醇化时间的延长,总木质素含量呈缓慢增加趋势;产地、等级、部位对烟叶木质素含量影响较大,而醇化时间对烟叶木质素含量影响较小。[结论]该研究可为合理利用烟叶、改善烟草品质提供理论依据。     

紫花苜蓿MsNST的克隆及对木质素与纤维素合成的功能分析

【目的】木质素和纤维素是植物次生细胞壁的主要组成成分,是影响牧草消化率和品质的主要因素之一。紫花苜蓿作为高蛋白饲草,是奶牛等草食家畜优质饲草的主要来源。因此,苜蓿木质素和纤维素合成机制一直是受到关注的研究热点。模式植物拟南芥NAC家族的NST转录因子（NAC secondary wall thicking promoting factor）调控次生细胞壁的合成,但紫花苜蓿NST的功能与调控机制尚不明确。本研究通过分析紫花苜蓿NST的表达模式,及在拟南芥与苜蓿中过表达揭示其对木质素和纤维素合成的影响。【方法】通过同源克隆获得MsNST CDs序列,并对该基因进行生物信息学分析。利用qRT-PCR检测该基因受赤霉素（GA3）,水杨酸（SA）和多效唑（PCB）诱导后的表达模式。通过转基因植株中过表达MsNST,研究其对木质素和纤维素含量及其合成相关基因的影响。【结果】克隆MsNST 的CDs序列,最大开放阅读框为945bp,编码314个氨基酸。生物信息学分析表明,MsNST主要由无规则卷曲组成（60.83 %）;三级结构预测显示,MsNST以同源二聚体的形式有效的促进蛋白质间的相互作用。进化树分析表明,单子叶和双子叶分为两个分枝,暗示存在一定程度的进化,而MsNST与蒺藜苜蓿和大豆的NST属于双子叶植物分枝中的亚分枝,表明豆科植物间亲缘关系较近。MsNST与拟南芥NST1-3的氨基酸序列相似性较高（49%—55.9%）,并含有NAC转录因子的5个保守结构域。qRT-PCR分析表明,MsNST受GA3、SA和PCB的诱导表达,相对表达水平（12h）分别是对照的2.19、3.67和3.65倍。过表达MsNST导致拟南芥下胚轴缩短,转基因拟南芥半矮化,花序茎束间细胞壁纤维增厚,细胞壁结晶纤维素（13%）、总糖（7%）和木质素（11.7%）含量增加。通过分析木质素和纤维素合成相关基因表达水平发现,拟南芥和苜蓿中过表达MsNST均能激活木质素合成关键基因（PAL,4CL等）及纤维素合酶复合体亚基CesA家族基因的表达。【结论】MsNST受外源激素GA3、SA和PCB诱导表达。转基因植物中过表达MsNST可激活次生壁木质素和纤维素合成相关基因的表达,同时茎束间纤维细胞壁增厚,细胞壁结晶纤维素、总糖和木质素含量增加,暗示MsNST对次生细胞壁木质素和纤维素的合成有重要的调节作用。