五步蛇源隐孢子虫分离株的分子鉴定

【目的】采用分子生物学方法鉴定1个五步蛇(Deinagkistrodon acutus)源隐孢子虫分离株,了解中国蛇隐孢子虫感染的种类分布。【方法】利用巢式PCR方法,扩增隐孢子虫18S rRNA基因特异性片段,对PCR产物进行限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)和同源性分析,构建其种系发育进化树。【结果】成功扩增出18S rRNA基因目的片段,PCR产物经SspⅠ酶消化后获得的酶切结果和先前报道的蛇隐孢子虫(Cryptosporidium serpentis)一致。获得的840 bp 18S rRNA基因序列与C.serpentis同源性达到99.8%。种系发育进化树分析表明,该分离株与C.serpentis位于同一分支,节点支持值达100%。【结论】本研究获得的五步蛇源隐孢子虫分离株为C.serpentis,说明C.serpentis有更宽的感染宿主范围。     

吕氏泰勒虫与尤氏泰勒虫形态学、标签基因选择及其遗传进化分析

为比较吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫形态学及选择合适基因标签，以期探究它们间的遗传进化关系。借助光学显微镜观察2种泰勒虫的形态结构；利用PCR技术分别扩增了吕氏泰勒虫与尤氏泰勒虫的cox1、18S rRNA及28S rRNA等3个标签基因的部分序列，分别比对它们相应基因的同源性，分析吕氏泰勒虫与尤氏泰勒虫基因差异，并利用其cox1、18S rRNA和28S rRNA基因序列分别构建了它们的遗传进化树。研究结果表明，吕氏泰勒虫多呈圆点形、卵圆形和短杆状，而尤氏泰勒虫多呈逗点状、十字架状及三叶草形；吕氏泰勒虫cox1、18S rRNA及28S rRNA基因序列的长度分别为1 122、1 303、1 995 bp;尤氏泰勒虫cox1、18S rRNA及28S rRNA基因序列的长度分别为1 123、1 303、1 990 bp;两者cox1、18S rRNA及28S rRNA基因序列比对，其相似度分别为80.32%、95.87%及88.64%;所构建的3个遗传进化树均显示吕氏泰勒虫与尤氏泰勒虫未处于进化树一分支。提示吕氏泰勒虫与尤氏泰勒虫尽管形态极为相似，但它们间存在较远的亲缘关系，且cox1、18...     

马巴贝斯虫18S rRNA基因吉林省分离株的序列分析

为分析马巴贝斯虫吉林省分离株的18S rRNA基因序列，根据马巴贝斯虫18S rRNA基因序列设计1对引物，对吉林省的马匹血液基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物进行克隆、测序，扩增出大小为435bp的马巴贝斯虫18S rRNA基因片段．序列分析显示，马巴贝斯虫吉林省分离株与南非株同源性最高，为98．4％．     

猪传染性胃肠炎病毒的分离鉴定及其S基因序列分析

旨在明确内蒙古地区猪传染性胃肠炎流行毒株S基因遗传进化关系,为该病的防控提供依据。对内蒙古赤峰市采集的腹泻样品进行TGEV分离鉴定,成功分离到1株TGEV,将其命名为TGEV-CF(NMG)株。对TGEV-CF(NMG)株进行S基因的克隆、测序并与国内外已报道的25条基因序列进行比对和遗传进化分析。遗传进化分析结果表明,TGEV-CF(NMG)株与中国的attenuated H株和H16株亲缘关系最近,位于同一分支上。核苷酸序列比对结果显示,TGEV-CF(NMG)株与其他25株TGEV的同源性在95.1%～99.2%之间,其中与中国H16株同源性最高,为99.2%。表明分离株TGEV-CF(NMG)的S基因保守性较高,可作为制备TGEV疫苗的重要候选毒株。     

鸭疫里氏杆菌广西分离株16S rRNA基因序列的测定和系统进化分析

选取3株不同血清型的鸭疫里氏杆菌广西分离株GXRA 01、GXRA 07和GXRA 09,利用细菌通用引物,通过PCR方法成功扩增出16S rRNA的部分基因片段,通过克隆、序列测定获得3个分离株16S rRNA基因的核苷酸序列,并与G enB ank中注册的一些菌株的16S rRNA基因序列进行比较、系统进化关系分析发现:3株RA分属两个基因群,I群(GXRA 01)与AY 871818和AY 871819的16S rRNA序列的同源性达99.9%,Ⅱ群(GXRA 07、GXRA 09)与G enB ank中16S rRNA序列的同源性达99.3%-99.6%,GXRA 07与GXRA 09之间的同源性为100%,表明这3株菌株应为鸭疫里氏杆菌。     

产胞外淀粉酶极端嗜盐古菌CY的16S rRNA基因的克隆、测序及系统发育分析

从云南省一平浪盐矿采集盐矿样品,采用丰富的嗜盐培养基富集,平板划线分离,淀粉平板检测,分离到1株产胞外淀粉酶的极端嗜盐古菌,暂时命名为CY。采用通用的引物,对其16S rRNA基因进行PCR扩增、克隆和测序,并对16S rRNA基因序列进行系统进化分析,从16S rRNA基因序列的同源性比对发现CY菌株属于嗜盐古菌Halorobrum属。     

猪嵴病毒福建株3D基因的克隆及遗传进化分析

根据GenBank中登录的猪嵴病毒(porcine kobuvirus,PKV)3D基因序列特征设计特异性引物,采用RT-PCR方法从福建省某猪场采集腹泻粪便样品和小肠组织混合物中扩增猪嵴病毒3D基因,将扩增后的目的片段克隆后进行序列测定。结果表明,所扩增的目的片段编码有完整的3D开放阅读框,全长为1 407bp,编码有468个氨基酸。运用生物信息学软件,将获得3D基因序列和GenBank的猪嵴病毒株3D基因序列进行分析比较,该毒株的3D基因序列和SH-W-CHN/2010/China毒株的核苷酸同源性最高,为93.6%,与WH1株核苷酸同源性最低,为92%。从遗传进化上看,猪嵴病毒和其他中国株在遗传进化上处在一个同一分支,匈牙利分离株处在另一分支,表明猪嵴病毒可能在欧亚大陆上各自独立进化。     

基于16S rRNA基因序列分析的临床分离乳源菌鉴定和系统进化研究

利用16S rRNA基因序列分析方法对1株临床分离乳源菌进行鉴定并确定菌株的进化位置。抽提细菌DNA基因进行16S rRNAPCR扩增,并对扩增产物测序。成功扩增出长度为1 432 bp的核苷酸序列。该临床分离的乳源菌与GenBank上的已知序列进行了同源性比较,克隆到的序列与Y15856的同源性最低,为99.6%;与AB305019、D83353.1和FM875711.1的同源性最高,达99.9%。该试验菌为金黄色葡萄球菌且16S rRNA基因是高度保守的。利用16S rRNA基因序列分析鉴定细菌是一种快速、准确、方便的方法。     

基于16S rRNA基因序列分析的临床分离乳源菌鉴定和系统进化研究

利用16S rRNA基因序列分析方法对1株临床分离乳源菌进行鉴定并确定菌株的进化位置。抽提细菌DNA基因进行16S rRNAPCR扩增,并对扩增产物测序。成功扩增出长度为1 432 bp的核苷酸序列。该临床分离的乳源菌与GenBank上的已知序列进行了同源性比较,克隆到的序列与Y15856的同源性最低,为99.6%;与AB305019、D83353.1和FM875711.1的同源性最高,达99.9%。该试验菌为金黄色葡萄球菌且16S rRNA基因是高度保守的。利用16S rRNA基因序列分析鉴定细菌是一种快速、准确、方便的方法。     

肉鸡呼肠孤病毒的分离鉴定及致病性研究

【目的】从临床发病的疑似感染鸡呼肠孤病毒的白羽肉鸡病料中分离鉴定获得1株鸡源呼肠孤病毒SD18,对SD18株进行致病性及传播特性研究,为该病毒的深入研究和综合防治奠定基础。【方法】无菌采集疑似感染鸡呼肠孤病毒发病鸡跗关节处的肌腱和渗出物,分离病原物,在LMH细胞上培养,并连续盲传3代,经无菌生理盐水倍比稀释,采用Reed-Muench法测定病毒鸡胚半数致死量(ELD_(50))和组织细胞半数感染量(TCID_(50));对分离毒株进行理化特性和血凝特性测定;利用设计的鸡呼肠孤病毒L1和S1基因特异性引物,对提取的病毒总RNA进行RT-PCR扩增,经PCR鉴定为阳性的菌落进行基因测序以及核苷酸同源性比对和系统遗传进化分析;用该分离株病毒对SPF鸡和白羽肉鸡进行动物回归试验,并用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定攻毒后的SPF鸡血清中呼肠孤病毒抗体滴度。【结果】从疑似感染鸡呼肠孤病毒发病鸡跗关节处的肌腱和渗出物中分离获得1株鸡源呼肠孤病毒SD18,其ELD_(50)为10~(-6.5)/0.1 mL,TCID_(50)为10~(-7.36)/0.1 mL。RT-PCR结果显示,目的基因片段长度分别为1 100,750,265 bp,依次为鸡呼肠孤病毒的S1、σC和L1基因片段。核苷酸同源性比对结果显示,该分离株SD18与Ⅴ群鸡源呼肠孤病毒TW-918(台湾株)的S1基因序列同源性达92.7%,与Ⅰ群鸡病毒性关节炎疫苗S1133株的同源性仅为59.0%。核酸序列遗传进化分析表明,该分离株SD18与Ⅴ群鸡源呼肠孤病毒TW-918(台湾株)处于同一进化分支上,与Ⅰ群鸡源呼肠孤病毒S1133株处于不同的进化分支上,说明新分离的肉鸡呼肠孤病毒SD18株属于基因Ⅴ群,可能是Ⅰ群经典鸡源呼肠孤病毒S1133株的变异毒株。SPF鸡和白羽肉鸡回归试验表明,SD18株病毒能够引起鸡病毒性关节炎,与临床发病一致,并能水平传播。接种试验表明,病毒SD18能致死鸡胚,打开死亡鸡胚可见其绒毛尿囊膜增厚、尿酸盐沉积、胚体出血等症状,符合呼肠孤病毒的致病特点。【结论】该分离株SD18为新型肉鸡呼肠孤病毒,能够引起鸡发生病毒性关节炎。     

宠物豚鼠隐孢子虫感染情况调查及其虫种鉴定

为了解宠物豚鼠隐孢子虫感染情况,用饱和蔗糖溶液漂浮法对郑州某宠物市场55份豚鼠粪便和免疫抑制后的30只豚鼠新鲜粪便样本进行检查。结果发现,隐孢子虫总感染率分别为12.7%和80%,卵囊呈近圆形,卵囊大小为5.3μm×4.7μm〔(5.0～5.5)μm×(4.4～4.9)μm〕,卵囊指数为1.11。基于18SrRNA基因位点,对调查中发现的7个隐孢子虫分离株进行PCR扩增,PCR-RFLP和测序结果显示,7个分离株均为维瑞隐孢子虫。宠物豚鼠隐孢子虫感染较为普遍,感染虫种是维瑞隐孢子虫,且豚鼠在免疫抑制后,其隐孢子虫感染率显著增高。     

福建山羊溶血性曼氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析

【目的】对福清一山羊养殖场发生的山羊肺炎病原进行确诊,为福建山羊溶血性曼式杆菌的分离鉴定及检测提供研究基础。【方法】对剖检采取的组织进行细菌分离培养,随后对溶血性曼氏杆菌、羊口疮病毒、绵羊肺炎支原体和丝状支原体簇等羊常见呼吸道病原进行PCR检测,对分离菌进行16S rRNA基因克隆测序,并对分离株进行药物敏感性研究。【结果】细菌分离培养结果显示:从病死羊肺脏中分离到1株细菌;PCR检测结果显示,除溶血性曼氏杆菌有扩增条带外,未检测到其他病原;16S rRNA测序结果显示:分离株16S rRNA基因序列与GenBank上公布的其他溶血性曼氏杆菌的同源性为97.1%～100.0%,与溶血性曼氏杆菌美国D171参考株同源性高达100%;以上结果表明分离菌为溶血性曼氏杆菌,命名为FJ-FQ2018。药物敏感性试验表明分离株对氟苯尼考、恩诺沙星、头孢噻吩、头孢唑啉、环丙沙星等高敏,对氨苄西林中敏,对多粘菌素B、林可霉素低敏。【结论】福建某养殖场引进的山羊发生肺炎后经病原分离鉴定确诊为溶血性曼氏杆菌感染,分离菌株对8种抗生素的耐药性存在差异。     

羊泰勒虫PCR检测及进化分析

为调查吉林省洮南地区羊泰勒虫病的流行情况,在吉林省洮南地区某养殖场随机采集了羊血液样本76份,用PCR和nPCR方法对其进行检测,并将测得序列与GenBank中泰勒虫属和巴贝斯虫属18S rRNA序列进行对比分析。结果表明:洮南地区羊泰勒虫病的PCR阳性率为37%(28/76),nPCR阳性率为33%(25/76),nPCR方法的特异性更高。该试验测得泰勒虫18S rRNA序列与Theileria sp.和Theileria luwenshuni(吕氏泰勒虫)同源性高达99.6%以上,遗传距离为0～0.003,并处于同一进化分支上。该试验结果为洮南地区羊泰勒虫病的防控提供流行病学依据。     

番鸭呼肠孤病毒分子流行病学研究

选取1998～2009年福建省不同地区番鸭中分离到番鸭呼肠孤病毒分离株中具有代表性的10株,用RT-PCR技术扩增其S1和S4基因的功能区片段,进行序列测定.序列分析表明所扩增的S1基因的目的片段为819bp,S4基因目的片段为992 bp.参照国内外已发表的部分毒株S1和S4基因序列,构建番鸭呼肠孤病毒的遗传进化树,分析遗传进化关系.国内各分离株S1基因同源性为92.2％～96.7％,与国外89026株同源性为88.5％～92.8％,与禽呼肠孤病毒S1133株同源性为76％～78％.国内各分离株S4基因同源性为95.2％～99.3％,与国外89026株同源性为92.3％～94.5％,与禽呼肠孤病毒S1133株同源性为21.2％～21.5％.通过遗传进化树可以看到MDRV与同属的ARV序列形成了2个大分支,而MDRV序列分为2个小分支:一支为10株分离株和国内分离株,说明国内分离株没有明显差异;一支为国外分离株89026株,这说明国内分离株与国外毒株存在地域差异.     

中国新疆部分地区马泰勒虫感染的差异性及系统发育分析

【目的】分析新疆南北疆马泰勒虫感染的差异性及地方流行株遗传进化距离,研究马泰勒虫遗传多样性及其感染率。【方法】采自南北疆478份疑似马匹的血样,经马泰勒虫PCR方法检测,分析马泰勒虫感染情况并应用最大似然法(ML)基于18 S rRNA基因的遗传进化树及构建系统发育树。【结果】在所采集的样品中,中国新疆北疆地区马泰勒虫感染阳性率为13.96%(25/179),中国新疆南疆地区马泰勒虫感染阳性率为27.09%(78/299)。印度、南非、西班牙、伊朗等地方株聚为一支,扩增的18S rRNA基因(MF398476、MF398477)与瑞典地方株聚为一支。【结论】中国新疆南疆马泰勒虫感染率高于北疆,南北疆马泰勒虫感染存在显著性差异(P=0.0010.05),在不同年龄段马匹的感染无显著性差异(P0.05);扩增的马泰勒虫阿勒泰、托克逊地方流行株(MF398477、MF398476)与瑞士地方株(KM046918.1)亲缘关系最近。     

海南不同地理群体羊鲍18SrDNA的克隆与序列分析

[目的]对海南不同地理群体羊鲍18S rDNA进行克隆,并对其进行序列分析。[方法]采用分子生物学的方法,对海南不同海区的2个羊鲍地理群体18S rRNA基因全长进行克隆和序列分析,并将得到的羊鲍18S rRNA基因序列与同海域耳鲍的进行比较。[结果]同一地理群体内羊鲍核糖体18S rRNA基因序列完全一致;不同地理群体间羊鲍核糖体18S rRNA基因在碱基组成上的相似率为99.5%,仅在某些位点处发生了碱基替换,即腺嘌呤(T)被鸟嘌呤(G)替换;同时,将这两个不同群体中羊鲍的18S rRNA基因与同一海域耳鲍18S rRNA基因序列进行比较分析发现,它们之间也只是发生了碱基替换。[结论]为海南鲍鱼特别是羊鲍的遗传多样性、遗传结构、种质鉴定及其种质资源的保护和利用等方面的研究提供可靠依据。     

绵羊大肠杆菌和艾美尔球虫混合感染病原分离与病理组织学观察

【目的】对宁夏某规模化绵羊场大肠杆菌和艾美耳球虫混合感染进行分离鉴定并对靶器官的组织病理学变化进行分析。【方法】采用固体培养基进行细菌病原分离，饱和盐水漂浮法进行寄生虫检测；采用大肠杆菌16S rRNA引物进行基因序列扩增和测序，使用DNA Star软件将分离菌株测序结果与GenBank中的标准株序列进行同源性比较；采用MEGA 7.0软件中的邻接法，依据16S rRNA序列构建分离株系统发育树并进行遗传进化分析；对靶器官组织进行病理组织学观察。【结果】在伊红美蓝培养基中观察到金属光泽的黑色单一菌落，在血平板中有溶血环的灰色圆形单一菌落，染色为革兰氏阴性杆菌，共分离得到3株菌株；麦克马斯特法检测显示，粪便中有卵圆形、表面光滑的孢子化艾美尔球虫卵囊，其平均OPG为2200,属于轻度感染；对3株菌株16S rRNA扩增片段与阳性对照一致，16S rRNA基因序列构建的系统发育树与大肠杆菌在同一分支；病理组织学观察显示，肠系膜淋巴结淋巴细胞数量减少，有中性粒细胞浸润；肠组织黏膜层绒毛溶解坏死、黏膜上皮结构丢失；回肠固有层内有球虫虫体，呈嗜酸性圆形；空肠间质有中性粒细胞浸润，腺腔有镰刀状球虫裂...     

一株基因10型Ⅰ类新城疫病毒P基因的遗传进化分析

为探讨新城疫病毒(NDV)P基因及其编码蛋白的遗传进化特性,了解野鸟源NDV的基因变异情况,本研究对我国首次分离的野鸟源Ⅰ类NDV分离株SD18/13的P基因进行了测序,并从Gen Bank中选取不同基因型毒株的P基因序列进行遗传进化分析。结果表明,SD18/13 P基因开放阅读框全长1 200 bp,编码399个氨基酸,与Ⅰ类NDV的氨基酸同源性为83.5%~98.5%,与Ⅱ类NDV的氨基酸同源性为67.2%~70.5%。SD18/13与法国分离株Teal/France/10010/2010聚于一簇,同属于基因10型Ⅰ类NDV,两者P基因的核苷酸同源性为98.2%,氨基酸同源性为98.5%。     

猪传染性胃肠炎病毒HB-FP株的分离鉴定及其S基因序列分析

为了解目前河北地区流行的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的生物学特征及基因的遗传进化关系,从河北某地采集仔猪粪便或小肠内容物,病料处理后在PK-15细胞上进行盲传,通过RT-PCR、间接免疫荧光(IFA)验证,成功分离出1株猪传染性胃肠炎病毒,命名为HB-FP株。对HB-FP株S基因进行RT-PCR扩增,获得的分离株S全基因与国内外TGEV毒株进行序列比对和遗传进化分析:结果显示,HB-FP株S基因与其他参考毒株的核苷酸同源性为94.9%～98.8%,编码氨基酸同源性为65%～98%,与我国的TGEV JS2012(KT696544)株核苷酸同源性最高为98.8%,氨基酸同源性为98%。由进化树分析表明,HB-FP株除与英国TGEV株(AF104420)不在一个分支上外,与其他参考毒株都在同一分支上,中国的TGEV JS2012(KT696544)株、美国的TOY56-165(M94103)株、韩国的TGEV(AF298211)株与分离株HB-FP株亲缘关系最近。氨基酸变异情况分析表明,分离株与常用疫苗株相比在S蛋白的抗原表位区有7处点突变,这种抗原位点的突变对TGEV生物学特性的影响还有待进一步研究。本试验成功从河北省分离鉴定得到1株猪传染性胃肠炎病毒,为该地区TGEV防控及候选疫苗毒株的筛选提供了物质基础。     

前后盘吸虫梅花鹿源分离株的种类鉴定及遗传进化分析

旨在研究温州地区的梅花鹿源前后盘吸虫的种类和遗传进化,利用形态学和分子生物学方法,对虫体样本进行染色显微镜观察及pcox1和pnad1序列的PCR扩增和序列分析。形态学鉴定结果表明,前后盘吸虫梅花鹿源分离株在外部形态、大小以及内部组织器官与鹿前后盘吸虫(Paramphistomum cervi)相近。序列比较分析结果表明,3株前后盘吸虫梅花鹿源分离株样本的pcox1和pnad1序列完全一致,扩增产物长度分别为446和505bp,与GenBank中鹿前后盘吸虫(KT198987)同源性最高,分别为98.2%和97.7%。遗传进化分析表明,3株前后盘吸虫梅花鹿源分离株与鹿前后盘吸虫位于同一分支。表明,分离的虫株在形态学和遗传进化分析上均与鹿前后盘吸虫具有高度的一致性,提示获得的前后盘吸虫梅花鹿源分离株为鹿前后盘吸虫。