IL-2Rα结合位点修饰型OvilL-2基因真核表达载体的构建

IL-2主要由激活后的T细胞产生,是一种天然的免疫增强剂,临床应用广泛.为了表达roviIL-2,本研究采用人工合成的方法获得基因,通过大肠杆菌对目的基因进行扩增筛选,并成功构建了适用于毕赤酵母表达系统的roviIL-2的真核表达载体pPIC9K-roIL2.本研究为下一步roviIL-2的真核表达及免疫机理研究奠定了基础.     

IL-2Rα结合位点修饰型OviIL-2在毕赤酵母中的表达与鉴定

IL-2主要由激活后的T细胞产生,是一种天然的免疫增强剂,临床应用广泛。之前构建了适用于毕赤酵母表达系统的重组绵羊IL-2的真核表达载体pPIC9K-roIL2。本研究在此基础上使用pPIC9K-roIL2转化毕赤酵母GS115,筛选得到阳性克隆,命名为GS115-roIL2并经过摇瓶培养和诱导表达得到表达产物。通过SDS-PAGE进行初步鉴定,证明成功表达出了roIL-2。本研究为下一步roviIL-2免疫机理研究奠定了基础。     

猪β防御素-2基因在HEK293T细胞中的表达

用Trizol试剂提取猪血白细胞总RNA,根据已发表的序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增出猪β防御素-2(pBD-2)基因,并将该基因插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,构建成猪β防御素-2基因的真核表达载体pcDNA3.1A/pBD-2,经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达。结果表明:本试验扩增的pBD-2基因与已发表的序列完全一致。表达产物经Western-blot检测,证明pBD-2能够在真核细胞HEK293T中表达。     

鸡TNNI2基因的真核表达载体构建及功能生物信息学分析

【目的】构建鸡快骨骼肌亚型肌钙蛋白I基因(fast skeletal muscle troponin I,TNNI2)的真核表达载体,并在永生化鸡前脂肪细胞系(immortalized chicken preadipocyte cell line,ICP1)细胞中转染和鉴定。【方法】利用RT-PCR方法获得鸡TNNI2基因的全长CDS区序列,采用定向克隆的方法构建该基因的真核表达载体,并对基因序列进行功能生物信息学分析,构建系统发育树。【结果】TNNI2基因ORF全长552 bp,编码183个氨基酸,蛋白质分子量大小为21.24 ku,理论等电点(pI)为9.19;fsTnI蛋白无信号肽和跨膜区,亚细胞定位于细胞核,属于亲水性不稳定蛋白质;磷酸化预测含有14个磷酸化位点;二级结构主要以α螺旋的形式存在;同源性比对结果表明:不同物种间的TNNI2基因具有较高的同源性。【结论】本研究成功构建了TNNI2基因的真核表达载体pCMV-HA-TNNI2,并成功转染ICP1细胞系,本结果可为进一步研究鸡TNNI2基因的功能奠定基础。     

来航鸡FOXL2基因的真核表达及纯化

【目的】对来航鸡FOXL2基因进行真核表达及纯化,为其生物学功能研究奠定基础。【方法】根据GenBank已发表的来航鸡FOXL2基因序列(GenBank登录号:JF_708868.1)设计引物,以来航鸡全血DNA为模板,PCR扩增FOXL2基因,经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后定向克隆于pPICZαA中,获得pPICZαA-FOXL2真核表达载体。将pPICZαA-FOXL2转化毕赤酵母菌GS115,用甲醇进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting检测。【结果】克隆了918bp的FOXL2基因;成功构建了pPICZαA-FOXL2真核表达载体;实现了FOXL2基因在毕赤酵母菌GS115中的融合表达,获得了分子质量约为37ku的重组蛋白FOXL2,经Western blotting检测其具有较好的生物学活性。【结论】成功地在毕赤酵母中表达了来航鸡FOXL2基因。     

真核表达载体pIRES2-AcGFP1-PLIN2的构建及其在3T3-L1前脂肪细胞中的表达

构建pIRES2-AcGFP1-PLIN2真核表达载体,并观察其在3T3-L1前脂肪细胞中的转染状况。采用分子克隆技术,将PLIN2基因连接到p MD18-T载体中做Eco RⅠ/Sal I双酶切,将酶切产物回收并将双酶切后的目的片段与pIRES2-AcGFP1载体连接,转入DH5α感受态细胞,并提取pIRES2-AcGFP1-PLIN2阳性重组质粒,转染到3T3-L1前脂肪细胞,显微镜观察转染情况。本研究成功克隆出了PLIN2基因,同时成功构建了pIRES2-AcGFP1-PLIN2真核表达载体,并在3T3-L1前脂肪细胞中成功表达,于显微镜下观察到绿色荧光,试验为进一步研究PLIN2基因对脂肪细胞的调控机理奠定了基础。     

犬细小病毒VP2基因真核表达质粒的构建与瞬时表达

[目的]构建犬细小病毒(CPV)VP2基因真核表达质粒,为研究核酸疫苗奠定基础.[方法]根据CPVVP2基因序列设计特殊引物,采用PCR方法从疑似"犬细小病毒"的患犬粪便基因组中扩增VP2基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),测序验证后,小白鼠尾静脉注射瞬时表达VP2基因,8 h后取小白鼠肝脏提取总RNA,进行RT-PCR扩增.[结果]在病犬粪便基因组中扩增得到1 755 bp的VP2基因片段,并构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)-VP2,从瞬时表达的小白鼠肝脏总RNA中可扩增到目的条带.[结论]成功构建了犬细小病毒VP2基因真核表达重组质粒,并在小白鼠体内进行了瞬时表达.     

牛DKK2基因pcDNA3.1表达载体的构建

DKK2基因是Wnt信号通路的关键抑制因子,在胚胎发育、颗粒细胞生成等过程中发挥重要作用。扩增了牛DKK2基因CDS序列,构建了DKK2基因pc DNA3.1真核表达载体;为进一步验证载体在细胞内的表达效果,将表达质粒瞬时转染CHO细胞,利用q RT-PCR和Western blot检测DKK2的表达情况。结果表明,在CHO细胞中转染DKK2基因的真核表达载体质粒,其m RNA和蛋白质表达量均显著上升,表明已成功构建了DKK2基因表达载体,为下一步开展DKK2基因功能研究奠定了基础。     

细胞因子与猪瘟病毒E_2基因真核双表达载体的构建及其免疫增强作用

 构建了猪瘟病毒E2 基因与IL 2、IL 3基因的双表达真核表达载体 ,观察其表达水平 ,并对其免疫增强效果进行了观察。结果表明 ,构建了 2种猪瘟病毒E2 基因与白细胞介素 2、3的真核表达质粒pIRSTIL 2 ,pIRSTIL 3。将 2种质粒转染BHK 2 1细胞 ,均可在体外表达E2 抗原和有生物活性的IL 2、IL 3两种质粒能诱导产生CSFV的特异性免疫反应。pIRSTIL 2 ,pIRSTIL 3所诱导的免疫应答反应比使用单表达质粒 pIRST强。试验表明 ,细胞因子与目的基因构建的双表达基因疫苗能有效提高基因疫苗的免疫效果。     

IBDV超强毒HZ株VP2基因的克隆和真核表达质粒的构建

利用反转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR) ,扩增克隆传染性法氏囊病病毒超强毒 (vv IBDV) HZ株 VP2基因 ,并对 VP2基因进行全序列测定、序列分析和聚类分析 ,同时将VP2基因与真核表达载体 pc DNA3相连接。结果克隆到 VP2基因全序列长 1 356bp,分析表明 HZ株与欧洲超强毒株 UK661高度相似 ,同时将 VP2基因正向插入 pc DNA3的 CMV启动子下游 ,得到了 VP2基因的真核表达质粒。为 IBDV分子流行病学和基因工程疫苗的研究奠定了物质基础     

牛乳头瘤病毒2型L1基因真核表达载体的构建及真核表达

为在真核细胞中表达牛乳头瘤病毒2型(BPV2)衣壳蛋白L1基因。采用PCR方法从奶牛皮肤肿瘤病料中扩增BPV2沙湾分离株L1基因,克隆入pMD18-T载体中,测序后进行序列分析。以pcDNA 3.1(+)为真核表达载体构建重组表达质粒,转染入BHK-21细胞,通过间接荧光免疫试验检测BPV2-L1蛋白的表达。本研究成功构建pcDNA3.1(+)-BPV2-L1重组真核表达质粒,证实能表达出BPV2-L1蛋白,为BPV2DNA疫苗的研发提供了前期基础。     

猪瘟病毒E2基因乳腺特异表达载体的构建

为进一步研究基因疫苗的免疫机制与免疫效果,探讨外源基因在乳腺中的定位表达,应用重组PCR方法,将猪瘟病毒(CSFV)E2基因与牛β-乳球蛋白(BLG)5′部分调控序列连接起来,并插入到真核表达载体pEGFP-C1上,构建了含有CSFVE2基因的乳腺特异表达载体。     

猪前胸腺素真核表达载体的构建及表达

为了构建含有EGFP的猪ProTα基因的真核表达载体,用RT-PCR从猪肾脏中扩增ProTα基因,连接到T载体,测序鉴定后,连接到pEGFP-N3真核表达载体,构建真核表达载体pEGFP-ProTα。通过脂质体法转染Vero细胞,进行荧光检测。结果表明,构建的pEGFP-ProTα真核表达质粒,转染Vero细胞后,经荧光观察EGFP-ProTα融合蛋白有向细胞核聚集的现象。结论:本研究成功构建了真核表达载体pEGFP-ProTα,并在Vero细胞中表达,为研究猪ProTα的功能奠定了基础。     

重组hIL-2表达载体的构建及在毕赤酵母中的表达

本试验根据hIL-2氨基酸序列、三维结构及其与受体IL-2R结合机制,设计并合成IL-2Rα亚基结合位点修饰性hIL-2基因片段。合成的修饰性hIL-2基因序列被插入真核表达载体pPIC9K,并转化入毕赤酵母基因组中。经筛选得到阳性重组子后,通过诱导培养得到了表达产物。对表达产物进行Elisa初步测定,结果成功表达出重组hIL-2,表达水平达0.93g/L。本项研究为进一步开展IL-2Rα结合位点修饰性hIL-2的生物活性研究奠定了基础。     

三种鸭防御素真核表达载体的构建及其表达分析

为研究鸭防御素的真核表达,人工合成了鸭防御素AvBD2、AvBD10和AvBD12基因,并将其插入到真核表达质粒pDoubleEx-EGFP-flag-N中构建重组表达质粒;重组表达质粒经酶切鉴定正确后,分别转染HEK293细胞进行表达,用RT-PCR和Westem-blot鉴定目的基因的表达情况。结果表明,酶切鉴定证实目的基因成功插入到真核表达质粒中;真核表达质粒转染HEK293细胞24 h后,在荧光显微镜下可见绿荧光蛋白表达;RT-PCR能检测到目的基因mRNA,但Western-blot没有检测到目的蛋白的表达条带。     

新孢子虫NcGRA2基因真核表达质粒的构建及其在293细胞内的表达

[目的]为了构建新孢子虫NcGRA2基因的真核表达载体,探讨重组载体在体外细胞的表达.[方法]从含有NcGRA2基因的重组质粒pGEX-4T1-NcGRA2中,用限制性内切酶进行酶切获得带有粘性末端的NcGRA2基因片段.经琼脂糖凝胶电泳切胶回收NcGRA2基因片段,与pcDNA3.1载体连接.将构建的真核表达质粒pcDNA3.1-NcGRA2转染到293细胞中表达.[结果]经酶切分析和序列测定,证实了重组质粒的正确连接.经免疫荧光抗体试验验证pcDNA3.1-NcGRA2能在293细胞中表达NcGRA2蛋白.[结论]获得重组质粒pcDNA3.1-NcGRA2,并能在体外细胞中表达NcGRA2蛋白,为进一步研究核酸疫苗的动物免疫试验奠定了基础.     

A型流感病毒H7N9株PB1和PB2基因的克隆和真核表达

【目的】本试验旨在构建A型H7N9流感病毒RNA聚合酶类蛋白PB1和PB2真核表达载体,并在293T细胞中表达其编码的蛋白。【方法】首先提取苏州分离株A型H7N9流感病毒的总RNA,通过RT-PCR技术获得了A型H7N9流感病毒PB1和PB2的全长基因,然后将其克隆至真核表达载体pRK中构建pRK-Flag-PB1/PB2真核重组表达载体,经酶切及测序鉴定正确后将质粒转染到293T细胞中,通过Western blot鉴定PB1/PB2蛋白的表达。【结果】成功克隆了PB1和PB2全长基因,构建了A型H7N9流感病毒PB1和PB2蛋白真核表达载体pRK-Flag-PB1/PB2,并在293T细胞中转染表达,Western blot确定了PB1/PB2蛋白的成功表达。【结论】该表达载体的成功构建及在293T细胞中成功表达PB1和PB2蛋白,为后期开展流感病毒蛋白功能及与真核细胞中的蛋白相互作用的研究奠定了基础。     

猪瘟病毒囊膜蛋白E2基因真核分泌型表达载体的构建及其表达

【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pSecTag-E2qc和pSecTag-E2sh表达载体,分别进行PCR、双酶切及测序鉴定。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染猪脐静脉血管内皮细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测目的基因的转录情况,同时对转染细胞及细胞上清液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,以检测目的蛋白的表达情况。【结果】成功克隆了E2蛋白基因全长序列1119bp和去除E2蛋白跨膜基因序列999bp的目的基因。构建的表达载体经PCR、双酶切法及测序鉴定均无误。转染后细胞的RT-PCR结果显示,目的基因被成功转录。转染后细胞及细胞上清液的SDS-PAGE和Western-blot结果显示,目的基因被成功表达。【结论】成功构建了猪瘟病毒E2蛋白的真核表达载体,转染猪脐静脉血管内皮细胞后,分泌表达了猪瘟病毒E2重组蛋白。     

tTS真核表达载体构建及稳定转染HepG2细胞系的建立

为了构建tTS真核表达载体,转染HepG2细胞,建立稳定转染的HepG2细胞系,采用PCR方法,以质粒pTet-tTS为模板扩增tTS基因的编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pApoE-rtTA-Neo,经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染HepG2细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的HepG2细胞系,用RT-PCR、Western blot法检年测tTS的表达,成功构建了pApoE-rtTA-tTS-Neo真核表达载体,并建立了稳定转染的HepG2细胞系,成功地表达目的基因。真核表达载体成功构建和稳定转染HepG2细胞系的建立为进一步研究tTS的功能奠定良好的实验基础。     

猪细小病毒VP2基因与猪圆环病毒2型ORF2基因共表达对PPV病毒样颗粒形成的影响

将扩增得到的PPV SC-1株VP2基因产物插入真核表达载体pPI-2.EGFP中,得到了重组质粒pPI-2.EG-FP.VP2。再以含有PCV2 SC株全基因组的重组质粒pMD-PCV2为模板扩增PCV2ORF2基因,进一步将其插入pPI-2.EGFP.VP2中,构建含有PPVVP2基因、PCV2ORF2基因及EGFP报告基因的真核表达载体pPI-2.EG-FP.VP2.ORF2。用脂质体介导法将pPI-2.EGFP.VP2.ORF2 DNA转染Vero细胞,观察绿色荧光蛋白的融合表达,采用ELISA方法检测转染液与PPV、PCV2高免血清的反应特性,同时将转染出现绿色荧光明显的Vero细胞制备电镜样品。结果显示,VP2基因、ORF2基因与绿色荧光蛋白得到融合表达,转染液与PPV、PCV2高免血清具有良好的抗原抗体反应特性,电镜观察到重组病毒样颗粒的形成。