黄瓜花叶病毒荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立检测香蕉中黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus(CMV)的实时荧光定量方法.【方法】根据CMV外壳蛋白(CP)保守序列设计了TaqMan实时荧光定量PCR特异性探针及引物,优化反应体系检测TaqMan探针实时荧光定量方法的灵敏度、特异性和重复性.【结果和结论】该方法检测灵敏度为4.2×102μL-1,比普通PCR高100倍,且与香蕉束顶病毒Banana bunchy top virus(BBTV)、香蕉线条病毒Banana streak virus(BSV)无交叉反应,特异性和重复性都较好.用实时荧光定量PCR检测14份田间香蕉样品有5份样品为阳性,进一步证明建立的实时荧光定量方法可用于香蕉CMV的检测.     

虹彩病毒蛙病毒属病毒实时荧光PCR检测方法的建立

在GenBank 中搜寻虹彩病毒蛙病毒属主衣壳蛋白(MCP)基因序列并进行多重比较后,利用其中的保守序列,设计引物和Taqman探针,建立了虹彩病毒蛙病毒属实时荧光PCR检测方法.对荧光PCR反应条件进行优化,评估该检测方法的特异性、稳定性和重复性,利用10倍系列稀释法检验其灵敏度并与常规PCR做了比较.结果显示,该方法对虹彩病毒蛙病毒属成员(新加坡石斑鱼虹彩病毒除外)的检测有高度的特异性,与淋巴囊肿病毒、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒、真鲷虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒等其他水生动物病毒之间均无交叉反应,有良好的特异性,检测总DNA灵敏度为4.5×10-3pg/μL,比传统PCR的敏感度高出100倍,可对低病毒含量的样品进行准确检测.制作的标准曲线有极好的线性关系,且线性范围宽,相关系数为0.998 4.组内和组间重复试验的Ct值标准偏差分别为1.2%和1.6%,有良好的重复性.与常规的PCR相比较,该方法具有快速、特异、敏感、可定量、可同时检测大量样品等优点,可用于出入境检疫和动物防疫监督部门对虹彩病毒蛙病毒属的疫情监测.     

喀斯特炭疽菌TaqMan探针实时荧光PCR检测方法的建立

为寻求喀斯特炭疽菌的快速检测方法,利用TaqMan探针实时荧光定量PCR技术,以喀斯特炭疽菌基因组中的ACT基因为靶序列设计并筛选特异性引物探针,通过特异性、灵敏度、重复性试验建立喀斯特炭疽菌TaqMan探针实时荧光PCR检测方法。结果表明:建立方法的特异性较强、灵敏度较高、重复性稳定性较好,最低检测限为0.2pg DNA/反应,标准曲线的线性关系良好,相关系数为0.998。该方法操作简便,可用于进出境口岸喀斯特炭疽菌的检疫。     

猪传染性胃肠炎病毒SYBR-Green I荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立猪传染性胃肠炎病毒SYBR-Green I荧光定量PCR检测方法,利用RT-PCR技术扩增出猪传染性胃肠炎病毒N基因中324 bp的片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,纯化的质粒作为模板进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量PCR检测方法.该方法检测灵敏度可达5×101拷贝数.μL-1,与猪伪狂犬病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒均不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性.结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床TGEVN基因的检测.     

非洲猪瘟病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)快速、敏感的检测方法,根据GenBank中登录的中国流行株ASFV-SY18的P72基因,建立了SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,并对所建立方法的灵敏性、特异性与重复性进行了验证。结果显示,所建立的非洲猪瘟病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法能有效扩增1.0～1.0×10~9 copies·μL~(-1)的ASFV标准质粒,建立的标准曲线呈现良好的线性关系;检测灵敏度为1.0 copies·μL~(-1);对猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒等病原不发生交叉反应,具有很好的特异性;重复性试验结果显示变异系数小于1%,重复性良好。     

猪伪狂犬病毒SYBR-GreenⅠ实时定量PCR检测方法的建立

利用PCR技术扩增出猪伪狂犬病毒gH基因中187 bp的片段,并克隆到pGEM T栽体上,纯化的质粒作为PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释质粒为标准模板,进行SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线.建立了猪伪狂犬病毒的荧光定量PCR检测方法.该方法检测灵敏度可达1.26×102拷贝·μL-1,与猪圆环病毒,猪细小病毒,猪繁殖与呼吸综合征病毒,猪瘟病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;对15份疑似病料进行了检测.发现均为荧光定量PCR阳性,而常规PCR只能检测出6份阳性.结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PRV感染的检测.     

五倍子蜂蜜TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

为五倍子蜂蜜的鉴定检测提供技术支撑,利用TaqMan探针实时荧光定量PCR技术,以五倍子树基因组中ITS基因为靶序列,设计并筛选出特异性引物探针,通过特异性、灵敏度和重复性等试验,建立五倍子蜂蜜TaqMan探针实时荧光PCR检测方法。结果表明:建立的方法特异性良好,生成的标准曲线有良好的线性关系,相关系数(R2)为0.998,最低检测限为0.2pg DNA/反应。该方法特异性强、灵敏度高、结果可靠。     

牛病毒性腹泻病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

本研究旨在建立一种灵敏度高、特异性强、重复性好,能快速检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的方法。根据BVDV的E2基因保守序列,设计合成一对特异性引物,建立了检测BVDV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。将标准阳性样品10倍梯度稀释检测灵敏度,用能感染奶牛的其它病毒做对照检测特异性,用临床样本检测重复性。结果表明,该方法与能感染奶牛的其它几种病毒均无交叉反应,检出敏感度达4.87×10~1 copies/μL,比常规PCR检测方法高10倍。同时检测了5个规模化奶牛场送检的67份奶牛腹泻样本,其BVDV检出率为46.27%(31/67)。本研究成功建立了BVDV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,为BVDV的快速诊断和定量分析提供了技术支撑,具有很好的应用前景。     

斑点叉尾鮰肠败血症PCR诊断方法的建立

为了建立快速、敏感的聚合酶链式反应(PCR)诊断斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus的肠败血症技术,作者根据NCBI公布的鮰爱德华氏细菌序列,设计了一对特异性诊断引物CM3/CM4,对鮰爱德华氏细菌特异基因片段进行PCR扩增试验,PCR反应条件的优化以及不同检测材料的比较,同时测试了该方法的特异性和敏感性,并对广西4个市县临床样品进行了检测.结果表明:用该引物可以扩增到与预计大小相符的276 bp鮰爱德华氏菌特异性片段;PCR反应与Ⅰ型荧光假单胞菌、点状产气单胞菌点状亚种、鳗弧菌、温和气单胞菌、肠型点状产气单胞菌、柱状黄杆菌、嗜水气单胞菌、河弧菌、迟缓爱德华氏菌及海豚链球菌无交叉反应;用该PCR法可以检测出病鱼脑、肝、肾及脾中的病原菌,检测的最低细菌数为12个,且病鱼内脏组织、菌落及菌液均可直接用于该PCR扩增;临床菌株检测结果与基于菌株16S rRNA基因序列系统进化分析和生化鉴定结果一致.因此,本试验中所建立的PCR检测方法在斑点叉尾鮰肠败血症的诊断和防治方面具有较好的应用前景.     

猪传染性胃肠炎病毒TaqMan荧光定量PCR方法的建立及在疫苗评价中的应用(英文)

[目的]建立检测猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的TaqMan荧光定量PCR方法。[方法]根据TGEV基因组中保守的N基因序列设计引物和探针,以梯度稀释的含有N基因的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。[结果]该试验建立的荧光定量PCR方法在102~1010拷贝/μl之间具有良好的线性关系,相关系数达到0.99以上,扩增效率在90%~110%之间。该方法的检测灵敏度为10拷贝,敏感性较高,而且特异性较好,与猪的其他病毒核酸均无交叉反应;批内和批间的变异系数低于3%,表明该方法的重复性较好。应用该方法可以对疫苗的免疫效力进行定量检测和评价,也可以对临床病料进行检测。[结论]该研究建立的荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性好,可为TGEV的流行病学调查、疫苗开发和发病机制等研究提供可靠的工具。     

Dot-Blot Hybridization for Detection of Five Cucurbit Viruses by Digoxigenin-Labelled cDNA Probes

Dot-blot hybridization was applied in this paper to detect five viruses infecting cucurbitaceous crops,Zuccini yellow mosaic virus(ZYMV),Watermelon mosaic virus(WMV),Cucumber mosaic virus(CMV),Papaya ringspot virus watermelon strain(PRSV-W)and Squash mosaic virus(SqMV),as a good alternative assay in seed health test and epidemiological and transgenic research.Digoxigenin-labelled cDNA probes of the five viruses were synthesized by PCR with the specific primers and applied in dot-blot hybridization to detect five viruses in crude extraction of the infected leaves.And three SqMV probes of different lengths(0.55,1.6,and 2.7 kb,respectively)were designed to investigate the effect of hybridization.The results showed that the sensitivity for detecting the crude extraction of infected leaves by ZYMV,WMV,CMV,PRSV-W,and SqMV was down to 1160,1160,1320,1160,and 1320,respectively.Three SqMV probes of different length showed no differences on the sensitivity and specificity.The digoxigenin-labelled probes prepared by PCR could be used for accurate and rapid identification of 5 viruses infecting cucurbitaceous crops with good stabilities,sensitivities,specificity,and reproducibilities.     

鸡3种主要DNA病毒多重感染复合PCR检测方法的建立

依据Gen Bank中注册的鸡马立克氏病病毒(MDV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸡痘病毒(FPV)基因组核苷酸序列中的保守序列设计引物,3种病毒各设计3对引物,共计9对引物,经生物学软件筛选后,得到3对相互匹配较佳的引物。3对匹配引物经单一PCR验证后,优化复合PCR反应条件,确定最佳的退火温度、引物浓度和Taq DNA聚合酶浓度;经特异性、敏感性试验及简化PCR试验,建立简易复合PCR检测方法。复合PCR扩增出的3条带大小与预期一致,即228 bp(MDV)、400 bp(ILTV)、499 bp(FPV);建立的复合PCR方法能同时检测出100 fg MDV、ILTV、FPV的DNA。同时依据PCR技术原理,将经典的三温热循环改进为二温热循环试验,即将退火和延伸合并为一步(62℃),缩短了反应时间。建立的3种病毒的复合PCR检测方法具有较高的特异性和敏感性,可以用于临床病料的快速诊断。     

多重实时定量PCR快速检测PRRSV、CSFV和PCV2混合感染方法的建立

根据TaqMan复合荧光探针设计原则,应用Primer 5.0和Oligo 6.0软件设计检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的特异性引物和探针,优化反应条件,建立了检测PRRSV、CSFV和PCV2的单项和多重Real-time PCR方法。结果表明,建立的方法具有高度特异性,与其他病原检测无明显交叉反应;对阳性质粒和病毒的最低检测量分别为<101个拷贝和<1TCID50/反应,检测灵敏度比常规PCR检测高100倍。通过对20份临床样本进行检测,多重Real-time PCR检测结果和单项Real-time PCR检测结果一致。建立的多重Real-time PCR方法可用于同时快速检测PRRSV、CSF和PCV2的混合感染,具有灵敏、特异、重复性好并能对样品进行定量检测等优点。     

建立环介导间接PCR同时检测3种主要猪源性病毒

 【目的】建立同时检测猪圆环病毒2型（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的环介导间接PCR方法,实现3种病毒快速检测。【方法】根据GenBank数据库中猪圆环病毒2型（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的核苷酸序列设计3对特异性探针,利用PCR技术分别标记于大豆Lectin基因片段的两端形成3种不同的报告基因,此标记的报告基因与3种待测靶标基因经杂交、缺口补平、环化后,采用1对引物反向PCR扩增报告基因,建立了PCV2、CSFV和PRRSV的环介导间接PCR检测方法,扩增片段大小分别为564 bp、434 bp和338 bp,该方法即可用于单病毒检测又可用于多病毒检测。【结果】灵敏度和特异性试验结果表明,无论是单病毒检测还是多病毒检测,该法都具有高度特异性,与其它病原检测无明显交叉反应;对PCV2、CSFV和PRRSV 3种病毒同时检测的底限分别为0.8、25和6.2 pg•μL-1,和单个病毒的检测灵敏度相同。利用环介导间接PCR和常规PCR对20份临床样本进行比较检测,结果表明,无论单病毒检测还是多病毒检测,其结果均与常规PCR检测结果完全一致。【结论】环介导间接PCR检测技术可用于PCV2、CSFV和PRRSV 3种病毒的同时检测,是一种简便快速、灵敏、特异的病原学诊断工具。     

TaqMan-LNA探针荧光定量PCR快速检测对虾

【目的】建立快速、特异、灵敏检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）的TaqMan-LNA探针荧光定量PCR方法,为IHHNV的临床诊断和疫情监测提供更简便的检测技术。【方法】根据GenBank已发表的IHHNV毒株序列,在IHHNV保守区序列设计特异性引物和TaqMan-LNA探针;对荧光定量PCR反应条件进行优化以缩短检测时间,提高特异性和灵敏度;应用TaqMan-LNA探针荧光定量PCR对广西地区的300份凡纳滨对虾样品进行检测,验证方法的实用性。【结果】TaqMan-LNA探针荧光定量PCR检测IHHNV的灵敏度高,约为10个病毒粒子/反应,定量范围宽,在1.6×101～1.6×108拷贝/μL的范围内具良好的线性关系;与SPF凡纳滨对虾组织、WSSV、副溶血弧菌的DNA和TSV的RNA均无反应,特异性好;组内变异系数为0.53%～1.75%,组间变异系数为0.81%～1.14%,重复性和重现性均较好,结果稳定可靠;临床应用结果表明,300份凡纳滨对虾样品检出193份阳性,阳性率为64.3%,表明广西沿海地区养殖的凡纳滨对虾IHHNV感染率较高。【结论】利用TaqMan-LNA探针建立检测IHHNV的荧光定量PCR方法具有快速、特异、灵敏、重复性好、能定量等优点,可用于对虾IHHNV的检测。     

8种猪呼吸道和繁殖障碍病病原体GeXP检测方法的建立

【目的】建立了一种同时鉴别H1、H3亚型猪流感、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪瘟、猪日本乙型脑炎、猪圆环病毒病、猪细小病毒病和猪伪狂犬病8种病毒性呼吸道和繁殖障碍病病原体的GeXP 高通量检测方法。【方法】根据这8种病原体的基因保守序列,设计并合成了9对特异性引物, 在每对特异性引物的5′端均加上一段通用引物,形成特异性嵌合引物。运用GeXP单重PCR方法,以单一病毒cDNA/DNA为模板验证引物的可行性;建立GeXP多重PCR方法,以单一病毒cDNA/DNA模板、阳性cDNA/DNA混合模板验证GeXP多重检测体系的特异性和准确性;将含猪圆环病毒、猪细小病毒和猪伪狂犬病病毒靶基因的克隆质粒及体外转录的RNA（H1、H3亚型猪流感、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪瘟、猪日本乙型脑炎）分别梯度稀释为10³,10²,10¹拷贝/µL,运用GeXP多重PCR方法进行单一病原体灵敏度分析;根据单一病原体的灵敏度分析结果,优化各对特异性嵌合引物的工作浓度,将含有体外转录好的6种RNA模板和3种克隆质粒等量混合,将混合物梯度稀释为10⁴,10³,10²,10¹拷贝/µL,运用GeXP多重PCR方法分析同时检测8种病原体的灵敏度。运用建立好的GeXP多重检测体系对23份临床样品进行检测,并与常规单重PCR进行比较,对该GeXP多重检测体系的临床应用进行评价。【结果】基于GeXP系统的单重PCR检测体系和GeXP多重PCR检测体系均能扩增出特异性片段,验证了引物的可行性、GeXP多重检测体系的特异性和准确性;GeXP多重检测体系的单一病原模板灵敏度分析结果显示,多重检测体系对单一病原体检测的下限均为10¹拷贝/µL;GeXP多重检测体系在8种病原体同时检测的灵敏度分析结果显示,多重检测体系可在10³拷贝/µL水平可同时检测到8种病原体;比较GeXP多重PCR检测方法和常规PCR方法对临床样品的检测结果,两种检测方法的检测结果相符。【结论】成功建立了基于GeXP系统的多重PCR检测体系,可以同时检测8种猪呼吸道和繁殖障碍性疾病病原体;本研究建立的同时鉴别8种猪呼吸道和繁殖障碍性疾病病原体的GeXP检测方法具有高通量、特异性强和灵敏度高的特点,为猪病毒性呼吸道和繁殖障碍性疾病的分子诊断提供了新型的检测方法。     

猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

参照GenBank收录的猪圆环病毒2型(PCV2)基因组全序列选择保守区域设计合成了引物及其探针,并对其进行了筛选;对荧光定量PCR的反应条件进行了优化,建立了TaqM an荧光定量PCR检测方法.用建立的检测方法对临床采集的组织病料进行了检测,并与常规PCR检测方法作比较.结果显示,所建立的方法灵敏度可达3×101拷贝.μL-1,比常规PCR检测方法灵敏度高10倍,而与猪圆环病毒1型(PCV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)没有交叉反应,具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点,适合于PCV2的流行病学调查和临床诊断.     

猪繁殖与呼吸综合征RT-PCR诊断方法的建立

为建立一种方便快捷的检测猪繁殖与呼吸综合征的RT-PCR方法,根据GenBank中已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因设计一对引物,并以合成的cDNA为模板,初步建立了检测猪繁殖与呼吸综合征的RT-PCR方法,进而对对照病毒及采集的病料组织进行了特异性、敏感性和重复性检测。结果显示,该研究建立的RT-PCR方法敏感性高,最低检测阈为10 TCID50/mL,扩增产物的特异性良好,重复性良好,可用于猪繁殖与呼吸综合征的临床诊断及流行病学调查。     

A novel real-time RT-PCR with TaqM an-MGB probes and its application in detecting BVDV infections in dairy farms

A real-time RT-PCR assay using Taq Man-MGB probes was developed to detect and type the bovine viral diarrhea virus(BVDV) in cattle.Universal primers and Taq Man-MGB probes were designed from the 5′-untranslated region of known pestiviral sequences.Prior to optimizing the assay, c RNAs were transcribed in vitro from the BVDV 1 and BVDV 2 RTPCR products to make standard curves.The detection limit of the assay was 1.72×102 copies for BVDV 1 and 2.14×102copies for BVDV 2.The specificity of the assay evaluated on several BVDV strains including bovine herpesvirus 1(BHV 1), foot and mouth disease virus(FMDV) and several classical swine fever virus(CSFV) strains showed specific detection of the positive virus over 40 cycles.The assay was highly reproducible with the coefficient of variance ranging from 1.04 to 1.33% for BVDV 1 and from 0.83 to 1.48% for BVDV 2, respectively.Using this method, we tested a total of 2 327 cattle from three dairy farms for the presence of BVDV persistently infected(PI) animals.In this assay, each RT-PCR template contained a mixture of ten samples from different animals.The occurrence rate of PI cattle in three farms ranging from 0.9 to 2.54% could represent partly the PI rates in cattle farm in China.In conclusion, using our real-time PCR assay, we could effectively detect and type BVDV and identify PI cattle in a rapid and cost-effective manner.     

禽白血病病毒多重PCR检测法的建立及初步应用

根据GenBank中登录的禽白血病病毒A、B、J亚群的核苷酸序列设计合成了3对引物,各对引物可分别扩增出大小约为195、260、924bp的核苷酸片段;经优化建立禽白血病病毒多重PCR检测法,并进行其敏感性试验及对马立克病病毒(MDV)、火鸡疱疹病毒(HVT)、新城疫病毒(NDV)、传染性囊病病毒(IBDV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性支气管炎病毒(IBV)和DF-1细胞基因组的特异性试验;应用该方法对1 294份临床样品进行禽白血病病毒检测,对阳性检出样品抽样进行测序鉴定.结果表明:该方法的最小检出拷贝数为103,特异性试验均为阴性,检出临床样品中的核苷酸片段与参考毒株核苷酸序列的同源性达98%以上,符合率100%,具有良好的特异性、敏感性和符合率,可为禽白血病病毒感染的临床诊断及流行病学调查研究提供有效借鉴.