抗真菌转基因大豆对大豆疫霉根腐病抗病性鉴定

采用下胚轴伤口接种法,对Southern杂交阳性的转菜豆几丁质酶基因和大麦核糖体失活蛋白基因的双价转基因大豆T2代的5个株系,进行了大豆疫霉根腐病抗病性检测,并通过比较接种后转基因大豆与对照组的死亡率来探讨两者的抗病性差异。结果表明,有4个转基因株系对大豆疫霉根腐病的抗性与非转基因对照组相比有明显提高,另外1个株系与对照组相比没有明显差异。     

转基因大豆种质资源对大豆疫霉根腐病的抗性评价

大豆疫霉根腐病是影响大豆生产的重要病害之一,选育抗病品种对防治大豆疫霉根腐病是最有效的方法,其中抗大豆疫霉根腐病的转基因品种选育是重要手段之一。本研究主要采用下胚轴接种法对280个转基因大豆种质资源接种大豆疫霉根腐病菌吉林省优势生理小种1号,进行抗根腐病鉴定。结果表明:吉林省农科院提供的280份转基因大豆种质资源对1号生理小种表现抗病的有27份,占9.6%,表现感病的有188份,占67.1%,表现中间型的有65份,占23.2%。     

利用RNAi技术抗玉米矮花叶病效果研究

以采用RNAi技术获得的HiⅡ、HiⅡA、HiⅡB和H99抗玉米矮花叶病转基因T1和T2代为材料,通过病毒接种、草丁膦涂抹、目的基因和标记基因PCR扩增,研究了利用RNAi原理构建的目的基因对玉米矮花叶病的抗性效果以及玉米转基因后代群体鉴定筛选技术。结果表明,90.00%的转基因株系抗病性超过非转基因株系,30.00%的转基因株系抗病株率超过了抗病对照黄早4,转基因株系的抗病性明显提高,说明利用RNAi技术选育抗矮花叶病转基因玉米株系是可行的。4种筛选鉴定方法比较结果表明,目的基因PCR和病毒接种鉴定方法最可靠,在转基因后代群体鉴定过程中,可在苗期用200mg/L的草丁膦筛选阳性植株基础上,再采用目的基因PCR鉴定,筛选出抗性转基因植株或株系,不仅可以减少鉴定的工作量,而且可以提高鉴定的准确性。     

转CryIA和CpTI双价抗虫基因大豆的获得与稳定表达

【目的】将抗虫基因转入栽培大豆中,提高大豆的抗食心虫能力。【方法】利用大豆未成熟子叶体细胞胚发生系统高效转化体系,将携带有人工合成的CryIA杀虫基因和CpTI基因的高效双价杀虫基因植物表达载体pGBI121S4ABC转化到大豆主栽品种吉林20与吉林27中。【结果】GUS活性分析、PCR、Southern blot检测证明,目的基因已整合到受体大豆基因组中。T1代转基因大豆抗虫测定表明,转基因材料虫食率比对照显著降低,抗虫能力显著提高。【结论】T3～T5连续3代接虫测定结果表明,转基因大豆株系0-195和0-150的虫食率均比对照低大约30%,其抗虫能力已基本稳定。     

华南大豆种质对大豆疫霉根腐病的抗性分析

【目的】大豆疫霉根腐病是由大豆疫霉菌引起的严重影响大豆生产的世界性病害之一,选用抗病品种是控制该病最经济有效的措施。筛选抗大豆疫霉菌PGD1的优异抗源和多抗疫霉根腐病种质资源,推导大豆种质抗疫霉根腐病基因,为热带、亚热带地区大豆抗病育种提供有效抗源。【方法】采用下胚轴创伤接种法,利用在广东发现并分离的大豆疫霉菌PGD1菌株,接种鉴定主要来自广东、广西、福建、海南、湖南、江西和四川等华南省份631份大豆种质资源的抗病性,筛选抗大豆疫霉菌PGD1种质资源;再用其他6个不同毒力的大豆疫霉菌株接种鉴定抗大豆疫霉菌PGD1的种质,筛选多抗资源,通过基因推导方法分析抗病种质的抗病基因类型。【结果】631份大豆种质中有101份种质抗大豆疫霉菌PGD1,占鉴定种质的16.0%;73份为中间反应类型,占11.6%;457份表现感病,占72.4%。其中83份抗大豆疫霉菌PGD1的种质对其他6个不同毒力菌株Pm14、Pm28、PNJ1、PNJ3、PNJ4、P6497的侵染率分别为28.9%、34.9%、9.6%、66.3%、57.8%和10.8%。4份种质同时抗7个不同毒力的大豆疫霉菌株,分别为ZDD21538、ZDD21604、ZDD14286和明夏豆1号,占鉴定种质的4.8%。毒力频率为0的种质有15份,占鉴定种质的18.1%。83份大豆种质对7个不同毒力的大豆疫霉菌株共产生20种反应型,1种反应型与单个抗病基因的鉴别寄主Williams79反应型一致,可能含有抗病基因Rps1c;45份种质产生的9种反应型符合一些2个或2个以上已知抗病基因组合的反应型,这些种质可能含有已知抗病基因组合;38份种质共产生11种反应型既不同于任何含有单个已知抗病基因品种的反应型也不同于2个或2个以上已知抗病基因组合的反应型,它们可能含有新的抗病基因或基因组合。【结论】华南地区大豆种质中蕴藏着丰富的抗大豆疫霉菌PGD1和多抗大豆疫霉菌抗源,这些抗病种质可作为热带、亚热带地区大豆抗病育种的重要亲本和抗病基因定位的重要研究材料。     

大豆抗疫霉根腐病的分子机制

大豆疫霉根腐病是毁灭性病害之一,每年都会给大豆产业带来巨大的经济损失。抗病品种的选育和种植是对此病的最有效防治措施。抗病机制的研究可以为抗病品种的选育提供理论基础,因此抗病机制成为研究焦点。根据大豆抗疫霉根腐病(Phytophora root rot)的分子机制的研究进展,文章阐述了大豆防卫基因、大豆疫霉菌无毒基因以及大豆-疫霉菌互作的研究进展,以期为抗病品种的选育提供理论基础。     

大豆疫霉根腐病抗性相关基因SDR1的克隆及功能分析

【目的】获得大豆疫霉根腐病抗性相关基因,为培育大豆抗病品种提供理论依据。【方法】在以大豆抗病品种绥农10构建的受疫霉菌诱导后差异表达的cDNA消减文库的基础上,选取文库中一条与其它植物的DR1基因具有较高同源性且上调表达的EST序列。通过RT-PCR方法从绥农10中克隆该基因,并构建到植物表达载体pCAMBIA3301上,以感病品种东农50的子叶节为外植体通过根癌农杆菌介导的方法进行大豆遗传转化。【结果】该基因全长805 bp,开放读码框为471 bp,编码156个氨基酸,在此命名为SDR1。遗传转化获得转基因PCR鉴定阳性植株5株,Real-time PCR检测T1转基因植株较非转基因植株SDR1表达量提高20倍以上的有3株,经Southern杂交分析表明,出现杂交信号的有3株。经离体叶片接种大豆疫霉菌,转基因大豆的抗性较非转基因大豆明显提高。【结论】成功克隆了大豆疫霉根腐病抗性相关基因SDR1,并通过对过量表达的大豆转基因植株的抗病性鉴定初步确定了SDR1的抗病功能。     

转chi+rip双价抗真菌病基因大豆遗传稳定性分析

外源基因在转基因植物中遗传和表达的稳定性直接关系到转基因材料的应用前景.研究以转chi+rip双价基因大豆株系G0431、G0433的T2、T3及T4连续世代为材料,通过PCR、Southem杂交、Real-time PCR进一步证明外源基因已经整合到大豆基因组中,并稳定遗传给后代;Real-time RT-PCR、W...     

毛白杨TIR-NBS-LRR基因转化烟草的研究

该文采用农杆菌介导法将从毛白杨中克隆得到的TIR-NBS-LRR抗病基因（PtDRG01）导入烟草中,经抗生素筛选和PCR分子检测,获得了一批阳性转化植株。进而对这些阳性转化植株进行烟草花叶病毒接种实验,从表型观察结果发现,在接种病毒1周和6周后,转基因烟草株系TG-11的发病程度明显低于非转基因烟草。荧光定量分析结果显示,转基因烟草株系TG-11叶片中的烟草花叶病毒(TMV)数量显著低于非转基因植株,且该转基因株系中的PtDRG01基因转录水平显著高于非转基因植株。这些结果表明,毛白杨PtDRG01基因具有明显的抗病功能,其高效表达能够显著提高烟草的抗TMV能力。该文通过对烟草的遗传转化与病毒接种实验,鉴定了PtDRG01基因的功能,可为其他TIR-NBS-LRR基因的功能鉴定提供参考。      

转基因甘蔗抗黑穗病鉴定研究

用分离得到的甘蔗黑穗病病菌单孢子菌丝体对5个甘蔗转基因株系进行体外抑菌作用鉴定,结果显示,5个转基因株系对甘蔗黑穗病均有不同程度的抗性表现;通过人工接种方法对转基因植株（T1）进行了甘蔗黑穗病病菌的田间接种实验,利用病害流行指标LP、SDD、IPmax、Ymax、AUDPC对其后代（他）进行抗病性鉴定,结果表明,SCG1和SCG2两个株系表现为抗病（R）,而SCG3、SCG4和SCG5三个株系表现为中抗（Ⅰ）;并结合RT-PCR技术鉴定目的基因在转基因甘蔗无性系后代（T2）中的表达,结果显示两个目的基因在转基因甘蔗无性系12中均有表达,此结果与其抗病表现一致。     

一对单显性大豆抗疫霉根腐病基因的遗传分析及定位

[目的]大豆疫霉根腐病是大豆毁灭性的病害之一,防治该病最安全有效的方法是培育和利用抗性品种。迄今为止,已在大豆基因组上鉴定了21个大豆疫霉根腐病抗性基因,但是在中国只有少数基因(如Rps1c、Rps1k等)抗性有效。因此,急需发掘新的大豆疫霉根腐病抗性基因,以满足抗病育种的需要。‘大方六月早’对大豆疫霉菌的抗谱较广,是目前筛选出的优异抗源。[方法]采用下胚轴创伤接种方法进行抗病性鉴定,以品种‘大方六月早’为抗病亲本与品种‘矮脚早’配置杂交组合获得F2∶3代家系群体,并进行遗传分析,通过SSR(simple sequence repeat)标记对‘大方六月早’的抗性基因进行定位。[结果]该群体的抗性遗传分析表明:‘大方六月早’对大豆疫霉根腐病的抗性由1对主效基因控制,抗病对感病表现为显性,暂命名为RpsAH。使用SSR标记进行分子作图,抗病基因RpsAH被定位在大豆3号染色体(即N连锁群)上,距离标记Sat_166为4.1 cM。[结论]大豆品种‘大方六月早’对大豆疫霉菌株AH的抗性由1个单显性基因控制,该基因定位于大豆分子遗传图谱N连锁群上。     

抗全蚀病的转PvPGIP2-TaLTP5双价基因小麦的创制及鉴定

【目的】全蚀病是小麦的毁灭性病害。创制转PvPGIP2和TaLTP5双价基因小麦,分析外源PvPGIP2和TaLTP5在转基因小麦中的遗传与表达情况,选育抗全蚀病的转基因小麦新种质。【方法】采用基因重组技术构建了PvPGIP2和TaLTP5双价表达转基因载体pA25-PvPGIP2-TaLTP5,利用基因枪介导法将该载体转入小麦品种扬麦18,采用PCR、RT-PCR与qRT-PCR方法分析转基因小麦T0—T4植株中目的基因及其表达量,并对T3和T4逐株进行全蚀病接种与抗性鉴定。【结果】创制并选育出稳定的抗全蚀病转PvPGIP2和TaLTP5小麦株系6个。PvPGIP2和TaLTP5能够在这6个转基因小麦株系中稳定遗传,并高水平表达。对转PvPGIP2和TaLTP5小麦的全蚀病抗性鉴定结果表明,与受体扬麦18相比,转PvPGIP2和TaLTP5小麦对全蚀病抗性明显提高。【结论】创制了转PvPGIP2和TaLTP5抗全蚀病的小麦新种质,其对全蚀病具有一定的抗性。     

农杆菌介导烟草抗真菌β-1,3-葡聚糖酶基因转化洋桔梗

为获得洋桔梗抗真菌病害新品种,本研究将烟草抗真菌β-1,3-葡聚糖酶基因(Glu)与质粒p BI121重组,构建了植物表达载体p BI121-Glu,利用农杆菌介导法转化洋桔梗品种Double Mariachi Pink叶块,共获得21个卡那霉素抗性株系。对抗性株系进行PCR扩增,获得10个阳性株系。选取其中生长良好的5个株系进行RT-PCR检测,鉴定出3个株系(EG6、EG11和EG17)为转基因正常转录株系。EG6、EG11和EG17株系及非转基因对照株系的β-1,3-葡聚糖酶的平均活力分别为0.301 U、0.243 U、0.401 U及0.236 U,其中EG6和EG17株系的平均活力显著高于非转基因对照株系。洋桔梗离体叶片的抗灰霉病鉴定显示,EG17病斑面积(0.432 cm2)显著小于非转基因对照株系(2.156 cm2)。此外,EG17对灰霉病的抗性还表现为发病延迟、病斑面积扩大速度减慢等。     

转OsEBP-89基因水稻芽期与幼苗期的抗盐性鉴定

以100 mmol浓度NaCl盐胁迫,对转OsEBP-89基因水稻T6代3个株系芽期与幼苗期抗盐性进行了鉴定。结果表明,转OsEBP-89基因株系之间抗盐性存在差异,其中两个转基因株系(3448和3463)发芽势比对照日本晴高,芽期综合相对盐害率显著低于对照日本晴,说明转基因材料在100 mmol NaCl胁迫下其芽受到盐的伤害少于对照材料;但其发芽率、根长、苗高和幼苗期综合相对盐害率与对照日本晴没有显著差异。     

转拟南芥NPR1基因水稻253 T3代株系对水稻

【目的】获得高抗水平的转拟南芥NPR1恢复系水稻253株系,比较转基因水稻与其非转基因野生型抗病性和农艺性状的差异,以期为转基因抗病育种提供材料。【方法】以通过连续自交获得的转AtNPR1基因253 T3代纯合株系和非转基因253为材料,于分蘖期采用剪叶法接种白叶枯病菌菌株13751于水稻叶片,14 d 后,对稻株发病情况进行调查;收获期考查6个转基因株系的农艺性状。【结果】6个转基因T3代株系植株的抗病性可稳定表达,其病斑长度均显著短于非转基因野生型253;253-3的抗病能力比野生型253增强50%以上,其他 5个株系253-4、253-7、165、166、167对水稻白叶枯病表现出高抗水平,抗病能力增强90%以上。与野生型253相比,转基因株系植株生长正常,不同株系间部分农艺性状无明显变化规律,而部分农艺性状显著升高或降低;株系166的株高、穗长、有效穗数、一次枝梗数、每穗总粒数、每穗实粒数和单株产量等显著优于非转基因恢复系253。【结论】拟南芥NPR1基因可作为培育广谱抗病作物的热门候选基因,株系166可作为水稻抗病育种的新种质。     

Agronomic traits and rice bacterial blight disease resistance in T3 generation lines of rice cultivar 253 over-expressing Arabidopsis thaliana NPR1 gene

[目的]获得高抗水平的转拟南芥NPR1恢复系水稻253株系,比较转基因水稻与其非转基因野生型抗病性和农艺性状的差异,以期为转基因抗病育种提供材料.[方法]以通过连续自交获得的转AtNPR1基因253 T3代纯合株系和非转基因253为材料,于分蘖期采用剪叶法接种白叶枯病菌菌株13751于水稻叶片,14d后,对稻株发病情况进行调查;收获期考查6个转基因株系的农艺性状.[结果]6个转基因T3代株系植株的抗病性可稳定表达,其病斑长度均显著短于非转基因野生型253;253-3的抗病能力比野生型253增强50％以上,其他5个株系253-4、253-7、165、166、167对水稻白叶枯病表现出高抗水平,抗病能力增强90％以上.与野生型253相比,转基因株系植株生长正常,不同株系间部分农艺性状无明显变化规律,而部分农艺性状显著升高或降低;株系166的株高、穗长、有效穗数、一次枝梗数、每穗总粒数、每穗实粒数和单株产量等显著优于非转基因恢复系253.[结论]拟南芥NPR1基因可作为培育广谱抗病作物的热门候选基因,株系166可作为水稻抗病育种的新种质.     

从中国商陆分离的PacPAP基因转化番茄对TMV的抗性研究

以中国商陆(Phytolacca acinosa)叶片为材料,经PCR从基因组扩增克隆缺失无毒型抗病毒蛋白基因.采用叶盘法转化番茄,对转基因植株T1代摩擦接种TMV,50d后统计发病情况.结果表明:克隆得到缺失无毒型PAP基因PacPAP,大小为714bp,与美洲商陆抗病毒蛋白基因的同源性为99.7%,GenBank登陆号为AY603353;得到PacPAP整合入番茄基因组中的阳性植株11株,检测的4个转基因番茄株系均达到抗病级别,对照为感病.     

RNAi和GroEL介导的双价转基因番茄对TYLCV的抗性

本研究将已构建的SUC2-GroEL和pBI121-AC1-AC2植物表达载体共转化番茄,共获得19株卡那霉素抗性再生植株。经过PCR和RT-PCR检测,初步获得转SUC2-GroEL载体的阳性植株5株,转pBI121-AC1-AC2载体的阳性植株3株以及转SUC2-GroEL/pBI121-AC1-AC2双载体的阳性植株2株。利用TYLCV侵染性克隆农杆菌注射接种法对T0代转基因阳性植株进行抗性鉴定,获得抗TYLCV的转基因植株7株。对T0代未扩出病毒条带的T1代植株进行抗性鉴定,结果发现转SUC2-GroEL、pBI121-AC1-AC2、SUC2-GroEL/pBI121-AC1-AC2不同载体的株系植株中平均带毒率依次是35%、25%和15%,推断转双基因的植株的抗病能力优于转单个基因植株的抗病能力。     

轻度盐碱地转betA基因小黑杨的生长表现

在前期获得11个转胆碱脱氢酶基因(betA)小黑杨株系的基础上,将转基因株系与非转基因对照株系在轻度盐碱地上造林,5 a后对试验林的转基因株系进行PCR分子检测,并运用SPSS软件对其树高、胸径、材积和保存率4个生长性状进行了方差分析.结果表明:转betA基因小黑杨外源基因稳定,目前尚未丢失;转基因株系与对照株系间树高、胸径、材积和保存率的差异均达到极显著水平;利用隶属函数法选择的转基因株系T1、T6和T8,为生长速度快、耐盐性高的优良株系.     

东莞大蕉超表达拟南芥CBF1基因及其抗寒性检测

【目的】研究超表达拟南芥CBF1基因（AtCBF1）对大蕉抗寒性的影响,为从大蕉克隆抗寒相关基因奠定基础。【方法】采用农杆菌介导法转化东莞大蕉的胚性细胞悬浮系,获得转AtCBF1基因的大蕉植株;利用GUS组织染色、PCR、RT-PCR以及RT-qPCR对转基因植株进行鉴定;比较低温处理后的转基因株系和对照的冷害特征以及超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量等生理生化指标,鉴定转基因大蕉植株的抗寒能力。【结果】试验共获得6个抗性再生转化系。GUS组织染色结果表明,除T1外,其余均为阳性;PCR鉴定结果表明,AtCBF1在6个抗性再生转化系均为阳性,而GUS基因在T1转化系中没有检测出;RT-PCR结果表明,AtCBF1在6个转化系均得到表达,对T1、T2和T3 3个转化系进行RT-qPCR检测发现,AtCBF1基因在3个转基因株系表达水平存在差异;在低温处理下,转基因植株的叶片相对电导率、MDA的累积都低于非转基因植株,而SOD总活性高于对照;低温处理条件下,转基因植株叶片的冷害症状明显轻于对照。【结论】AtCBF1在大蕉中超表达,具有增强大蕉SOD活性,降低因低温导致的MDA含量和离子渗漏率,缓解质膜过氧程度,进而改善大蕉植株抗低温胁迫的能力。