慢羽鸡PRLR和SPEF2基因连接方式和融合基因双向转录研究

快慢羽作为Z染色体1对等位基因(K,k+)控制的性连锁表型,被广泛应用在配套系生产的雏鸡性别鉴定上。为明确慢羽鸡PRLR和SPEF2基因连接方式和融合基因双向转录特征,本试验通过半定量PCR扩增PRLR和SPEF2基因共有区域477bp片段,明确两基因在慢羽鸡的连接方式;以禽内源白血病病毒ev21和SPEF2基因的转录作为对照,通过特异引物反转录和S1酶切法确定融合基因的转录方向。试验明确了慢羽K基因中PRLR与dSPEF2、SPEF2与dPRLR的5'末端以"头碰头"方式连接,"头碰头"连接的477 bp共有区域仅PRLR发生转录;证明了dPRLR和dSPEF2的3'末端"尾对尾"融合区域为双向共转录区域;还发现S1酶切法验证基因转录方向存在局限性。该研究结果为深入挖掘鸡慢羽K基因的分子结构和调控机制奠定了基础。     

快慢羽贵州黄鸡若干性状的早龄发育及与羽型鉴别的关系

对５５日龄期内贵州黄快珠体重增长以及翼羽、覆离翼羽和尾羽的生长变化进行了对照观测分析。表明：快慢羽鸡之间在这些性状的早龄发育上均各有其特点。对生长雏鸡的快慢羽的鉴别,在７日龄前可继续按主翼羽和覆主翼羽的相对差度进行。７日龄后,除部分慢羽鸡可继续按主翼羽和覆主翼羽的相对差度识别外,主要可依据尾羽的差异对快慢羽鸡进行区分。综合应用寅贩信息可将可鉴龄期持续至１月龄左右。     

清远麻慢羽公鸡的基因分型与生产性能研究

【目的】为了探讨慢羽系中杂合子公鸡基因分型准确率和构建无ev21基因抗病品系,探讨育种群中慢羽公鸡基因分型、慢羽中的微长型(L1)、倒长型(L2)、等长型(L3)、未出型(L4)4种表型以及与生产性能关系。另外,通过表达量的差异甄别快慢羽候选基因催乳素受体基因(PRLR)和精子鞭毛蛋白2(SPEF2)的可行性。【方法】采用PCR-RFLP对清远麻慢羽公鸡进行分子分型,通过后裔测定的测交方法验证其分子分型的准确性,运用方差分析对各组别进行检验,采用百分数资料的t检验法比较各基因分型组别间对生产性能影响;利用RT-PCR对快慢羽的候选基因进行定量分析,重点比较了快羽中的R2型与慢羽中的L2型和L4型的定量差异。【结果】568只慢羽公鸡中,缺失体组(ev21-)占比41.73%,ev21+组占比为58.27%,其中纯合子与杂合子分别占比为8.80%和49.47%;经测交验证79只公鸡后代,慢羽纯合子和缺失体基因分型准确率为46.83%,基因分型杂合子实质为纯合子。慢羽公鸡中ev21+组其后代的等长型比率显著高于ev21-组(P≤0.05),ev21-组公鸡的105日龄的通管性能极显著高于ev21+组(P≤0.01)。一日龄的鸡,在R2对慢羽(L2+L4)中PRLR表达差异不显著(P0.05),但其表达量在R2与L4型对比中则下调,达到显著水平(0.01P≤0.05),而SPEF2在慢羽中表达均极显著高于快羽鸡(P≤0.01),其中与快羽R2型比较,SPEF2分别在未出型(L4)及倒长型(L2)中均上调表达,差异均达极显著水平(P≤0.01)。【结论】研究尚需探索出慢羽杂合子准确率高的基因分型新方法,慢羽杂合子公鸡判别目前离不开现场测交验证;可以组建无ev21基因抗病品系;需进一步探讨造成ev21+组与ev21-组别间等长型比率以及羽毛成熟性差异的原因;一日龄的SPEF2与PRLR均为影响快慢羽表型不同亚型差异的候选基因。     

武定鸡快慢羽纯系选育及自别雌雄效果研究

 1992年根据武定鸡农大Ⅰ系26个父系家系6批出壳雏鸡2013只主翼羽和覆主翼羽的生长特点,将该鸡种初生雏鸡羽型分为:快羽-型、慢羽四型.表型慢羽个体占13.26%,快羽个体占86.74%,K(慢)、k(快)基因频率分别为0.0698和0.9302,经基因型测交和纯繁扩群.基本育成武定鸡快、慢羽两个纯系.用两系配套繁殖或用该鸡种的慢羽母鸡同红布罗快羽公鸡杂交,其雏鸡羽速自别雌雄的准确率平均为98.57%.     

成都白鸡快、慢羽纯系的选育及羽型研究

1982年我室就成都白鸡羽型,快,慢羽纯系的选育、K(慢)、k(快)基因频率及杂种鸡羽速自别雌雄的准确率等进行了研究。按主翼羽和覆主翼羽生长状况,该鸡种初生雏羽型分为:快羽一型,慢羽三型。K(慢),k(快)基因频率分别为0.1602和0.8398。表型鸡经测交,纯繁选育出成都白鸡快,慢羽两个品系。以成都白鸡慢羽母鸡同快羽京白公鸡杂交,其杂种鸡羽速自别雌雄的准确率为99.13%。     

羽速基因对坝上长尾鸡育成期体重和体尺生长发育的影响

为研究羽速基因对坝上长尾鸡育成期生长发育的影响,选取239只坝上长尾鸡(快羽公鸡59只,快羽母鸡60只,慢羽公鸡62只,慢羽母鸡58只)进行试验。结果表明,快慢羽公鸡间8~20周体重、体斜长、胫围、胸宽、胫长,8周、20周耻骨间距,20周胸角差异不显著。快慢羽母鸡间8~20周胫围、胸深、胫长,8周、20周耻骨间距,20周胸角差异不显著;快羽母鸡10周、14周体重,10~16周胸宽与骨盆宽,10~20周体斜长与龙骨长显著大于慢羽母鸡。在育成前期快羽鸡生长较快,而育成期后期慢羽鸡生长较快,快慢羽鸡生长发育时间的差异并不影响成年后鸡的体重与体型。     

清远麻慢羽公鸡的基因分型与生产性能研究

【目的】为了探讨慢羽系中杂合子公鸡基因分型准确率和构建无ev21基因抗病品系,探讨育种群中慢羽公鸡基因分型、慢羽中的微长型（L1）、倒长型（L2）、等长型（L3）、未出型（L4）4种表型以及与生产性能关系。另外,通过表达量的差异甄别快慢羽候选基因催乳素受体基因（PRLR）和精子鞭毛蛋白2（SPEF2）的可行性。【方法】采用PCR-RFLP对清远麻慢羽公鸡进行分子分型,通过后裔测定的测交方法验证其分子分型的准确性,运用方差分析对各组别进行检验,采用百分数资料的t检验法比较各基因分型组别间对生产性能影响;利用RT-PCR 对快慢羽的候选基因进行定量分析,重点比较了快羽中的R2型与慢羽中的L2型和L4型的定量差异。【结果】568只慢羽公鸡中,缺失体组（ev21 ^-）占比41.73%,ev21 ⁺组占比为58.27%,其中纯合子与杂合子分别占比为8.80%和49.47%;经测交验证79只公鸡后代,慢羽纯合子和缺失体基因分型准确率为46.83%,基因分型杂合子实质为纯合子。慢羽公鸡中ev21 ⁺组其后代的等长型比率显著高于ev21 ^-组(P≤0.05）,ev21 ^-组公鸡的105日龄的通管性能极显著高于ev21 ⁺组（P≤0.01）。一日龄的鸡,在R2对慢羽（L2+L4）中PRLR表达差异不显著（P>0.05）,但其表达量在R2与L4型对比中则下调,达到显著水平（0.01<P≤0.05）,而SPEF2在慢羽中表达均极显著高于快羽鸡（P≤0.01）,其中与快羽R2 型比较,SPEF2分别在未出型(L4）及倒长型（L2）中均上调表达,差异均达极显著水平（P≤0.01）。【结论】研究尚需探索出慢羽杂合子准确率高的基因分型新方法,慢羽杂合子公鸡判别目前离不开现场测交验证;可以组建无ev21基因抗病品系;需进一步探讨造成ev21 ⁺组与ev21 ^-组别间等长型比率以及羽毛成熟性差异的原因;一日龄的SPEF2与PRLR均为影响快慢羽表型不同亚型差异的候选基因。     

科新903蛋鸡父母代羽速自别雌雄的培育

根据羽毛伴性遗传的理论,在科新903褐壳蛋鸡配套系选育过程中,为了培育父母代鸡在初生雏时,根据主翼羽和覆主翼羽生长的相对长度自别雌雄,将父本父系A 系和母本父系C 系培育成纯合快羽基因型纯系,将父本母系B 系和母本母系D 系培育成纯合慢羽基因型纯系。用A 系公鸡与B 系母鸡交配,用C 系公鸡与D 系母鸡交配,产生的子一代即父母代,可根据快慢羽自别雌雄,快羽为母鸡,慢羽为公鸡。纯系繁殖羽速类型的准确率达99%以上。生产父母代羽速鉴别雌雄的准确率达98%以上。鉴别速度快,准确率高,不损伤鸡体,效果好。     

河北地方鸡羽色候选基因SOX10、SLC45A2和Tyr变异研究

为了解河北地方鸡种的羽色遗传资源特征,检测羽色基因位点在不同品种鸡的分布情况,本试验通过PCR以及PCR-SSCP检测发现,90%以上的太行鸡和坝上长尾鸡与海兰褐和海兰灰祖代鸡一样,其SOX10基因上游有8.3 kb序列插入,表现红色野生型羽色特征;而白来航鸡主要为缺失型,具有深棕羽色基因型基础。太行鸡和海兰灰与白来航的SLC45A2基因外显子3的A/G突变位点为G等位基因,具有银羽基因遗传基础;而坝上长尾鸡主要为A等位基因,具有金羽基因遗传基础。46.0%的坝上长尾鸡和16.7%的太行鸡Tyr基因有7.7 kb病毒插入,存在白羽遗传基础,而祖代海兰褐、白来航和海兰灰的插入阳性率较低。综上所述河北省地方品种中存在丰富的羽色基因库,有筛选培育各种羽色品系的遗传基础。     

鸡不同品系及其后代的羽速羽型研究

对三个快羽系、三个慢羽系及其九个杂交组合共1440只雏鸡在42日龄内的羽速羽型特征作了研究。结果表明:1、出壳时的羽型可根据主翼羽与覆主翼羽的绝对差度分为六型。2、在42日龄内,三个快羽系的羽型特征较一致;而三个慢羽系的羽型却有较大的差异。3、亲本对杂交鸡的羽型影响在品系间有差异。4、在42日龄内的不同阶段,羽速(即快、慢羽)的鉴别要按不同部位的羽型特征的差异来进行。     

鸡胚骨形成蛋白(BMPs)基因表达水平的发育性变化

【目的】分析骨形成蛋白(Bone morphogenetic proteins,BMPs)基因在鸡胚不同发育阶段的表达水平,为进一步研究BMPs基因的功能提供依据。【方法】选取AA肉鸡种蛋100枚进行孵化,分别于孵化期第1、2、3、4、5、6、9、12、15、18 d(记为E1～E18)选取胚蛋6枚,E1～E6采集整胚,E12～E18分别采集大脑、心脏、肝脏和腿肌组织。采用定量PCR(qPCR)方法检测BMP2、BMP4和BMP7基因的表达丰度。【结果】BMP2基因在E1～E6中的表达水平呈现先上升后下降的趋势;BMP2在E4、E5和E6中的表达水平显著高于E1(P0.05);BMP2在大脑中的表达显示, E12显著高于E1(P0.05),而到了E18阶段反而极显著低于E1(P0.01);BMP2在心脏和腿肌中的表达均是E9显著或极显著大于E1(P0.05或P0.01);鸡胚发育到了后期(E15和E18),BMP2在心脏和肝脏中的表达却显著或极显著低于E1时期(P0.05或P0.01)。BMP4在E1～E6中的表达水平也是呈现先上升后下降的趋势;BMP4基因在E3～E6整胚和E9胚龄的大脑、心脏、肝脏和腿肌中的表达水平均显著或极显著高于E1胚龄(P0.05或P0.01)。BMP7在E4、E5和E6的表达与BMP2、BMP4类似,即BMP7基因的表达水平显著或极显著高于E1时期(P0.05或P0.01),但在E2和E3时期,BMP7表达水平反而降低了,且E2时期极显著低于E1时期(P0.01);在整胚和大脑中的结果显示,E4～E18阶段BMP7基因的表达水平呈现逐渐降低趋势,到E18时期大脑中的BMP7基因的表达水平极显著低于E1时期(P0.01);与E1相比,在心脏中BMP7到E12时期达到最低水平(P0.01),而肝脏中BMP7基因表达水平在E12和E15阶段均极显著低于E1(P0.01)。【结论】BMP2、BMP4和BMP7基因在整胚的表达水平呈现先上升后下降趋势,至E4时期到达最高点;BMP2基因在E9、E12、E15和E18的心脏、肝脏和腿肌中的表达均呈现下降趋势。说明BMPs基因在器官形成初期起着关键作用,之后随着器官发育完成BMPs基因的作用逐渐减弱。     

温氏土鸡和白洛克鸡胚小肠EAATs mRNA表达差异及发育性变化

 【目的】研究温氏土鸡（WYFC）和隐性白洛克（WRRC）鸡胚小肠酸性氨基酸转运载体EAAT2（SLC1A2）和EAAT3（SLC1A1）mRNA的表达差异和发育性变化。【方法】选取蛋重相近的两品种纯系种蛋各96枚,每个品种随机分为6组,每组16枚,在相同的条件下进行孵化。分别就每个品种在9（E9）、12（E12）、14（E14）、17（E17）和19胚龄（E19）及出壳当天（DOH）选取16枚鸡胚,称重后采集小肠样品,采用real-time RT-PCR方法检测小肠EAATs mRNA的相对表达丰度。【结果】（1）9、12、14、17和19胚龄隐性白洛克胚蛋重量及出壳当天雏鸡体重极显著高于温氏土鸡（P＜0.01）;（2）从发育性变化来看,EAAT2 mRNA在两个品种表达基本一致,即E9—14表达量下调,E17有所上调,随后下调,E12、E17、E19和DOH两品种差异极显著（P＜0.01）,E14差异显著（P＜0.05）;EAAT3 mRNA在两个品种都表现为随胚龄增加而表达上调,E19两品种差异极显著（P＜0.01）,E12差异显著（P＜0.05）;（3）EAAT2和EAAT3 mRNA表达丰度,温氏土鸡鸡胚小肠高于隐性白洛克,不同发育阶段对其都有影响,均存在“品种×胚龄”的互作效应。【结论】EAATs mRNA表达丰度在品种和胚龄间存在差异,不同基因表达的发育模式亦不相同。     

不同羽色及羽速坝上长尾鸡产蛋性能比较

本试验旨在研究河北省优秀地方家禽品种资源坝上长尾鸡不同羽色群体及不同羽速群体在30~45周龄间产蛋性能的差异。研究结果表明,在快羽中麻羽具有产蛋率高的优势,在慢羽中白羽和黑羽更具产蛋优势;快、慢羽群体中相同羽色的产蛋率变化趋势也不尽相同,说明快、慢羽群体间存在差异。在后期突发腹泻期间,在不同羽色间,白羽鸡比黑羽鸡、麻羽鸡产蛋率下降快。在不同羽速间,慢羽鸡产蛋率下降较快,快羽鸡产蛋率有较低的升高,产蛋率差距缩小。在抗病能力方面,白羽比麻羽、黑羽性能差,快羽比慢羽性能差。     

卷羽麒麟鸡快、慢羽品系生长发育规律对比分析

【目的】了解快羽和慢羽麒麟鸡生长发育规律，评估其作为培育自别雌雄配套系遗传素材的价值，挖掘并利用该地方遗传资源。【方法】分别采用Bertalanffy、Gompertz和Logistic 3种模型拟合分析麒麟鸡快羽系和慢羽系1～19周龄生长发育规律，探究其合适的生长模型。【结果】对于公鸡，快羽和慢羽公鸡体重仅在第1周龄差异显著(0.012分别为0.999和0.993，慢羽系公、母鸡体重的拟合优度R2均为0.994。快、慢羽系鸡的龙骨长和胫围的最佳拟合模型均为Bertalanffy模型，快羽系鸡胫长的最优模型是Logistic，慢羽系鸡的胫长的最优生长模型是Gompertz。【...     

6个地方鸡种羽毛性状遗传的研究

 以丝羽乌骨鸡（S）、仙居鸡（X）、固始鸡（G）、萧山鸡（XIS）、北京油鸡（Y）、狼山鸡（L）6个地方鸡种为试验素材,通过品种间的正反交试验、回交试验、横交试验,观测羽型性状、羽色性状、羽速性状在不同组合下产生的F1和F2代中的表现和分离比例,分析各性状遗传规律。结果表明：羽型性状受常染色体基因H/h控制,片状羽型对丝状羽型为显性,片状羽型在仙居鸡、固始鸡、萧山鸡、北京油鸡、狼山鸡群体中均为显性纯合,遗传符合孟德尔遗传规律,观测值与理论值相一致（P>0.05）;狼山鸡的黑羽,北京油鸡的红羽和萧山鸡、仙居鸡、固始鸡的黄羽对丝羽乌骨鸡隐性白羽的遗传方式是完全显性遗传;各鸡种具有独特的羽速种质特性,丝羽乌骨鸡、仙居鸡为快羽型,固始鸡、北京油鸡、萧山鸡为慢羽型,狼山鸡为快慢羽混合型,伴性快慢羽基因（k/K）在6个地方鸡种中遗传稳定,符合伴性遗传规律,观测值与理论值相一致（P>0.05）。      

多浪羊PRLR基因克隆测序及不同组织差异表达分析

【目的】克隆多浪羊催乳素受体基因（PRLR）CDS区序列，并检测不同组织中PRLR基因在初情期前后表达差异，为PRLR基因在初情期启动过程中发挥的主要作用提供参考依据。【方法】利用RT-PCR技术和使用相关的生物学信息软件预测其编码蛋白的结构和功能，通过qPCR检测多浪羊初情期前后各组织中的PRLR基因的表达水平。【结果】获得了多浪羊PRLR基因的CDs区序列长1 746 bp。多浪羊的3个时期5个组织中均有PRLR基因的表达。PRLR基因在初情期前多浪羊垂体组织中的表达量显著高于其他组织（P<0.05）；初情期垂体组织中PRLR基因的表达量仍显著高于其他4个组织（P<0.05），初情期后下丘脑和垂体组织中PRLR基因的表达量显著高于其他3个组织（P<0.05）；初情期垂体和输卵管组织中PRLR基因的表达量升高，初情期后显著高于初情期前和初情期后（P<0.05）。【结论】揭示了PRLR基因可能在多浪羊初情期启动的过程中参与了调控。     

卷羽鸡毛囊发育规律及卷羽候选基因KRT75遗传特征分析

【目的】研究卷羽鸡卷羽弯曲过程、结构特点、卷羽毛囊发育规律和卷羽候选基因KRT75序列特征及其在卷羽毛囊发育过程中的表达规律。【方法】通过对360只卷羽鸡从1日龄到300日龄卷羽发生情况进行观察,了解其羽毛出壳后弯卷过程;制作成年卷羽和片羽羽毛切片,了解卷羽羽轴、羽枝、羽小枝、羽小钩显微结构特点;对卷羽鸡和片羽鸡胚胎期8-19 d皮肤毛囊制作石蜡切片,阐明卷羽毛囊发生过程,分析卷羽和片羽毛囊发育异同;分别提取13胚龄卷羽和片羽鸡皮肤RNA,反转录为cDNA,连接pMD™ 18-T 载体,将连接产物加入DH5α感受态细胞中,转化涂板,挑取白色菌落摇菌后PCR鉴定,阳性菌液送测序,同时随机抽取15只300日龄片羽鸡和15只卷羽鸡,翅下静脉采血,血液基因组柱式小量提取试剂盒提取DNA,PCR产物纯化后测序,采用DNAMAN软件比对分析KRT75基因的遗传特征;分别提取卷羽和片羽胚胎期E 8-E 17d皮肤RNA,反转录成cDNA,根据SYBR试剂盒操作说明荧光定量KRT75基因在卷羽和片羽整个毛囊发育过程中的表达变化规律。【结果】卷羽鸡初生绒羽弯曲明显,以后逐渐弯曲,在第一次换羽结束时（约6周龄左右）全身羽毛显著弯曲;卷羽羽轴向外翻卷,羽小枝上着生羽钩,但羽小枝之间不能相互勾连形成闭合羽片;卷羽毛囊发育从胚胎期第8天开始到第16天结束,整个过程类似于片羽毛囊发育,卷羽毛囊在胚胎期第8-16天完成,整个过程和片羽毛囊发育过程基本相似,但在12-15胚龄卷羽毛囊髓质面积、羽小枝大小与片羽毛囊存在明显差异,其中在第12-14天,卷羽毛囊髓质面积要明显大于片羽,羽小枝板要明显小于片羽;卷羽鸡和片羽鸡KRT75基因CDS全长均为1 569bp,编码522个氨基酸,全序列没有发生69 bp的缺失突变,但在CDS区的3个SNP（954bp: T>C;967bp: T>C;978bp: C>T）可能是卷羽、片羽区别的分子标记;KRT75基因在片羽和卷羽中的表达变化存在明显差异,在片羽毛囊胚胎期E8-E17中表达量均很低,而在卷羽鸡12胚龄显著上调,且高表达量持续到15胚龄,16胚龄显著下调,其中在胚胎期第9、10、12-16天KRT75基因在卷羽中的表达量均极显著高于片羽（P<0.01）,KRT75基因可能在卷羽羽轴髓质和羽小枝分化过程中起重要作用。【结论】初步研究表明卷羽鸡的卷羽并不是由于KRT75基因缺失突变引起,但KRT75可能与卷羽髓质和羽枝嵴形成有关。     

鸡胚NANOG、POUV和TWIST2基因不同发育阶段表达谱分析

为了解析鸡胚发育过程中NANOG、POUV和TWIST2基因的调控作用,利用荧光定量RT-PCR方法,研究NANOG、POUV和TWIST2基因在孵化1~6d(E1~E6)的整体胚胎和孵化15和18d(E15、E18)鸡胚的大脑、心脏、肝脏和左侧大腿肌肉组织中的表达谱。结果表明,1)NANOG基因的表达水平在E2~E6整胚和E15、E18胚期的大脑、心脏、肝脏和腿肌中的表达水平均极显著低于E1时期(P0.01)。2)在鸡胚发育的整胚E1~E6和E15、E18时期的大脑、肝脏、心脏和腿肌中,POUV基因的表达水平基本呈现逐渐降低趋势,且从E3时期后均显著低于E1时期(P0.05或P0.01)。3)TWIST2基因在E1~E6整胚中的表达水平呈现逐渐增高趋势,到E6达到最高水平(P0.05或P0.01);在E15和E18时期的上述4种组织中又呈现降低趋势,但均高于E1时期。NANOG、POUV和TWIST2基因在鸡胚发育过程的调控水平存在差异,研究结果可望为鸡的育种和临床研究提供资料。     

裸背鸡的研究

本试验以740只1日龄慢羽蛋鸡为材料，对裸脊鸡背羽生长发育及其生产性能进进了研究。结果表明：（1）裸背鸡脊羽生长发育明显迟缓于非裸背鸡，在5周龄时即可区分之；（2）裸背鸡比非裸省鸡蛋大，蛋白品质好，但其早期生长慢，血斑率高。     

慢羽鸡成纤维细胞内源性白血病病毒ev21基因敲除

【目的】探索在慢羽鸡成纤维细胞中敲除ev21基因的可行性,净化鸡群内源性逆转录病毒,同时为快速培育缺失ev21基因的慢羽鸡配套系打下基础。【方法】根据ev21基因序列（KY235336）特点,分别在其5'和3'端各设计2个sgRNA,用于构建4种不同sgRNA的打靶质粒,筛选出在5'和3'端打靶效率较高的sgRNA。然后基于CRISPR/Cas9基因编辑技术对ev21基因进行剪切,并通过同源重组方式以红色荧光蛋白（mCherry）的DNA片段（CAG-mCherry）替换ev21基因,实现对慢羽鸡成纤维细胞内源性白血病病毒ev21基因定点敲除。【结果】在慢羽鸡成纤维细胞中能检测到ev21基因,构建的4种sgRNA（sgRNA1~sgRNA4）均能成功插入对应的打靶质粒中,经嘌呤霉素筛选及T7E1酶切检测,发现转染4种不同sgRNA打靶质粒后慢羽鸡成纤维细胞均有不同程度的死亡,其中又以sgRNA1和sgRNA3的基因敲除效率较高。同时针对同源位点左右同源臂构建表达mCherry的供体质粒,以其转染293T细胞12 h后均能表达出mCherry。以sgRNA1和sgRNA3打靶质粒及供体质粒共同转染慢羽鸡成纤维细胞,观察发现成纤维细胞内的mCherry持续表达,至转染后第30 d通过流式细胞仪分选收集红色荧光阳性成纤维细胞,并提取其总DNA进行PCR鉴定与基因测序,结果显示红色荧光阳性成纤维细胞中有目的片段（CAG-mCherry）插入,即以插入替换方式能实现对ev21基因的敲除。【结论】基于crispr/cas9基因编辑技术的基因敲除方法能成功敲除慢羽鸡成纤维细胞内源性白血病病毒ev21基因,为培育缺失ev21基因的慢羽鸡品系提供技术支持。