环形泰勒虫suAT1基因的克隆及序列分析

以环形泰勒虫兰州株基因组为模板,经PCR扩增获得了suATI的部分基因,将该基因克隆到pMD20-T载体,对重组质粒进行PCR和双酶切鉴定及序列测定.结果表明:该基因的长度为1 377bp,编码了459个氨基酸.同源性分析结果显示:克隆序列与CenBank收录的环形泰勒虫参考核苷酸序列同源性为98.35%,氨基酸同源性...     

牛双芽巴贝斯虫rap-1基因的克隆与序列分析

对牛双芽巴贝斯虫(Babesia bigemina)潜在药物靶标Rap-1的基因进行克隆与序列分析.以兰州株牛双芽巴贝斯虫基因组为模板,经PCR扩增获得了rap -1基因,将该基因克隆到pGEM-T Easy Vector上,对重组质粒进行PCR扩增,对目的基因进行酶切鉴定及序列测定分析.结果表明,rap -1基因长度为846 bp,同源性分析结果显示,克隆序列与GenBank收录的巴西株牛双芽巴贝斯虫的核苷酸序列同源性为99.74％,说明兰州株牛双芽巴贝斯虫的rap-1与GenBank公布的参考基因具有高度同源性,rap-1基因具有很高的保守性.     

三株猪2型圆环病毒甘肃分离株的全基因组序列分析

根据GenBank中发表的猪2型圆环病毒(PCV2)全基因组序列,设计合成了2对引物,采用PCR方法对来自甘肃不同猪场的3份病料中的PCV2进行基因的扩增、克隆和测序,得到全基因组长度为1 768 bp的PCV2Ww株(登录号DQ322701)以及全基因组长度为1 767 bp的PCV2 LZ株和TS株(登录号DQ363860和DQ355153).应用DNAstar软件序列分析可得,3个分离株全基因组与国内外参考毒株核苷酸序列同源性在94.8%~99.4%,3个分离株之间的核苷酸序列同源性为96.4%~99.4%;PCV2分离株与PCV1分离株核苷酸序列同源性为69.0%~70.0%;ORF1和ORF2所编码的氨基酸序列与国内外PCV2毒株比较,同源性也很高,分别为99.0%~99.4%和92.7%~98.7%.进化树分析表明,PCV2分离毒株在进化上存在地域上的相关性.     

马巴贝斯虫18S rRNA基因吉林省分离株的序列分析

为分析马巴贝斯虫吉林省分离株的18S rRNA基因序列，根据马巴贝斯虫18S rRNA基因序列设计1对引物，对吉林省的马匹血液基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物进行克隆、测序，扩增出大小为435bp的马巴贝斯虫18S rRNA基因片段．序列分析显示，马巴贝斯虫吉林省分离株与南非株同源性最高，为98．4％．     

1株猪圆环病毒3型全基因组克隆与序列分析

【目的】克隆获得1株猪圆环病毒3型(PCV3)全基因组序列并进行序列分析。【方法】以PCV3阳性临床样品为模板,用PCR技术扩增PCV3全基因组片段,随后进行克隆、序列测定与分析。【结果】扩增出1株PCV3全基因组片段,序列测定结果显示,这株PCV3全基因组大小为2 000bp,与其他国内外14株PCV3的核苷酸同源性均达98.6%以上,表明获得1株PCV3全基因组序列,且不同PCV3之间的全基因组核苷酸有非常高的同源性。PCV3与PCV1、PCV2之间的全基因组核苷酸同源性都低于50%。系统发育显示,3种PCV分别处于明显不同的分支,表明各自属于不同的基因型。【结论】获得1株PCV3全基因组序列,其与其他PCV3毒株之间的核苷酸同源性很高。     

基于rDNA ITS-1序列酿酒酵母的系统分类学研究

为了准确快速地为酵母生产提供优良菌株,采用核糖体DNA ITS-1(Internal transcribed spacer 1)序列分析法,对27株酵母菌(其中24株为酿酒酵母属中的酿酒酵母(S.cerevisiae),其他3株分别为汉逊酵母属中的多形酵母(H.polymorph)、克鲁维酵母属中的乳清酵母(K.marxianus)和红酵母属中的粘质酵母(R.mucilaginosa))进行了系统分类学研究,提取这27株酵母菌的基因组DNA并进行PCR扩增,采用琼脂糖和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,能将酵母菌株鉴定到属的水平;对PCR扩增序列进行克隆和测序,结果表明大多数酿酒酵母菌株之间的ITS-1序列有差异,主要表现在序列中的一段Ploy-T上,最少的有7个T,最多的有13个T。研究还用Phylip 3.6等DNA序列分析软件对不同ITS-1序列的菌株进行了系统发育分析,确定出不同菌株之间的亲缘关系,并纠正了长期认为是酿酒酵母的两株酵母菌。     

1株猪圆环病毒3型全基因组克隆与序列分析

【目的】克隆获得1株猪圆环病毒3型(PCV3)全基因组序列并进行序列分析.【方法】以PCV3阳性临床样品为模板,用PCR技术扩增PCV3全基因组片段,随后进行克隆、序列测定与分析.【结果】扩增出1株PCV3全基因组片段,序列测定结果显示,这株PCV3全基因组大小为2000bp,与其他国内外14株PCV3的核苷酸同源性均达98.6%以上,表明获得1株PCV3全基因组序列,且不同PCV3之间的全基因组核苷酸有非常高的同源性.PCV3与PCV1、PCV2之间的全基因组核苷酸同源性都低于50%.系统发育显示,3种PCV分别处于明显不同的分支,表明各自属于不同的基因型.【结论】获得1株PCV3全基因组序列,其与其他PCV3毒株之间的核苷酸同源性很高.     

1株猪圆环病毒3型全基因组克隆与序列分析

【目的】克隆获得1株猪圆环病毒3型(PCV3)全基因组序列并进行序列分析.【方法】以PCV3阳性临床样品为模板,用PCR技术扩增PCV3全基因组片段,随后进行克隆、序列测定与分析.【结果】扩增出1株PCV3全基因组片段,序列测定结果显示,这株PCV3全基因组大小为2000bp,与其他国内外14株PCV3的核苷酸同源性均达98.6%以上,表明获得1株PCV3全基因组序列,且不同PCV3之间的全基因组核苷酸有非常高的同源性.PCV3与PCV1、PCV2之间的全基因组核苷酸同源性都低于50%.系统发育显示,3种PCV分别处于明显不同的分支,表明各自属于不同的基因型.【结论】获得1株PCV3全基因组序列,其与其他PCV3毒株之间的核苷酸同源性很高.     

2株猪圆环病毒2型的分离鉴定及全基因组序列分析

【目的】对河南部分地区疑似猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染猪进行病毒分离鉴定,并对分离株的全基因组序列进行分析。【方法】对郑州、焦作两地疑似PCV2感染的猪淋巴结、脾脏和肺脏组织进行PCR检测,对检测为阳性的病料进行PCV2的分离,利用间接免疫荧光试验和PCR扩增进行初步鉴定。用PCR扩增PCV2全基因,经克隆、测序后,用MEGA5.1软件对克隆的序列与GenBank上获取的其他PCV2全基因组进行序列比对。【结果】分离到2株病毒,分别命名为ZHENGZ-12株和JIAOZ-12株。间接免疫荧光试验结果显示,感染病毒的细胞出现了特异的亮绿色荧光。2个分离株全基因组长度均为1 767bp,与国内外PCV2参考毒株核苷酸序列同源性为92.6%~99.9%,2个毒株之间的核苷酸序列同源性为96.0%,与PCV1核苷酸序列同源性分别为74.6%和77.7%。系统进化树分析结果显示,2个PCV2分离株同国内外分离株的亲缘关系很近;PCV2核苷酸序列比较稳定,其进化不存在明显的地域相关性。【结论】初步证实分离病毒为PCV2,ZHENGZ-12株基因型为PCV-2a,JIAOZ-12株基因型为PCV-2b。     

猪细小病毒YL株序列分析及其 VP2基因原核表达

为对猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)进行分子生物学研究,将该病毒YL株基因组分为4个重叠片段进行PCR扩增,并将扩增产物克隆到pGEM-T载体中,测定病毒基因组全长序列。另外,应用其中1对引物,通过PCR方法扩增出一段包含VP2主要抗原区域的片段,构建重组质粒pET-VP2,IPTG诱导表达。序列分析结果表明,PPV YL株和国内外PPV分离毒株NS1基因核苷酸同源性为97.8%～99.4%,氨基酸同源性为96.7%～99.5%,与国内外主要毒株VP2基因核苷酸同源性为98.7%～99.7%,氨基酸同源性为97.4%～99.8%。进化树分析表明,PPV YL株与BQ株(EU790641)毒株处在同一分支上,遗传距离最近。SDS-PAGE结果显示,表达产物分子质量为56ku,经Western blotting检测具有生物学活性。     

3株鸽源新城疫病毒陕西分离株F基因的克隆与序列分析

对3株鸽源性新城疫病毒F基因进行扩增和序列分析,探讨分离毒株相互之间以及与疫苗毒之间的遗传进化关系.采集病料,通过非免疫鸡胚接毒传代分离病毒,HA及HI试验鉴定其为ND病毒;设计特异性引物,RT-PCR扩增分离ND病毒F 基因的重要功能区片段(1 395 bp),并对其进行克隆、测序及序列分析.结果表明:3株鸽源NDV陕西分离株相互之间F 基因核苷酸序列的同源性在98.0%～99.3%,氨基酸序列同源性为98.5%～99.1%;其F 基因裂解位点的氨基酸组成与NDV 强毒株的特征性结构(112 R-R-Q-K-R-F117 )一致.系统发育进化树表明,此3 株强毒株与某贵州分离株(登录号:EF589137) 高度同源,处于进化树的同一分支,属于基因Ⅵ型.分离到的3株鸽源NDV之间同源性较高,鸡胚病变和序列分析表明其为强毒,与传统的La Sota,B1等疫苗株同源性很低.     

国内病猪中猪链球菌2型分离株溶血素基因的PCR检测及序列分析

以探明猪链球菌2型(SS2)国内病猪分离株的溶血素基因(sly)的分布情况及其序列为目的.通过聚合酶链反应(PCR)方法检测29株不同年代、不同地区SS2国内分离株的sly,并将其中的5株(SS2-1、HA9801、HA0507、JR0507和ZY05719)sly 进行克隆及序列分析.结果显示:29株菌都有sly,其中5株菌的sly的ORF的碱基数目都为1 494 bp、编码497个氨基酸,核苷酸序列的同源性为99.7%～100.O%,所推导的蛋白质序列的同源性为99.8%～100.O%,其中SS2-1、HA9801、HA0507、JR0507与国外参考株P1/7的序列完全一致.表明中国猪链球菌2型病猪分离株普遍具有sly,且基因序列极为保守.     

郑州市山羊隐孢子虫感染情况调查与分析

为了对郑州市山羊隐孢子虫感染情况进行初步了解并分析虫株的种类和遗传进化关系,应用饱和蔗糖漂浮法对郑州市不同县市采集的276份山羊粪便样品进行山羊隐孢子虫感染情况检测,并应用PCR扩增部分阳性样品的核糖体18S rRNA基因序列,对获得的基因序列进行分析,确定所获得的隐孢子虫分离株的种类和遗传进化关系。结果表明,郑州市山羊隐孢子虫感染率为3.26%。序列比对和遗传进化分析表明,获得的9个山羊隐孢子虫分离株核糖体18S rRNA基因序列同源性为97.4%～99.9%,与已知牛隐孢子虫(Cryptosporidium bovis)分离株的同源性超过98.8%,且分离株与牛隐孢子虫属于同一大分支,与其他虫株所属分支相隔较远,表明获得的9个山羊隐孢子虫分离株均为牛隐孢子虫。综上,郑州市存在山羊隐孢子虫病的流行情况,均为牛隐孢子虫感染,会对人畜健康造成较大的威胁,亟须制定并实施相应的防控措施。     

卡氏住白细胞虫rDNA ITS-2的POR扩增与测序

运用PCR方法扩增了卡氏住白细胞虫rDNA的ITS-2及部分5．8S和28S序列(ITS2 )，并对该序列进行了克隆和测序。采用巨型裂殖体为材料，并根据Saccharomyces cerevisiae rDNA中的5．8S、28S保守序列所设计的通用引物ITS3、ITS4，进行了虫体ITS2 的PCR扩增，将所扩增片段纯化后成功地克隆于pGEM-T easy和PMDl8-T载体的T-T窗口。经双向自动测序显示，该ITS2 片段的大小为270bp；经NCBI Blast联机检索，结果显示，所扩片段中5．8S序列与S．cerevisiae的5．8S序列有部分相同，而ITS-2序列为虫体所特有；同时经wDNA-SIS软件分析，显示该ITS-2序列与S．cerevisiae间同源性相对较远，而与柔嫩艾美耳球虫间同源性相对较近，故而本试验中所测序列为卡氏住白细胞虫的ITS-2特有序列。     

黄鳝胃瘤线虫ITS及5.8SrDNA的克隆及序列分析

为了解渝西地区黄鳝胃瘤线虫的rDNA内转录间隔区(ITS)及5.8SrDNA 序列的遗传变异情况,本研究利 用PCR扩增胃瘤线虫rDNA的片段,将目的片段克隆至pMDTM19-T Vector载体,对阳性克隆进行测序,序列用 BLAST和MEGA4.0进行相似性和种系发育分析.结果表明6株胃瘤线虫分离株扩增的序列总长存在差异(890~ 892bp),其中ITS-1序列长度为350~351bp、5.8S序列长度为102~103bp及ITS-2序列长度为343bp.渝西地 区胃瘤线虫ITS序列与不同宿主胃瘤线虫的相似性最高为98.3%,表明ITS可作为分子标记用于胃瘤线虫与其他 线虫的种间鉴定.     

安氏隐孢子虫ITS-1基因PCR检测方法的建立

[目的]建立针对安氏隐孢子虫的PCR快速检测方法,为安氏隐孢子虫的检测和分子流行病学调查提供技术支撑.[方法]根据GenBank中安氏隐孢子虫的ITS-1基因序列设计1对特异性引物,建立基于ITS-1基因的PCR方法,并通过特异性试验、敏感性试验、临床检测以及与经典巢式PCR检测方法进行比较等,验证其可行性.[结果]基于ITS-1基因的PCR检测方法能扩增出安氏隐孢子虫的特异条带,而对猪源隐孢子虫、贝氏隐孢子虫、微小隐孢子虫、牛泰勒氏虫、牛巴贝斯虫、伊氏锥虫、食道口线虫的扩增结果均为阴性;将测序结果进行BLAST比对,发现其与GenBank中安氏隐孢子虫的同源性均在99%以上.敏感性最低可检测每克牛粪中5个卵囊;用于检测广西不同地区的1613份牛粪样品时,与经典巢式PCR检测方法相比,发现两者的阳性检出率均为11.72%,且吻合率达100%.[结论]安氏隐孢子虫ITS-i基因PCR检测方法具有快速、敏感、特异的特点,适用于安氏隐孢子虫的检测和分子流行病学调查分析.     

海南黑山羊鞭虫rDNA-ITS片段的克隆及序列分析

采用寄生线虫通用引物NC5和NC2,对海南黑山羊鞭虫rDNA的ITS序列进行PCR扩增,将扩增片段纯化后克隆至pEASY-T1载体。用PCR及酶切进行鉴定,对阳性菌落质粒DNA进行测序分析。结果表明,扩增的黑山羊鞭虫ITS片段大小为1 113 bp,包含部分的18S、28S及全部的ITS1(470 bp)、5.8S(158bp)和ITS2(392 bp)序列,ITS1和ITS2与GenBank已登录的Trichuris skrjabini(Baskakov)同源性分别达到90%和99%,与T.leporis(Froelich)同源性均为84%,而与其他科线虫同源性均较低。由ITS1和ITS2序列构建的系统进化树可知,从海南黑山羊盲肠中分离到的鞭虫ITS1和ITS2均与T.skrjabini处于同一分支。研究结果为海南黑山羊盲肠鞭虫种属的确定及进一步分子生物学研究奠定基础。     

禽传染性支气管炎病毒纤突蛋白S_1基因的RFLP与序列比较分析

利用反转录一套式聚合酶链式反应技术从北京地区禽传染性支气管炎病毒(IBV)分离株 BJ_1、BJ_2、BJ_3株中成功扩增出1054bp 纤突蛋白高变区。利用限制性内切酶 Sin Ⅰ和 Pst Ⅰ的酶切分析证实了RT-nested PCR 的特异性,结合计算机酶切位点分析图谱进行理论 RFLP 分析。将三段 S_1基因分别克隆到pUC19质粒中,获得重组质粒 pUC IBV S_1-BJ_1、pUC IBV S_1-BJ_2、pUC IBV S_1-BJ_3。利用双脱氧链终止法对三个重组质粒进行双向测序,获得三株分离株 S_1基因高变区的序列。将得到的三个序列与标准株 M_(41),Beaudette 株和疫苗株 H_(120)及广东地方分离株 D_(41)株进行核酸序列同源性比较分析。结果表明,三株分离株核酸碱基序列和氨基酸序列与 M_(41)株的同源性比与 H_(120)株和 Beandette 株的同源性高。本研究对于进一步深入探讨禽传染性支气管炎病毒(IBV)分子变异机制研究奠定了良好的基础。     

大肠杆菌F18菌毛A亚单位基因(fedA)的克隆与序列测定

利用PCR技术 ,分别从产F18ab菌毛的猪水肿病大肠杆菌分离株G及产F18ac菌毛的大肠杆菌 8813株中扩增出 5 10bp左右的F18菌毛A亚单位基因 (fedA)。将这 2个PCR扩增产物按预定阅读框架克隆入pGEX 6p 1载体的谷胱甘肽S 转移酶 (GST)基因的下游 ,筛选获得阳性重组质粒 ,并对质粒中的插入序列进行测定。序列分析表明 :F18ab与F18ac的fedA基因的核苷酸序列同源性为 97.6 % ,推导的氨基酸序列同源性为 94.7% ,两者的主要区别在于F18acfedA基因的第 36 3bp处比F18ab多 3个核苷酸 ,并出现一个新的酶切位点 (NgoMI)     

鹅副粘病毒GX1株的HN和F蛋白基因的克隆和序列分析

[目的]克隆鹅副粘病毒GX1株HN基因与F基因,并进行序列分析。[方法]根据Genbank已发表的鹅副粘病毒GPV-SF02株基因组核苷酸序列设计2对引物,对从广西发病鹅分离到的鹅副粘病毒毒GX1株的HN和F基因进行PCR扩增,将扩增产物与pMD18-T载体连接并测序。[结果]该株副粘病毒株的HN基因和F基因核苷酸序列全长分别为1 716和1 662 bp,与GPV-SF02株的同源性均在97.3%左右,与LaSota株、F48E9株、JS株的同源性为80.3%~97.5%,与M iyadera株的同源性仅84.8%。[结论]分离株GX1株与禽Ⅰ型副粘病毒(A PMV-1)强毒株特征相符,属于A PMV-1基因Ⅶ型。