猪流行性腹泻病毒的遗传变异及疫苗研发现状

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒引发的一种高度传染性肠道疾病，可引起仔猪厌食、呕吐、水样腹泻等，是导致仔猪高发病率和死亡率的重要诱因。猪流行性腹泻病毒作为一种重要的猪冠状病毒，仍在不断进化和变异，免疫逃逸能力和传染性在不断加强。目前，疫苗免疫仍是预防猪流行性腹泻的重要手段，越来越多的疫苗产品已被研制出来。针对猪流行性腹泻的病原特征及疫苗研发现状进行综述，旨在为该病的监测和防控提供理论依据。     

山羊化脓隐秘杆菌重庆分离株CbpA肝素结合结构域鉴定

本研究旨在对山羊化脓隐秘杆菌重庆分离株的胶原结合蛋白(collagen-binding protein,Cbp)CbpA(CbpACQ)进行序列分析,鉴定其中2个潜在的肝素结合结构域NRB和B1。运用生物信息学软件分析CbpA-CQ基因及其编码产物。采用PCR扩增NRB和B1基因,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1。融合蛋白GST-NRB和GST-B1在大肠杆菌DE3菌株中被诱导表达,使用Gluthathione-Sepharose 4B纯化。采用免疫印迹检测融合蛋白GST-NRB、GST-B1与HeLa细胞的黏附情况,以及肝素对融合蛋白黏附细胞的抑制情况。结果显示,重庆株CbpA有7个胶原结合蛋白B结构域,约占全长的55%,此结构域与化脓隐秘杆菌、链球菌属等细菌有同源性。重庆株CbpA与化脓隐秘杆菌的CbpA在进化树中聚集成一个进化支。从诱导菌裂解物上清中亲和纯化得到融合蛋白GST-NRB和GST-B1。GST-NRB、GST-B1呈剂量依赖性黏附HeLa细胞,肝素呈剂量依赖性抑制GST-NRB、GST-B1黏附HeLa细胞。结果表明尽管CbpA-CQ有很大变异性,但具有已知化脓隐秘杆菌CbpA的共同序列特征;其NRB和B1区域为肝素结合结构域。     

重庆地区羊传染性脓疱与病原菌混合感染的检测与分析

采集山羊口唇部痂皮,通过PCR检测、MDBK细胞培养、电镜观察、间接免疫荧光(IFA)检测对羊传染性脓疱病毒进行系统鉴定,同时,分离培养病灶部位主要病原菌,进行分子鉴定、致病性和药敏试验检测,初步分析病原特性。结果表明,共分离到1株羊传染性脓疱病毒,3种病原菌。通过对病原菌16SrDNA基因序列比对分析,发现其分别与多动物链球菌、金黄色葡萄球菌和溶血性曼氏杆菌同源性较高,在系统进化发育树中分别与其聚为一簇。致病性分析,发现多动物链球菌和溶血性曼氏杆菌对小鼠的致死率高达100%。3种病原菌主要侵染部位为小鼠心脏、肝脏和肺脏,能够引起肺脏和肝脏明显病变。药敏试验表明,3种菌均对舒巴坦、阿米卡星和培氟沙星等6种药物高度敏感。本研究首次从羊传染性脓疱病变部位分离到多动物链球菌、金黄色葡萄球菌和溶血性曼氏杆菌,为该病在重庆地区的流行特点和防治技术研究提供理论依据。     

不同酵母菌制剂对断奶羔羊的临床应用效果研究

[目的]分析临床常用酵母菌制剂对断奶羔羊生长性能及抗腹泻能力的影响,筛选增免促长有效药物。[方法]选取体重相近的断奶羔羊40只,随机分为4组,即3个试验组和1个对照组,通过拌料方式分别在日粮中添加福邦酵母、百利可和增速乐,正常饲喂,连续用药30 d,对各组羔羊的平均日增重、血液生理生化指标进行测定,并对各组羔羊腹泻率进行统计。[结果]福邦酵母组断奶羔羊的平均日增重最高,与对照组差异极显著(P<0.01);福邦酵母组断奶羔羊的白细胞数目与红细胞数目均高于其他组,且与对照组差异均极显著(P<0.01);福邦酵母组谷丙转氨酶(ALT)最高,与其他组差异极显著(P<0.01);福邦酵母组白蛋白(ALB)与百利可组和对照组差异显著(P<0.05);福邦酵母组和百利可组的葡萄糖(GLU)均与增速乐组和对照组差异极显著(P<0.01);对各组断奶羔羊抗腹泻能力的检测发现,福邦酵母组断奶羔羊腹泻率最低。[结论]3种药物中福邦酵母在羔羊增免促长方面有较好的应用效果。     

不同饲料添加剂对妊娠母羊和初生羔羊的影响

为研究微生态制剂、抗菌肽制剂及中药作为饲料添加剂对妊娠母羊及羔羊的影响,试验选用40只妊娠期母羊,随机分为福邦酵母组、态康利保组、扶正解毒散组和对照组4组,每组10只。分别在日粮中添加福邦酵母、态康利保、扶正解毒散,对照组不添加药物,连续饲喂30 d后,测定母羊平均产羔数及血清生化指标,同时统计羔羊出生30 d后的死亡率及平均日增重,分析不同添加剂对母羊生产性能及羔羊生长性能的影响。结果表明,各组母羊平均产羔数差异不显著(P>0.05);血清生化指标检测发现,福邦酵母组总蛋白(TP)含量高于对照组,且差异显著(P<0.05),而甘油三酯(TG)含量与对照组差异极显著(P<0.01);福邦酵母组葡萄糖(GLU)含量与态康利保组差异显著(P<0.05),与扶正解毒散组和对照组差异极显著(P<0.01);对照组羔羊的死亡率最高,福邦酵母组最低,且福邦酵母组羔羊平均日增重最高,与对照组差异显著(P<0.05)。综上所述,福邦酵母可以有效改善母羊的生产性能和羔羊的生长水平。     

猪场舍内环境中葡萄球菌的分离鉴定及耐药分析

为了明确重庆市某规模猪场舍内环境中葡萄球菌的病原特性及耐药情况,试验采用空气细菌培养自然沉降法和物体表面采样法采集猪场舍内环境样本20份,进行葡萄球菌的分离纯化,提取分离株基因组DNA,扩增16S rRNA基因序列,构建系统进化树,检测其生化指标,确定敏感药物,并分析病原菌耐药基因的携带情况。结果表明：分离纯化得到2种革兰氏阳性球菌,分别与头状葡萄球菌和沃氏葡萄球菌相似性较高(均为99%),在系统进化树中也分别与其聚为一簇,两种菌的硝酸盐还原、MR-VP和甘露醇等7种指标检测结果均为阳性,确定为头状葡萄球菌和沃氏葡萄球菌,均对多西环素、复方新诺明和阿奇霉素耐药;头状葡萄球菌携带vanA、rpoB、ermB和tetM 4种耐药基因,沃氏葡萄球菌携带ileS、rpoB、blaZ、ermC、aacA-aphD、tetK和tetM 7种耐药基因,两种菌均含有rpoB和tetM基因,并证实头状葡萄球菌和沃氏葡萄球菌的耐药类型与耐药基因具有相关性。说明该猪场舍内环境中存在头状葡萄球菌和沃氏葡萄球菌,在生猪养殖和人畜共患病防控方面应加强对环境中病原微生物的监测。     

鸡β-防御素-13(Gal-13)成熟肽序列的克隆及表达

本研究旨在克隆鸡成熟肽c DNA序列并构建原核和真核表达载体,研究其在大肠杆菌和毕赤酵母中诱导后融合蛋白的表达情况。利用PCR技术从pDM19-T-Gal-13质粒中扩增得到成熟肽c DNA序列,将其亚克隆到p GEX-4T-1和p PICZαA质粒中,构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1-Gal-13和真核表达载体pPICZαA-Gal-13,转化大肠杆菌BL21(DE3)和毕赤酵母X-33,挑取阳性转化子用进行鉴定和诱导表达,(Tricine)SDS-PAGE检测产物的表达情况,以及真核诱导表达上清液对鸡白痢沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。结果显示,成功克隆得到的成熟肽序列长为128bp,包含ATG片段和酶切位点与保护碱共20bp,共编码36个氨基酸;构建获得重组原核表达质粒pGEX-4T-1-Gal-13和真核表达载体pPICZα-A-Gal-13,并将重组质粒转化到大肠杆菌BL21和酵母X-33,进行诱导表达产物经电泳分析后结果显示,Gal-13融合蛋白在大肠杆菌和酵母中得到大量表达,原核表达分子量是31ku并以包涵体的形式存在,真核表达的分子量5.9 ku并分泌到发酵液中;抑菌试验表明,发现真核表达的发酵无菌上清对鸡白痢沙门氏菌和金黄色葡萄球菌具有抑菌活性。     

化脓隐秘杆菌候选抗原的免疫保护效果测试

为鉴定化脓隐秘杆菌的新抗原,对被抗血清识别的化脓隐秘杆菌膜蛋白进行质谱分析,采用免疫印迹分析抗原性, ELISA方法测试被免疫小鼠的抗体水平,通过化脓隐秘杆菌攻毒测试免疫保护率。结果显示,铁ABC(ATP结合盒,ATP binding cassette)转运体的底物结合蛋白是化脓隐秘杆菌的1个新保护性抗原,具有良好的抗原性和免疫原性。     

基于PLO基因的山羊化脓隐秘杆菌PCR检测方法的建立与应用

为建立特异的化脓隐秘杆菌PCR检测方法,基于化脓隐秘杆菌PLO基因设计4对引物,对12种细菌进行常规PCR扩增,以评价方法的特异性,并运用建立的PCR方法检测临床样本。结果显示只有使用F1/R1引物对的PCR方法能鉴别化脓隐秘杆菌,并能用于临床样本检测。     

重庆地区兔腹泻病原菌分离鉴定及检测方法的建立

对重庆地区兔细菌性腹泻病原菌进行分离鉴定并建立相应检测方法,为该病的检测及防控奠定基础。通过临床诊断与细菌分离培养,对引起兔腹泻的病原菌进行分离,利用细菌通用引物扩增分离菌16S rDNA基因序列,测序分析后构建系统进化发育树。同时,依据各病原菌特异性序列设计引物,建立PCR检测方法。结果表明,共分离到4种病原菌,分子生物学鉴定为:铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌;依据铜绿假单胞菌外毒素eta基因、产气荚膜梭菌a毒素基因、金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因和大肠杆菌外膜蛋白eae基因设计特异性引物,成功建立多重PCR检测方法,可从4种病原菌基因组混合物中扩增出大小分别为1 043、324、200和609bp的目的条带,目的菌株最低检出浓度为103cfu·mL-1。对重庆地区200份临床样本进行检测,发现4种病原菌普遍存在,其中,金黄色葡萄球菌单独感染检出率高达37.6%,与大肠杆菌的混合感染检出率达28.0%。