应用间接竞争ELISA检测山羊痘抗体方法的建立

[目的]为山羊痘疫苗接种山羊后产生的抗体效价检测和山羊痘的诊断奠定基础。[方法]采用Vero-E6传代细胞分离山羊痘病毒抗原,建立检测山羊痘抗体的间接竞争ELISA方法。[结果]检测山羊痘抗体的间接竞争ELISA的最佳工作条件：最佳抗原包被浓度为1μg/ml,兔抗高免血清最佳稀释度为1∶16 000,待检血清的工作浓度为1∶400,阳性血清的临界值为45.19%,阴性血清的临界值为38.89%。用该试验建立的ELISA方法检测3 000份接种山羊痘疫苗的山羊血清,阳性检出率为83.33%,琼脂扩散试验检出率为77.33%,竞争抑制ELISA方法较琼脂扩散试验方法敏感。[结论]该方法具有特异性高、快速、敏感等特点,适合检测山羊痘抗体。     

以G418抗性为筛选标记的深绿木霉遗传转化研究

【目的】探索建立以G418抗性为筛选标记的农杆菌介导的深绿木霉遗传转化方法,为木霉菌突变菌株的筛选和基因功能研究奠定基础。【方法】测试供试野生型深绿木霉菌菌株T23对G418的敏感性,构建以G418抗性为筛选标记的质粒载体p1300-neo,并将该质粒通过农杆菌导入深绿木霉T23菌株中,利用G418抗性平板筛选获得转化子,通过PCR对稳定转化子进行鉴定。【结果】T23菌株对G418具有高度敏感性,25μg/mL G418可完全抑制T23菌株的生长;构建的p1300-neo载体是可行的G418抗性标记,通过该载体获得了多株具有G418抗性的深绿木霉遗传转化子。【结论】G418抗性可以作为深绿木霉菌有效的遗传筛选标记,其在PDA培养基中的使用量为25μg/mL。     

乳腺特异性共表达4种脂肪酸合成酶载体 及其稳转山羊成纤维细胞系的构建

为改善山羊乳品质,创制乳汁中富含n-3不饱和脂肪酸的奶山羊育种新材料,首先构建了一种山羊乳腺特异性表达载体,以实现n-3不饱和脂肪酸合通路中4种脂肪酸合成酶基因(fat-1,fads2,elovl5和scd-1)的共表达。为初步验证该载体的有效性,通过脂质体法转染小鼠乳腺上皮细胞系C127,经G418筛选收集阳性C127转基因细胞,并对其进行反转录PCR(RT-PCR)检测。结果表明,4种基因均可在C127细胞转基因中表达。将该多基因共表达载体转染奶山羊成纤维细胞,通过G418筛选获得了稳定转染的细胞系。PCR结果显示,4个目的基因均成功整合到奶山羊成纤维细胞基因组中。总之,本研究成功构建了乳腺特异性共表达4种脂肪酸合成酶转基因载体及其山羊转基因细胞系,为创制乳腺特异性表达多不饱和脂肪酸的转基因奶山羊奠定了基础。     

犬SLAM基因真核表达载体的构建及在MDCK细胞中的稳定表达

为了构建稳定表达犬信号淋巴细胞激活因子(SLAM)的MDCK细胞系,该研究从犬外周血淋巴细胞中克隆了犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)细胞受体SLAM基因,将鉴定正确的SLAM基因插入到高效真核表达载体pcDNA3.1(+)中.采用脂质体转染的方式将重组质粒pcDNA3.1/SLAM转染到MDCK细胞中,采用G418加压筛选及有限稀释法克隆,获取稳定表达SLAM的MDCK细胞株.结果表明,成功构建了SLAM的真核表达载体pcDNA3.1/SLAM,并通过G418筛选获得了稳定表达SLAM的细胞系MDCK.     

过表达MyoD1基因山羊胎儿成纤维细胞系的建立及其成肌诱导分化

【目的】通过建立过表达MyoD1基因山羊胎儿成纤维细胞系研究MyoD1基因的异位表达研究其在成肌分化中的生物作用。【方法】采用RT-PCR从激活的骨骼肌卫星细胞中克隆MyoD1基因,并将其cDNA终止密码子TGA定向突变为GGA,定向克隆至带有增强型水母绿色荧光蛋白（ehanced green fluorescent protein,eGFP）报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,构建融合蛋白表达载体pEGFP-MyoD1,经过酶切、测序鉴定后,采用LipofectiminTM LTX转染山羊胎儿成纤维细胞（goat embryonic fibroblast,GEF）以建立MyoD1异位表达细胞株并采用成肌诱导分化培养液进行成肌诱导分化,探究MyoD1在成肌过程中的生物学功能。【结果】成功克隆山羊MyoD1基因,并在MyoD1 的开放阅读框（ORF）两端引入XhoⅠ/EcoRⅠ酶切位点,将其终止密码子TGA定点突变为GGA,定向克隆至pEGFP-N1真核表达载体,获得融合蛋白表达载体pEGFP-MyoD1;经G418（400 μg•mL-1）筛选2周后,获得MyoD1异位表达的GEF细胞株;间接免疫荧光（indirect immunofluorescence assay,IFA）检测结果显示该细胞株能够表达Myf-5等成肌相关免疫学标志;采用成肌分化培养基分化培养处理2—3 d可见少量肌管产生,并表达MyoG、Desmin和MyHC等早期成肌分化标志,处理5 d可见大量肌管形成。【结论】成功克隆出山羊MyoD1基因,构建了pEGFP-MyoD1真核表达载体并建立过表达MyoD1 GEF细胞系,过表达MyoD1 GEF系能够在成肌诱导培养液诱导形成肌管。     

fat-1基因脂肪组织特异性表达载体的构建及其山羊转基因细胞系的建立

旨在构建一种筛选标记可全部去除的脂肪组织特异性表达fat-1基因的载体,将其转染山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定整合fat-1基因的转基因细胞系。首先将人工合成的fat-1基因连接至L28-Wnt10b载体(1种带有小鼠脂肪组织特异性启动子Fabp4的载体)上,构建成fat-1基因脂肪组织特异性表达载体L28-fat1;同时经多次克隆构建成1种筛选标记可全部去除的骨架载体MCS-3s-LoxP-RFP;然后,利用Hind III和Not I对上述2种载体进行双酶切,接着进行连接,构建出筛选标记可全部去除的脂肪组织特异性表达fat-1基因的表达载体。采用脂质体介导的方法转染山羊胎儿成纤维细胞,通过G418筛选转基因细胞。酶切鉴定及PCR检测结果表明,成功构建了3s-LoxP-RFP-FABP4-fat1表达载体,并首次获得了脂肪组织特异性表达fat-1基因的山羊胎儿成纤维转基因细胞系,为将来通过体细胞核移植创制脂肪组织特异表达fat-1基因的优质肉用转基因山羊新材料奠定了基础。     

人Ⅰ型胶原基因脂质体转染牛耳细胞克隆筛选方法

构建连接有人Ⅰ型胶原基因的质粒(PGCl-collagen).利用脂质体介导的方法转染荷斯坦奶牛耳成纤维细胞,优化一系列转染条件以提高转染效率,再利用G418和GFP荧光的表达来筛选稳定转染的细胞,最后以末转染的成纤维细胞作为阴性对照组,PGCl-collagen作为阳性对照组对转染的细胞进行PCR验证.结果显示:在6孔培养板中细胞融合度达到50%～60%左右介导1～3μg重组质粒转染24 h,转染效率可达25%～30%,筛选单克隆细胞在荧光显微镜观察检测到绿色荧光蛋白的表达.在使用800U的G418筛选效果最好,维持浓度300～600U,获得25个稳定表达的阳性细胞系.从中选取6个克隆进行PCR验证.成功利用脂质体转染方法将人I型胶原基因成功转染到荷斯坦奶牛耳成纤维细胞,PCR验证结果正确.     

山羊痘病毒P32基因真核表达载体的构建及表达

从重组克隆载体pMD18-P32中扩增出山羊痘病毒P32基因,与毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K相连接,构建重组表达载体pPIC9K-P32.重组质粒pPIC9K-P32用Sal I线性化后,与毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115混合后电转化,使重组表达载体与酵母染色体发生同源重组.采用G418抗性梯度筛选法得到高拷贝重组菌株,甲醇诱导目的基因表达.SDS-PAGE和Western-blotting分析结果表明,用酵母成功表达出了31kD的重组蛋白,该蛋白具有生物学活性,能被山羊痘阳性血清识别.     

6种生物碱对斜纹夜蛾离体培养细胞的作用方式

通过倒置显微镜观察斜纹夜蛾细胞凋亡小体,采用MTT法测定细胞增殖抑制作用,并使用流式细胞仪检测细胞周期时相,研究了骆驼蓬碱、喜树碱、蓖麻碱、苦参碱、博落回碱和烟碱对斜纹夜蛾离体培养细胞系SL-1的作用方式和细胞毒理。结果表明:骆驼蓬碱5.0μg/mL、20.0μg/mL和喜树碱0.5μmol/L、1.0μmol/L处理后48～60 h,斜纹夜蛾离体培养细胞系SL-1表现出明显的细胞凋亡诱导作用,处理后12～48 h,明显抑制SL-1细胞增殖,流式细胞仪检测显示细胞阻滞于G2/M期;博落回碱和蓖麻碱5.0μg/mL、20.0μg/mL对SL-1具有细胞增殖抑制作用,以20.0μg/mL处理具有细胞周期时相阻滞作用,同样使细胞阻滞于G2/M期,但无明显的细胞凋亡诱导作用;烟碱和苦参碱在5.0μg/mL、20.0μg/mL对SL-1具有细胞增殖抑制作用。     

法夫酵母整合型表达载体的构建

为了建立法夫酵母虾青素代谢途径研究和分子育种的技术体系,构建了法夫酵母的整合型表达载体.通过测定法夫酵母对G418的抗性来确定抗性筛选物的质量浓度,以来源于法夫酵母本身的rRNA基因为基因同源重组片段,利用法夫酵母肌动蛋白启动子和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（gpd）启动子,构建了携带G418抗性基因的整合型载体pMD-18spakta和pMD-18spgktg.结果表明：法夫酵母对20 μg/mL质量浓度的G418敏感,将构建的载体转化法夫酵母菌株后,筛选得到了能够在含有G418的培养基上生长的转化子;利用PCR的方法检测到转化子中存在的抗性基因.将筛选得到的阳性菌株连续传代培养10次后,发现该菌株的G418抗性仍然存在;以总DNA为模板,用PCR的方法仍可检测到G418抗性基因.说明已经构建得到了遗传稳定性良好的法夫酵母整合型表达载体,构建的质粒pMD-18spakta和pMD-18spgktg可作为法夫酵母整合载体应用于法夫酵母的DNA重组实验.     

转甜味蛋白Brazzein基因乳腺特异表达载体的山羊体细胞株筛选

[目的]建立通过山羊乳汁获取甜味蛋白Brazzein的方法.[方法]将前期工作中构建的Brazzein基因山羊乳腺特异表达载体STP-pBC1进行线性化,采用脂质体法转染山羊成纤维细胞,以期获得转基因阳性细胞.[结果]采用脂质体法转染山羊成纤维细胞后,通过最适G418浓度（400 μg/ml）筛选获得转基因阳性细胞;转基因阳性细胞形态呈现梭形且核仁清晰,其生长曲线呈现正常的“S”;转基因阳性细胞经冷冻复苏后,仍呈现与冷冻前新鲜转基因细胞相似的形态和生长曲线;PCR鉴定结果表明,STP-pBC1已整合入转基因细胞的基因组中.[结论]成功获得乳腺特异的转甜味蛋白基因Brazzein的山羊成纤维细胞株.     

羊口疮病毒F1L蛋白对山羊痘病毒黏附BHK21细胞的影响

以提取羊口疮痂皮中病毒的DNA为模板,用PCR扩增羊口疮病毒(ORFV)的059基因序列,并进行基因克隆、测序鉴定和生物信息学分析;优化合成059基因编码序列,连接载体pET42a(+),转化Escherichia coli BL21(DE3);用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导阳性克隆菌,采用免疫印迹检测表达的F1...     

山羊α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的构建 及核供体细胞的转染

为了构建α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体及提供山羊乳腺生物反应器α-乳清蛋白核移植供体细胞,提取乳腺组织中的总RNA,采用RT-PCR技术获得α-乳清蛋白基因cDNA,测序酶切后连接乳腺特异性表达载体pBCⅠ-Neo,并对重组载体进行酶切测序鉴定;取重组正确的载体酶切线性化后利用脂质体介导转染至山羊胎儿成纤维细胞,通过G418筛选培养转染了α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的山羊胎儿成纤维细胞。结果显示:经过RT-PCR特异性扩增克隆出α-乳清蛋白基因;克隆的基因碱基组成序列经测序与预期完全一致,α-乳清蛋白基因片段正向插入乳腺特异性表达载体;重组载体在山羊胎儿成纤维细胞中稳定转染,转入α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的山羊胎儿成纤维细胞生长迅速,仍保持原有的细胞生长形态。成功构建了α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体,获得稳定转染的山羊胎儿成纤维细胞可用于核移植。     

转K2.9基因绒山羊体细胞核移植技术体系的优化研究

【目的】利用体细胞核移植技术制备转毛角蛋白Ⅱ型中间丝K2.9基因的高绒质绒山羊胚胎,为绒山羊优良品种的培育提供一种全新的技术材料。【方法】以含有Neor 基因标记的K2.9 毛囊特异表达载体pcDNA3.1-K转染绒山羊胎儿成纤维细胞,经G418筛选获得转K2.9基因细胞,将获得的转基因阳性细胞与体外成熟的绒山羊卵母细胞进行核移植,并对生产的重构胚进行了体外培养。本文分别进行了激活方法、供体细胞和卵母细胞来源的筛选,且对获得的囊胚进行了PCR鉴定。【结果】（1）Iono+6-D对成年羊卵母细胞的孤雌激活效果好于A23187+6-D,显著提高了胚胎的卵裂率。（2）羔羊孤雌胚的卵裂率显著低于成年羊,但囊胚率差异不显著。（3）来自2只绒山羊胎儿的转基因成纤维细胞对核移植胚的发育没有显著影响,但2号羊的转基因细胞显著提高了融合率。（4）以羔羊卵进行核移植,显著降低了核移植胚的发育率。（5）对获得的囊胚进行PCR鉴定,成功扩增到目的基因。【结论】将K2.9 毛囊特异表达载体pcDNA3.1-K转染的绒山羊胎儿成纤维细胞作为供体细胞,核移植到成年羊卵母细胞中,以Iono+6-D进行激活,首次成功、高效地获得携带K2.9基因的绒山羊囊胚。     

人乳铁蛋白基因乳腺特异性表达载体的构建及转染研究

构建了携带人乳铁蛋白(LTF)基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因的乳腺特异性表达载体(pEBL),用脂质体法转染泌乳期莎能奶山羊乳腺上皮细胞,转染后于荧光显微镜下观察GFP表达情况。用G 418对转染细胞进行筛选,获得抗性细胞克隆,并对转染细胞进行PCR检测。结果显示,pEBL构建成功,转染6 h后可观察到细胞有GFP表达,PCR检测阳性克隆细胞转有LTF基因。表明pEBL载体已转染山羊乳腺上皮细胞,为进一步建立转基因动物乳腺生物反应器奠定了基础。     

同源臂长度对CRISPR/Cas9介导hLF基因打靶山羊β-乳球蛋白位点效率的影响

【目的】探究同源臂长度对CRISPR/Cas9系统介导人乳铁蛋白基因（hLF）打靶山羊β-乳球蛋白基因（BLG）座位点效率的影响,为今后体细胞核移植制备BLG -/hLF +基因打靶山羊提供科学依据,也为CRISPR/Cas9基因编辑系统介导BLG基因或其他基因座位点定向精准分子修饰的遗传育种提供借鉴。【方法】针对山羊BLG基因第一外显子区域设计构建sgBLG/Cas9载体,电转染山羊胎儿成纤维细胞,PCR验证BLG基因座位点致突变活性;以BLC14乳腺特异性表达载体为基础构建3种同源臂长度（6.0、3.5和1.2 kb）的hLF基因打靶载体,分别与sgBLG/Cas9载体共转染山羊胎儿成纤维细胞,经500 μg/mL G418筛选后,采用PCR检测基因打靶情况。【结果】sgBLG/Cas9载体在山羊胎儿成纤维细胞BLG基因座附近切割DNA双链的致突变活性效率在30%~35%。构建获得3种同源臂长度的hLF基因打靶载体（BLC14-1、BLC14-2和BLC14-3）,对应的同源臂长度分别为6.0、3.5和1.2 kb;将3种hLF基因打靶载体与sgBLG/Cas9载体共转染山羊胎儿成纤维细胞,经5次电转染和G418筛选,分别获得83、77和86株药物抗性细胞,经PCR同源重组检测最终获得42、38和44株BLG -/hLF +基因打靶细胞株,即hLF基因在山羊胎儿成纤维细胞BLG基因座的平均打靶效率分别为50.6%（42/83）、49.4%（38/77）和51.2%（44/86）。3种不同长度同源臂构建的hLF基因打靶载体在山羊BLG基因座位点的打靶效率在统计学上无显著差异（P>0.05）,表明同源臂长度对CRISPR/Cas9介导hLF基因打靶山羊BLG基因座位点无显著影响。【结论】利用CRISPR/Cas9系统介导hLF基因打靶山羊胎儿成纤维细胞BLG基因座位点能成功获得多株hLF +/BLG -基因打靶细胞株（BLG基因座定点打靶hLF基因）,但打靶载体同源臂长度对CRISPR/Cas9系统介导BLG位点定向整合hLF基因的打靶效率无明显影响。     

克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4基因并稳定转染胎儿成纤维细胞 #br#

 【目的】克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4(thymosin beta 4,Tβ4) 基因,构建皮肤特异性表达载体,转染内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定表达红色荧光蛋白并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】通过RT-PCR克隆Tβ4基因cDNA序列,然后与KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件连接构成Tβ皮肤特异性表达载体pCDsRed-KT。外源表达载体以lipofectamineTM 2 000介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】 克隆了内蒙古白绒山羊Tβ4基因,cDNA全长142 bp,其中包含135 bp的完整ORF,编码44个氨基酸残基,氨基酸序列与已报道的牛胸腺素β4(XM002706880.1)同源性为100%。测序显示构建的表达载体pCDsRed-KT中,Tβ4基因正确连接在皮肤特异性启动子KAP6-1下游,顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因,载体构建正确。PCR检测显示外源KAP6-1启动子和Tβ4基因整合到细胞基因组中,筛选出的转基因细胞高效表达红色荧光蛋白。【结论】克隆得到内蒙古白绒山羊Tβ4基因并构建成功其真核表达载体,可稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过核移植方法获得转胸腺素β4基因绒山羊提供了条件。