PI3K信号通路关键基因在猪卵泡发育中的表达规律

【目的】研究不同时期猪卵巢卵泡发生的形态特征及磷脂酰肌醇3–激酶(Phosphoinositide 3-kinase,PI3K)信号通路关键基因在卵泡发生发育中的作用。【方法】通过HE染色观察12日龄、30日龄、70日龄、20月龄卵泡期及黄体期、48月龄的长大二元母猪卵巢卵泡发育的形态变化,应用实时荧光定量PCR检测PI3K通路关键基因在这些时期的表达规律,并通过Western blot法检测PI3K通路重要的下游效应因子p-rpS6在不同时期猪卵巢的表达情况。【结果】12日龄母猪卵巢皮质边缘有大量的原始卵泡,皮质与髓质交界处可见少量初级卵泡及个别的次级卵泡;30日龄母猪卵巢次级卵泡数量增加;70日龄出现3级卵泡;20月龄卵泡期、黄体期分别有大量成熟卵泡、大体积的黄体;48月龄较难观察到原始卵泡。PI3K通路抑制因子PTEN、TSC1、TSC2与激活因子PDK1、AKT1、mTOR的mRNA均在12日龄表达量最高,70日龄、48月龄表达量次之,30日龄和20月龄表达量最低;下游效应基因rpS6的mRNA 30日龄表达量最高,20和48月龄表达量最低,p-rpS6蛋白在12日龄、20月龄、48月龄母猪卵巢高表达,在30日龄、70日龄中几乎不表达。【结论】PI3K通路关键基因在不同时期母猪卵巢中的表达水平不同,说明该通路参与了猪卵泡的早期发生及卵泡成熟的调控过程。     

二花脸猪卵巢卵泡形成和早期发育过程中雌二醇和孕酮含量变化及其受体定位

为了研究雌二醇(E_2)和孕酮(P_4)在猪卵巢卵泡形成和早期发育过程中可能的作用,本试验以胎70日龄、90日龄和新生1日龄3个阶段的母猪为试验动物,通过免疫组织化学方法对胎猪和新生仔猪卵巢组织中的雌二醇受体(ER)和孕激素受体(PR)进行定位分析。通过放射免疫测定法对胎猪和新生仔猪的卵巢组织和血清中E_2及P_4含量进行测定,并分析E_2和P_4水平与猪的卵泡形成的相关性。结果显示:在猪早期阶段卵巢中ER主要在卵巢表皮细胞,卵母细胞巢中的卵原细胞和卵母细胞,以及原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡的卵母细胞和颗粒细胞的核中表达,PR主要在卵巢表皮细胞,卵母细胞胞核,原始卵泡和初级卵泡的颗粒细胞的核中表达;随着胎龄的增加,卵巢中的E_2和P_4水平下降,并且与卵泡的形成和发育呈负相关。说明出生前猪卵巢组织中的E_2和P_4含量变化可能影响猪卵巢卵泡的形成和早期发育。     

二花脸猪卵巢卵泡发育过程中可溶性鸟苷酸环化酶和一氧化氮合酶活性变化及其定位

为研究在胎猪卵巢发育过程中,NO/s GC/c GMP信号通路对猪卵泡发育的影响,选取70日龄、90日龄胎猪和1日龄仔猪以及120日龄母猪为试验动物,取其卵巢,对其进行免疫组织化学分析,研究一氧化氮合酶[e NOS(endothelial nitric oxide synthase)、i NOS(inducible nitric oxide synthesis)、n NOS(neuronal nitric oxide synthase)]以及可溶性鸟苷酸环化酶(s GCα1、s GCβ1)在卵巢中的表达,并使用化学比色法进行酶活性测定。结果表明,3种NOS在卵巢不同细胞中均有表达,特别是随着卵泡的发育,在膜细胞和颗粒细胞中的表达逐渐增强。而s GCα1和s GCβ1除了在卵巢的腔前卵泡的颗粒细胞中表达,也在黄体细胞和有腔卵泡膜细胞中有较高的表达量。研究发现,s GCα1和s GCβ1在腔前卵泡的颗粒细胞中的表达量最高,且随着卵泡的不断发育,这2种蛋白的表达强度逐渐降低;总NOS、e NOS、i NOS活性在出生前期显著高于出生后期(P 0. 05),n NOS含量在出生前期和出生后期之间差异不显著(P 0. 05)。说明NO/s GC/c GMP通路在卵泡的早期发育过程中发挥了重要的作用。     

姜曲海母猪初情期前生殖器官雌激素受体mRNA表达丰度的研究

采用非同位素标记原位杂交组织化学方法,检测姜曲海母猪初情期前(初生及15、30、45、60日龄)卵巢和子宫中雌激素受体(ER)mRNA的表达丰度。图文分析系统扫描结果显示：初生卵巢内ER mRNA表达不明显,15～45日龄时阳性率逐渐上升,60日龄时略有下降,阳性斑点主要集中于原始、初级、次级各级卵泡,且大卵泡阳性斑点较小、卵泡密集;子宫内ER mRNA阳性率与日龄呈正相关,且阳性斑点主要出现在子宫内膜腺体中,基质部分较少。     

二花脸猪和大白猪睾丸生长激素受体基因表达的发育性变化

随机选取0、3、20、30、90、120和180日龄二花脸公猪和大白公猪各4头，用相对定量RT-PER法研究睾丸组织中生长激素受体（GHR）基因表达的发育性变化。结果表明，二花脸猪与大白猪睾丸GHR mRNA表达的发育模式不同，二花脸猪GHR mRNA相对表达量从0到30日龄逐渐上升，在90和120日龄呈阶段性降低（P〈0．05），之后在180日龄又再次上调；大白猪GHR mRNA相对表达量在出生当日最高，3日龄显著下降（P〈0．05），随后直至180日龄维持在较低水平并相对恒定。总的来说，二花脸猪睾丸GHR mRNA相对表达量显著高于大白猪（P〈0．05）。提示：不同品种猪睾丸GHR mRNA表达具有特定的发育模式，并可能与性成熟的早晚有关。     

金华猪生殖器官及性机能发育的研究——Ⅱ.母猪生殖器官及性机能的发育

选用不同日龄的金华母猪102头,进行生殖器官及性机能发育的系统研究结果表明:母猪性成熟也较早。生殖器官发育的增长高峰一般出现在60—120日龄阶段,比体重增长快,较为早熟。在卵巢组织学观察中,70日龄时1/4个体见有成熟卵泡和黄体;110～120日龄时各个体均有成熟卵泡和黄体。初次出现阴户红肿为74.79±1.05日龄,体重12.22±0.36公斤,此时卵泡迅速发育,有的个体已能排卵和受孕产仔,达到初情期。103.78±1.21日龄,体重17.74±0.39公斤时,出现典型发情,已有正常排卵和受孕产仔能力,达到性成熟期。4月龄排卵数为10.75个;8月龄为21.2个,已接近成年母猪的排卵数24.44个。小母猪血液中雌二醇含量较高,90日龄时达110.83pg/ml。证明其体内神经与激素分泌系统的发育和调节生殖活动的机能建立较早,从而能释放正常水平的各种生殖激素,为性早熟奠定了生理基础。     

神经生长因子及其受体在蛋鸡卵巢上的表达

以83日龄性未成熟和230日龄性成熟蛋鸡各5只为试验动物,通过免疫组织化学方法和荧光定量PCR技术研究神经生长因子(NGF)及其受体酪氨酸激酶A(TrkA)和神经营养素受体p75(p75)在蛋鸡卵巢和等级前卵泡上的表达定位及其mRNA表达水平。结果表明:在83日龄性未成熟蛋鸡卵巢上均未发现NGF及其受体TrkA和p75阳性表达细胞,但在230日龄等级前卵泡的膜细胞和颗粒细胞中均发现有其阳性细胞表达。NGF及其受体的mRNA表达水平在230日龄蛋鸡小黄卵泡(SYF)上的表达量显著高于各自在小白卵泡(SWF)和大白卵泡(LWF)上的表达量。此外,230日龄蛋鸡血清中的雌激素和孕激素水平都显著高于83日龄蛋鸡。综上所述,NGF可能在蛋鸡等级卵泡的生长、发育和排卵过程中起一定调节作用。     

猪发育期NPY-Y1和GPR54受体基因的表达规律研究

[目的]研究猪发育期NPY-Y1和GPR54受体基因的发育性变化。[方法]分别选取初生、60、120、初情期、180日龄的苏姜猪母猪各3头,采集下丘脑、垂体、卵巢组织样品,提取组织RNA,采用荧光定量PCR分析NPY-Y1、GPR54受体基因的发育性变化。[结果]下丘脑、垂体与卵巢内NPY-Y1 mRNA从初生到初情期表达量逐渐下降,在初情期达到最低,初情期后呈上升趋势。在3种组织内,初情期与其他时期NPY-Y1 mRNA表达量均存在显著差异(P<0.05);GPR54 mRNA从初生到初情期表达量逐渐上升,在初情期达到最高,初情期后呈下降趋势。在3种组织内,初情期也与其他时期GPR54 mRNA表达量也均存在显著差异(P<0.05)。[结论]猪发育期NPY-Y1基因与GPR54基因表达存在负相关性。     

姜曲海瘦肉型品系母猪早期生殖器官发育及生殖激素分泌的研究

以姜曲海瘦肉型品系猪零世代及其亲本杜枫姜(杜洛克×枫泾猪×姜曲海猪)母猪为研究对象,探讨0~75日龄母猪生殖器官的生长发育和生殖激素的分泌规律。结果表明:零世代与亲本母猪生殖器官从60日龄开始表现出快速生长,与该期LH、FSH、E2水平升高密切相关,说明这3种激素浓度的上升,加速了生殖器官的生长,尤以卵巢最为明显。零世代母猪卵巢75日龄时有三级卵泡出现,亲本则发生在60日龄,75日龄时卵巢表面有囊状卵泡出现,并观察到成熟卵泡,零世代母猪卵巢卵泡发育比亲本稍迟,在很大程度上保持了原有品种性成熟早的优点。     

CTNNB1对猪卵巢颗粒细胞的调控

【目的】卵巢颗粒细胞的增殖和分化是原始卵泡生长启动的关键因素,卵巢颗粒细胞过度凋亡是卵泡闭锁的主要原因,因此卵巢颗粒细胞的功能对卵泡生长发育、排卵、激素分泌等至关重要。研究通过探究连环蛋白β1（catenin beta 1, CTNNB1）对猪卵泡发育过程中颗粒细胞的增殖、凋亡及类固醇激素分泌等功能的影响,为猪卵泡发育的分子调控机制研究提供参考。 【方法】利用RNA抽提、实时定量PCR（Quantitative real time PCR, qRT-PCR）等方法,构建CTNNB1在母猪卵巢、肌肉、大脑等9个组织的表达谱;检测母猪性成熟过程中卵巢组织和小（≤3 mm）、中（3—6 mm）、大（≥6 mm）卵泡颗粒细胞中CTNNB1的表达情况。构建CTNNB1的真核表达载体及合成siRNA,转染至猪卵巢颗粒细胞,采用EdU、Annexin V- FITC/PI双染、ELISA等方法,检测CTNNB1对颗粒细胞增殖、凋亡、类固醇激素分泌的影响,以及对类固醇激素合成通路重要基因转录表达的影响。【结果】与肌肉、大脑等组织相比,CTNNB1在卵巢中mRNA表达水平最高。性成熟母猪卵巢中CTNNB1转录水平显著高于性成熟前和性成熟后的母猪;卵巢卵泡中CTNNB1转录和蛋白水平随卵泡发育明显上调;且卵巢颗粒细胞中CTNNB1转录和蛋白水平也随卵泡的发育逐渐上调。更重要的是,CTNNB1显著促进颗粒细胞增殖,抑制颗粒细胞凋亡;CTNNB1能够上调CYP1A1和HSD17B7的转录水平,下调CYP11A1、ESR1、ESR2、FSHR、LHR和NR5A1等类固醇激素合成相关基因的转录水平,进而促进颗粒细胞雌激素的分泌,抑制颗粒细胞雄激素和孕激素的分泌。【结论】本研究证实CTNNB1可能通过促进颗粒细胞增殖及雌激素的合成和分泌,抑制颗粒细胞凋亡及雄激素、孕激素的合成和分泌,进而促进卵泡的生长发育。     

猪磷酸二酯酶7A mRNA荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

为研究磷酸二酯酶(PDE)7A基因在猪体内的分布,本试验通过构建含有目的基因片段标准质粒的方法,成功建立荧光定量PCR检测PDE7A基因的标准曲线,可检测到最低1×102copies/μL的初始模板量,重复试验变异系数为2.22%～3.71%,具有较高的灵敏度和可重复性。用该方法检测到PDE7AmRNA在试验用小型猪的心肌中表达量最高(比率为4.54×10-2),骨骼肌次之(1.44×10-2),其他内脏器官较少。     

不同授粉方式下锥栗果实的生长发育特性

选用‘华栗3号’为材料,采用异交、自交、不授粉及自然授粉4种授粉方式探究锥栗(Castanea henryi)果实的生长发育特性.结果表明:锥栗果实生长发育期约135 d,异交、自然授粉的总苞和子房及自交、不授粉的总苞的鲜重均呈"慢—快—慢—快"的增长趋势,自交、不授粉的子房鲜重呈"慢—快—慢"的增长趋势,总苞和子房纵横径呈"慢—快—慢"增长趋势,果实成熟时总苞和子房大小均表现为异交自然授粉自交不授粉;不同授粉处理对锥栗座苞及落果的影响不同,异交、自然授粉经历了2次落果高峰期,自交、不授粉则经历了3次落果高峰期,落果最高峰均出现在花后90~105 d;不同授粉处理显著影响锥栗的结实率和空苞率,4种授粉处理的坐苞率、结实率大小均表现为异交自然授粉自交不授粉,空苞率大小表现为不授粉自交自然授粉异交.     

犬中枢神经不同部位磷酸二酯酶基因表达和活性测定

为探明磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)在犬中枢神经活动中的作用,采用反转录聚合酶链反应检测18个PDE亚型在犬中枢神经不同部位中(大脑、小脑、延髓和脊髓各段)的表达分布,以高效液相色谱法检测环核苷酸在酶反应前后的含量变化,计算PDE活性。结果显示:在所测18个PDE亚型中,犬中枢神经的8个测定部位均有PDE1A,PDE1B,PDE1C,PDE2A,PDE3A,PDE3B,PDE4A,PDE4B,PDE4C,PDE4D,PDE5A,PDE7A,PDE7B,PDE8A,PDE8B,PDE9A,PDE11A表达,PDE10A均呈阴性表达,不同部位之间表达量差异较大,其中PDE4在各部位均呈优势表达;8个测定部位cAMP-PDE活性均高于cGMP-PDE活性,且不同部位PDE活性存在差异,其中脑组织cAMP-PDE活性和cGMP-PDE活性均高于脊髓各段。结果提示PDE可能在由cAMP和cGMP介导的中枢神经经信号传导中发挥着重要作用。     

重组GSTA3蛋白对福美双诱导的肉鸡TD中抗凋亡基因BAG-3表达的影响

【目的】肉鸡胫骨软骨发育不良（TD）是肉鸡常见的一种骨骼性疾病,研究重组GSTA3蛋白对福美双诱导的TD肉鸡软骨细胞中抗凋亡基因BAG-3表达的影响,为治疗TD提供新的思路和方法。【方法】将120羽1周龄肉雏鸡随机分为6组（编号为A、B、C、D、E、F组）。A、B、C组为基础日粮对照组,D、E、F组为添加福美双日粮诱导TD组。试验饲喂福美双2 d诱发TD,在添加福美双第1、3、5、7天,腿部肌肉注射重组鸡GSTA3蛋白和磷酸盐缓冲液,A组与D组注射（100 μg·kg ^-1）磷酸盐缓冲液;B组与E组注射低剂量（100 μg·kg ^-1）GSTA3;C组与F组注射高剂量（200 μg·kg ^-1）GSTA3。试验历时23 d。添加福美双后1、2、4、6、10和15 d采集胫骨生长板。通过Real-time qPCR检测BAG-3基因的mRNA水平,利用免疫组化来检测BAG-3蛋白表达水平。【结果】Real-time qPCR结果显示,TD损伤修复期内,相比较于基础日粮对照组,福美双对照组肉鸡胫骨生长板中BAG-3 mRNA的表达水平基本都显著上调（P<0.05）;相比较于福美双对照组,E和F组在第2、4、10、15天都有显著差异,且在第10和15天显著低于福美双对照组（P<0.05）,表明与D组相比恢复较快。免疫组化结果表明BAG-3蛋白在肉鸡胫骨软骨细胞的增殖区和前肥大区无表达,只在肥大区细胞质中表达;福美双组与空白对照组相比,BAG-3蛋白表达增加;福美双高低剂量组与未注射蛋白的福美双组相比,重组GSTA3增加了肥大区的蛋白表达水平（第10和15天）。【结论】在福美双诱导肉鸡发生TD的过程中,GSTA3重组蛋白能够通过调控BAG-3表达参与凋亡途径,抑制细胞凋亡。在TD损伤修复期,注射GSTA3后使抗凋亡基因BAG-3蛋白表达增强,从而可参与细胞凋亡来缓解TD损伤,使得肉鸡TD生长板功能较快地恢复正常。     

猪中性粒细胞磷酸二酯酶基因表达及活性研究

 【目的】通过对猪中性粒细胞磷酸二酯酶（PDE）基因表达、活性及特异性抑制剂实验检测，研究其存在的主要PDE亚型及在体外的活性，为探讨PDE在中性粒细胞的分布、活性变化及对cAMP、cGMP调节与中性粒细胞功能关系提供依据。【方法】采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测PDE基因在猪中性粒细胞的表达，以高效液相色谱（HPLC）检测环核苷酸在PDE反应前后的含量变化，计算PDE活性。【结果】在检测的18个PDE亚型中，PDE1B、2A、3A、3B、4A、4B、4C、4D、5A、7A、7B、8A、8B、9A、11A 共15个PDE mRNA在猪中性粒细胞表达，特异性抑制剂实验表明PDE4、PDE5分别为水解cAMP、cGMP的主要PDE亚型；cAMP/cGMP-PDE在10～40 μl范围内，与其活性存在良好的线性关系（r＝0.9929/0.9992）。【结论】猪中性粒细胞至少存在15个PDE亚型，其中PDE4、PDE5为主要存在的2个亚型，PDE样品量在一定范围内与其活性存在良好的线性关系，可作为筛选PDE型中性粒细胞功能调节剂的方法。     

影响新疆野苹果种子萌发相关因素研究初报

以新疆野苹果不同单株种子为试验材料,研究了不同层积时间、去种皮和不同激素处理对新疆野苹果种子休眠与萌发的影响.结果表明:低温层积能有效地解除种子的休眠,层积75 d带皮种子发芽率达到90;以上;种皮对萌发有较强的抑制作用,层积45 d带皮种子发芽率为8;,而去皮后种子发芽率达到90;;去皮种子经赤霉素处理可明显提早发芽,低温层积30 d后经500 mg/L GA3处理发芽率较高;GA3和6-BA处理对带皮种子萌发的影响均不明显;在相同处理条件下,不同单株之间的发芽率有一定的差异.     

牛蒡子苷对小鼠原代骨骼肌细胞磷酸二酯酶活性及细胞生长的影响

 【目的】以茶碱为参照,观察中药成分牛蒡子苷对原代骨骼肌细胞磷酸二酯酶（Phosphodiesterase,PDE）活性及蛋白质合成的影响,探讨中药通过抑制PDE促进肌肉生长的作用及机理。【方法】分离1～3日龄ICR小鼠四肢肌肉用于骨骼肌原代细胞培养,在培养至第5～6天时向培养基中添加不同浓度的牛蒡子苷和茶碱,以不含牛蒡子苷和茶碱的培养基为阴性对照,继续培养24 h,采用HPLC、ELISA以及考马斯亮蓝法分别测定骨骼肌细胞cAMP PDE的活性、细胞内cAMP水平以及细胞总蛋白质合成。【结果】牛蒡子苷终浓度达到2.5 μg•ml-1、茶碱终浓度为20 μg•ml-1时均能极显著抑制原代培养骨骼肌细胞cAMP PDE的活性(P＜0.01）,显著提高细胞内cAMP水平（P＜0.05）,极显著促进肌细胞总蛋白质的合成（P＜0.01）。【结论】中药成分牛蒡子苷具有通过调节骨骼肌细胞内PDE的活性和cAMP水平,增加肌细胞蛋白质合成,促进骨骼肌细胞生长的作用。结果提示对PDE有抑制作用的中药有望成为促进动物生长的新型饲料添加剂。     

小鼠输卵管、子宫和卵巢中EGF-R mRNA表达的研究

目的 研究 ＥＧＦ－Ｒ ｍＲＮＡ在小鼠输卵管、子宫和卵巢中的表达．采用 ＲＴ－ＰＣＲ 技术检测小鼠排卵期和怀孕１～５ｄ的输卵管、子宫和卵巢中的ＥＧＲ－ＲｍＲＮＡ的表达。结果表明所研究各时期小鼠输卵管、子宫和卵巢中均有丰富的ＥＧＦ－Ｒ ｍＲＮＡ 活性,其中输卵管活性相对较弱,子宫和卵巢活性相对较强。进一步证实雌性生殖道分泌的ＥＧＦ家族生长因子对自身组织也有重要作用     

玉米杂交种“华科3A2000”选育报告

玉米新品种"华科3A2000"是以"M001"为母本、"E201"为父本育成的玉米杂交种。2年区域试验结果:平均产量12 907.0 kg/hm~2,比对照品种"先玉335"增产4.8%;生产试验结果:平均产量11 274.7 kg/hm~2,比对照品种"先玉335"增产4.0%。该品种于2014年通过吉林省农作物品种审定委员会审定。"华科3A2000"果穗筒型,穗长18.7 cm,穗行数18行,子粒黄色,百粒重38.2 g,品质好,抗病,抗倒伏,出苗至成熟127 d。适于吉林省中熟区种植。