SOCS2真核表达载体的构建及在3T3 L1前体脂肪细胞中的表达

细胞因子信号抑制蛋白(SOCS)是细胞因子信号通路的重要负调控因子.构建SOCS2真核表达载体并转染3T3-L1前体脂肪细胞,为研究SOCS2对不同细胞因子调控脂代谢奠定基础.取小鼠皮下脂肪提总RNA进行RT-PCR,克隆获得pMDl8-SOCS2质粒载体,双酶切目的基因,并克隆至质粒载体pcDNA3.1,成功构建了重组质粒载体pcDNA3.1-SOCS2;重组质粒瞬时转染3T3-L1前体脂肪细胞系,以未转染和空载体转染作为对照,RT-PCR和Westem blotting检测重组质粒转染组SOCS2核酸和蛋白表达,表达水平均显著高于对照组,为进一步研究SOCS2基因对不同细胞因子调控脂肪代谢提供基础.     

猪细小病毒NS1基因真核表达载体pEGFP-N1-NS1的构建与表达

根据Gen Bank上发表的PPV的基因组序列,设计扩增非结构蛋白NS1基因的特异性引物。通过PCR方法克隆NS1基因,经双酶切及与pEGFP-N1载体连接构建了真核表达载体pEGFP-N1-NS1,将双酶切和测序鉴定正确的质粒转染至293T细胞,经过荧光观察和PCR方法鉴定。结果表明,克隆了猪细小病毒NS1基因的全序列1989 bp,成功构建了NS1基因的真核表达载体,并在293T细胞中转染表达。     

猪FSP27基因过表达脂肪细胞系的构建与验证

脂肪特异蛋白27(FSP27)是一种新发现的定位在脂滴的蛋白质,在调控脂肪细胞内脂类贮存等方面起着重要作用。本试验用含有猪FSP27基因的慢病毒,感染鼠3T3-L1前脂肪细胞,建立猪FSP27基因过表达的前脂肪细胞系,为进一步研究猪FSP27基因在脂肪细胞中调控脂类代谢提供实验素材。根据猪的FSP27基因序列设计目的基因引物序列,并分别添加酶切位点Nhe I和Age I及保护碱基,克隆到p MD18-T载体做Nhe I和Age I双酶切,将酶切产物回收并将双酶切后的目的片段与GV341载体连接,转入293T细胞,包装成慢病毒,收集、浓缩、纯化病毒上清并用来感染3T3-L1前脂肪细胞,筛选稳定系,并检测感染效率和脂肪细胞表型变化。结果显示,猪FSP27基因过表达3T3-L1脂肪细胞中FSP27基因的相对表达量显著高于对照组(P0.01),在过表达脂肪细胞培养第8天,脂肪细胞形成脂滴数量明显多于对照组(P0.05),表明猪FSP27基因过表达3T3-L1脂肪细胞系构建成功。     

小鼠Foxc2质粒载体的构建及功能鉴定

构建pcDNA3.1-Foxc2真核表达载体,并以脂质体转染3T3-L1前体脂肪细胞,探究Foxc2对脂代谢的影响。取孕后15d小鼠腹部脂肪组织提取总RNA,用PCR扩增Foxc2全长序列并连接至pMD18-T载体,测序正确后克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体,成功构建pcDNA3.1-Foxc2重组质粒载体。重组质粒转染3T3-L1前体脂肪细胞系,以未转染和空载体转染作为对照,通过RT-PCR和Western blotting法检测Foxc2核酸及蛋白表达,同时检测3T3-L1前体脂肪细胞中脂代谢相关基因FAS、ATGL、HSL及PPARγ的表达。结果显示,重组质粒转染组细胞中Foxc2的核酸和蛋白水平均显著高于对照组。同时发现超表达Foxc2显著降低FAS表达,显著升高HSL及PPARγ的表达,但是对ATGL的表达无显著影响,表明Foxc2具有抑制脂肪沉积的功能。     

泛素结合酶UFC1基因的荧光表达载体构建

利用pEGFP-C3作为载体,构建与绿色荧光蛋白基因相连的泛素结合酶UFC1(ubiquitin-fold modifier conjugating enzyme 1)序列的真核表达质粒,观察其在真核细胞中的表达和定位,为进一步研究UFC1基因功能打下了基础。采用RT-PCR方法从宫颈癌Hela细胞中扩增UFC1基因全长cDNA,双酶切后克隆到真核表达载体pEGFP-C3中,构建并鉴定pEGFP-C3-UFC1质粒。经脂质体介导转染Hela细胞后,在荧光显微镜下观察目的蛋白在真核细胞内的表达情况。双酶切鉴定和测序分析均证实,已成功构建pEGFP-C3-UFC1重组载体。重组载体转染Hela细胞,观察到绿色荧光蛋白表达,还可见绿色荧光呈点状分布于细胞质中;而对照pEGFP-C3质粒转染Hela细胞,绿色荧光蛋白则呈弥散状分布。成功克隆了UFC1基因,构建了pEGFP-C3-UFC1重组质粒。     

稳定表达T_7RNA聚合酶的猪睾丸细胞系的建立

根据GenBank中登录的T7RNA聚合酶基因参考序列,设计合成了1对特异性引物扩增对T7RNA聚合酶基因进行扩增,将测序正确的T7RNA聚合酶基因和真核表达载体pIRES2-EGFP双酶切后进行连接构建pIRES2-EGFP-T7RNA RNA质粒。再将构建正确的pIRES2-EGFP-T7RNA质粒经用脂质体法转染猪睾丸细胞,通过G418筛选和单细胞克隆化,同时构建pET-32a-RED原核表达质粒载体,用其检测T7启动子控制下的红色荧光蛋白的表达。结果表明,建立的ST/T7RNA细胞系经20次传代仍然能稳定表达T7RNA聚合酶。结果显示,成功建立能稳定表达T7RNA聚合酶的猪睾丸细胞系,为猪瘟病毒反向遗传操作平台奠定了基础。     

Zic3基因在小梅山猪骨髓间充质干细胞中的表达

构建含有Zic3基因的真核表达载体pEGFP-Zic3,并转染小梅山猪骨髓间充质干细胞(BMSC),观察BMSC中Zic3的表达情况。用RT-PCR技术获得Zic3基因,并将其连接到真核表达载体pEGFP-C1中,获得真核表达载体质粒pEGFP-Zic3,采用双酶切法和DNA测序鉴定构建的载体是否正确。体外培养小梅山猪BMSC,通过免疫细胞化学法检测小梅山猪BMSC表面标志。采用脂质体法将pEGFP-Zic3转染BMSC,通过荧光显微镜观察确定重组质粒在小梅山猪BMSC内的表达和定位,用RT-PCR法检测Zic3的表达情况,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡情况。双酶切和测序证实已成功构建含目的基因Zic3的真核表达载体pEGFP-Zic3;小梅山猪BMSC体外培养状态良好,且表达CD29,不表达CD34和CD45;pEGFP-Zic3转染BMSC后可见大量绿色荧光,与对照组相比,转Zic3基因BMSC增殖能力提高,但细胞凋亡率未发生明显变化。结论:成功构建了含目的基因Zic3的真核表达载体pEGFP-Zic3,并高效转染BMSC,Zic3表达增加,且Zic3可提高细胞增殖能力。     

AdipoR2介导C2C12肌管细胞促进3T3-L1前体脂肪细胞的糖代谢能力

[目的]本文旨在探究脂联素受体2(AdipoR2)在C2C12肌管细胞与3T3-L1前体脂肪细胞共培养体系中对3T3-L1前体脂肪细胞葡萄糖吸收与消耗能力的影响。[方法]利用siRNA干扰AdipoR2基因表达,同时利用Transwell细胞培养小室对这2种细胞进行了共培养并检验相关基因的表达水平和细胞葡萄糖消耗能力的变化。[结果]使用siRNA干扰AdipoR2基因的表达后,3T3-L1前体脂肪细胞的AdipoR2基因和葡萄糖转运蛋白基因Slc2a1和Slc2a4表达水平显著下降,3T3-L1前体细胞每单位所消耗的葡萄糖量也显著下降。而在与C2C12细胞共培环境下,3T3-L1前体细胞中AdipoR2基因和葡萄糖转运蛋白Slc2a1、Slc2a4基因表达水平显著上调。同时,3T3-L1前体细胞单位消耗的葡萄糖量显著上升。进一步研究发现,AdipoR2能够有效调节3T3-L1前体脂肪细胞内葡萄糖转运蛋白基因的表达水平与葡萄糖的消耗能力。[结论]在C2C12肌管细胞共培体系中,AdipoR2能够加速3T3-L1前体脂肪细胞对葡萄糖的吸收。     

新孢子虫NcGRA2基因真核表达质粒的构建及其在293细胞内的表达

[目的]为了构建新孢子虫NcGRA2基因的真核表达载体,探讨重组载体在体外细胞的表达.[方法]从含有NcGRA2基因的重组质粒pGEX-4T1-NcGRA2中,用限制性内切酶进行酶切获得带有粘性末端的NcGRA2基因片段.经琼脂糖凝胶电泳切胶回收NcGRA2基因片段,与pcDNA3.1载体连接.将构建的真核表达质粒pcDNA3.1-NcGRA2转染到293细胞中表达.[结果]经酶切分析和序列测定,证实了重组质粒的正确连接.经免疫荧光抗体试验验证pcDNA3.1-NcGRA2能在293细胞中表达NcGRA2蛋白.[结论]获得重组质粒pcDNA3.1-NcGRA2,并能在体外细胞中表达NcGRA2蛋白,为进一步研究核酸疫苗的动物免疫试验奠定了基础.     

pcDNA3.1-GFP-LC3B真核表达载体的构建

[目的]构建含G FP-LC3B基因的真核表达载体.[方法]从HEK293细胞中提取总RNA,以反转录得到cDNA为模板,根据Gen Bank公布的人源LC3B基因序列设计引物,通过PCR方式扩增目的基因,将基因和pcDNA3.1-GFP载体双酶切后,通过T4连接酶将基因连接到pcDNA3.1-GF载体上,得到cDNA3.1-GFP-LC3B真核表达载体.[结果]扩增出目的基因,构建了含目的基因的真核表达载体cDNA3.1-GFP-LC3B.[结论]成功构建了含有人LC3B基因的真核表达载体pcDNA3.1-GFP-LC3B,为研究细胞自噬提供了基础.     

gga-miRNA-155对MDCC-MSB1细胞增殖的影响

【目的】构建gga-miRNA-155前体基因(pre-gga-miRNA-155)真核表达载体,验证gga-miRNA-155在MDCC-MSB1细胞中的表达效果,探究其对MDCC-MSB1细胞增殖的影响。【方法】采用PCR方法从鸡肝脏基因组DNA中扩增gga-miRNA-155前体基因片段pre-gga-miRNA-155,并将其克隆入pMD-18T载体,构建克隆载体pMD-18T-pre-gga-miRNA-155。用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA真核表达载体和pMD-18T-pre-gga-miRNA-155,将pre-gga-miRNA-155酶切回收片段与pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA的酶切回收片段进行连接,构建重组真核表达载体pcDNA6.2-pre-gga-miRNA-155,对其进行PCR、EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切及DNA测序鉴定。将重组载体转染到MDCC-MSB1细胞中,应用实时荧光定量PCR (Real-time PCR)检测gga-mi-RNA-155的表达水平,利用MTT法检测细胞增殖能力的变化。【结果】PCR扩增获得了长度约154bp的鸡pre-gga-mi-RNA-155基因。成功构建了pre-gga-miRNA-155的真核表达载体pcDNA6.2-pre-gga-miRNA-155,瞬时转染MD-CC-MSB1细胞后gga-miRNA-155表达水平显著增加,且MDCC-MSB1细胞的体外增殖能力增强。【结论】成功构建了pre-gga-miRNA-155的真核表达载体,其可在MDCC-MSB1细胞中过表达gga-miRNA-155,且可促进MDCC-MSB1细胞的体外增殖。     

狂犬病毒CVS株G基因和IFN-a基因共表达重组腺病毒载体的构建

通过RT-PCR方法扩增得到狂犬病毒G基因,PCR方法得到IFN-Αa基因并亚克隆入pIRES获得pIRES-a质粒.双酶切G基因和pIRES-a质粒并回收目的基因与腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接,再与pAdEasy-1质粒在BJ5183菌中同源重组产生腺病毒载体质粒.线性化后的重组腺病毒质粒转染人胚肾293细胞,通过观察报告基因绿色荧光蛋白的表达鉴定重组的腺病毒.结果表明:该重组病毒质粒经酶切鉴定与预期结果一致;转染293细胞后观察到绿色荧光蛋白的表达,说明成功构建了G和IFN-a双基因共表达重组腺病毒载体.     

猪瘟病毒囊膜蛋白E2基因真核分泌型表达载体的构建及其表达

【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pSecTag-E2qc和pSecTag-E2sh表达载体,分别进行PCR、双酶切及测序鉴定。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染猪脐静脉血管内皮细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测目的基因的转录情况,同时对转染细胞及细胞上清液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,以检测目的蛋白的表达情况。【结果】成功克隆了E2蛋白基因全长序列1119bp和去除E2蛋白跨膜基因序列999bp的目的基因。构建的表达载体经PCR、双酶切法及测序鉴定均无误。转染后细胞的RT-PCR结果显示,目的基因被成功转录。转染后细胞及细胞上清液的SDS-PAGE和Western-blot结果显示,目的基因被成功表达。【结论】成功构建了猪瘟病毒E2蛋白的真核表达载体,转染猪脐静脉血管内皮细胞后,分泌表达了猪瘟病毒E2重组蛋白。     

猪CFL2b/荧光蛋白融合基因在小鼠成肌细胞中的表达与定位

[目的]了解猪CFL2b基因在成肌细胞中的表达与定位。[方法]用RT-PCR方法扩增得到猪CFL2b基因,连接到T载体上,双酶切后通过定向克隆将其与真核表达载体pEGFP-N1的绿色荧光蛋白基因融合,构建CFL2b-荧光蛋白融合基因表达载体。然后经真核表达质粒-脂质体介导,导入C2C12细胞系。[结果]荧光显微镜观察显示:在空白载体pEGFP-N1转染的C2C12细胞中荧光布满整个细胞,而在转染阳性载体pEGFP-N1-CFL2b的C2C12细胞中荧光主要聚集在细胞质的肌动蛋白丝。表明转染的C2C12细胞系能够高效表达猪CFL2b蛋白,猪CFL2b基因表达的蛋白定位于细胞质中。[结论]该研究为CFL2b基因的功能及该基因与猪肉质性状的相关性的研究奠定了基础。     

ggamiRNA155对MDCCMSB1细胞增殖的影响

【目的】构建ggamiRNA155前体基因（preggamiRNA155）真核过表达载体,验证ggamiRNA155在MDCMSB1细胞中的表达效果,探究其对MDCCMSB1细胞增殖的影响。【方法】采用PCR方法从鸡肝脏基因组DNA中扩增ggamiRNA155前体基因片段preggamiRNA155,并将其克隆入pMD 18T载体,构建克隆载体pMD18TpreggamiRNA155。用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切pcDNA6.2GW/EmGFPmiRNA真核表达载体和pMD18TpreggamiRNA155,preggamiRNA155酶切回收片段与pcDNA6.2GW/EmGFPmiRNA的酶切回收片段进行连接,构建重组真核表达载体pcDNA6.2preggamiRNA155,对其进行PCR、EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切及DNA测序鉴定。将重组载体转染到MDCCMSB1细胞中,应用实时荧光定量PCR ( Realtime PCR )检测ggamiRNA155的表达水平,利用MTT法检测细胞增殖能力的变化。【结果】PCR扩增获得了长度约154 bp的鸡preggamiRNA155基因。成功构建了preggamiRNA155的真核表达载体pcDNA6.2preggamiRNA155,瞬时转染MDCCMSB1细胞后ggamiRNA155表达水平显著增加,且MDCCMSB1细胞的体外增殖能力增强。【结论】成功构建了preggamiRNA155的真核表达载体,其可在MDCCMSB1细胞中过表达ggamiRNA155,且可促进MDCCMSB1细胞的体外增殖。     

ggamiRNA155对MDCCMSB1细胞增殖的影响

【目的】构建ggamiRNA155前体基因（preggamiRNA155）真核过表达载体，验证ggamiRNA155在MDCMSB1细胞中的表达效果，探究其对MDCCMSB1细胞增殖的影响。【方法】采用PCR方法从鸡肝脏基因组DNA中扩增ggamiRNA155前体基因片段preggamiRNA155，并将其克隆入pMD 18T载体，构建克隆载体pMD18TpreggamiRNA155。用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切pcDNA6.2GW/EmGFPmiRNA真核表达载体和pMD18TpreggamiRNA155，preggamiRNA155酶切回收片段与pcDNA6.2GW/EmGFPmiRNA的酶切回收片段进行连接，构建重组真核表达载体pcDNA6.2preggamiRNA155，对其进行PCR、EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切及DNA测序鉴定。将重组载体转染到MDCCMSB1细胞中，应用实时荧光定量PCR ( Realtime PCR )检测ggamiRNA155的表达水平，利用MTT法检测细胞增殖能力的变化。【结果】PCR扩增获得了长度约154 bp的鸡preggamiRNA155基因。成功构建了preggamiRNA155的真核表达载体pcDNA6.2preggamiRNA155，瞬时转染MDCCMSB1细胞后ggamiRNA155表达水平显著增加，且MDCCMSB1细胞的体外增殖能力增强。【结论】成功构建了preggamiRNA155的真核表达载体，其可在MDCCMSB1细胞中过表达ggamiRNA155，且可促进MDCCMSB1细胞的体外增殖。     

三种鸭防御素真核表达载体的构建及其表达分析

为研究鸭防御素的真核表达,人工合成了鸭防御素AvBD2、AvBD10和AvBD12基因,并将其插入到真核表达质粒pDoubleEx-EGFP-flag-N中构建重组表达质粒;重组表达质粒经酶切鉴定正确后,分别转染HEK293细胞进行表达,用RT-PCR和Westem-blot鉴定目的基因的表达情况。结果表明,酶切鉴定证实目的基因成功插入到真核表达质粒中;真核表达质粒转染HEK293细胞24 h后,在荧光显微镜下可见绿荧光蛋白表达;RT-PCR能检测到目的基因mRNA,但Western-blot没有检测到目的蛋白的表达条带。     

猪前胸腺素真核表达载体的构建及表达

为了构建含有EGFP的猪ProTα基因的真核表达载体,用RT-PCR从猪肾脏中扩增ProTα基因,连接到T载体,测序鉴定后,连接到pEGFP-N3真核表达载体,构建真核表达载体pEGFP-ProTα。通过脂质体法转染Vero细胞,进行荧光检测。结果表明,构建的pEGFP-ProTα真核表达质粒,转染Vero细胞后,经荧光观察EGFP-ProTα融合蛋白有向细胞核聚集的现象。结论:本研究成功构建了真核表达载体pEGFP-ProTα,并在Vero细胞中表达,为研究猪ProTα的功能奠定了基础。     

牛myf6基因真核表达载体的构建及在成肌细胞中的表达

【目的】构建牛myf6基因真核表达载体,并观察myf6真核表达载体转染鲁西黄牛成肌细胞后基因的表达和细胞形态的变化。【方法】在质粒pIRES2-EGFP的多克隆位点插入myf6基因构建真核表达载体pIRES2-EGFP-myf6,用脂质体技术转染鲁西黄牛成肌细胞,通过G418 筛选出稳定转染的细胞株。利用Western印记、Real-time PCR技术检测成肌细胞转染前后myf6基因、肌肉肌酸激酶基因和肌球蛋白轻链基因的表达量。【结果】与对照组相比,转染质粒的成肌细胞myf6蛋白和mRNA的表达量提高（P＜0.01）,肌肉肌酸激酶基因和肌球蛋白轻链基因的mRNA表达量提高（P＜0.01）。细胞形态观察显示成肌细胞融合为肌管。【结论】构建的真核表达载体pIRES2-EGFP-myf6能在成肌细胞中高效表达,myf6基因促进了成肌细胞向肌肉细胞分化。