低酚陆地棉直接体细胞胚胎发生和植株再生

选用低酚陆地棉无菌苗下胚轴为材料进行全固体组织培养,直接诱导获得了胚性愈伤组织,并进一步分化为再生植株.结果表明,激素是影响棉花直接体细胞胚胎发生的重要因素.MSB培养基中添加2,4-D有利于愈伤组织的形成,却不能直接诱导获得胚性愈伤组织.MSB培养基中添加IBA和BA也不能直接诱导获得胚性愈伤组织.MSB培养基附加适当浓度的IBA和KT能直接诱导出胚性愈伤组织.最适激素组合(1.0 mg/L IBA,0.5 mg/L KT)能使诱导棉花下胚轴产生大量胚性愈伤组织,并且在3个月内就可肉眼观察到不同发育时期的胚.MSB培养基中附加1.0 g/L谷氨酰胺和0.5 g/L天门冬酰胺有利于胚萌发成苗.本研究建立了简便高效的棉花直接体细胞胚胎发生和植株再生培养体系,从胚性愈伤组织诱导到植株再生约需5～6个月时间.     

海岛棉愈伤组织诱导及分化的影响因素初探

本研究以新疆自育海岛棉品种新海16无菌苗下胚轴为外植体材料,进行愈伤组织诱导、分化及再生植株的初步研究,筛选出适合于海岛棉体细胞胚胎再生的培养体系。结果表明,最佳诱导愈伤组织及分化配方为MSB附加0.1mg/L2,4-D及0.05mg/LKT,分化率达到88%;于MSB1附加0.01mg/LKT及0.3mg/LNAA中对胚性愈伤组织进行增值培养;由MSB2附加0.1mg/LIBA中可分化出成熟体细胞胚胎及再生植株,分化率达73%。本研究通过体细胞胚胎发生途径获得了海岛棉再生植株,为海岛棉遗传转化体系的建立及分子育种奠定了基础。     

四倍体野生棉毛棉体细胞胚胎发生与植株再生研究

通过对培养基激素配比,以及不同浓度的PEG、CuSO4和AgNO3等处理,对棉属四倍体野生棉种毛棉(G.tomentosum Nutt.Watt)进行了体细胞培养,获得了大量体细胞胚状体并实现植株再生。与四倍体陆地棉(G.hirsutum,cv.Coker 201)相比,毛棉体细胞培养难度较大,且体细胞胚畸形严重,萌发困难,但通过培养条件的调控可以得到大量胚状体和少量再生植株。试验结果表明,激素组合0.1 mg.L-1 KT+0.1 mg.L-1 2,4-D诱导的愈伤组织较松脆,分化潜力高;PEG处理不利于毛棉的胚性和非胚性愈伤的诱导,而不同浓度的CuSO4和AgNO3处理对于体细胞胚状体诱导和萌发以及植株再生效果有明显差异。其中3.5 mg.L-1 CuSO4+0.5 mg.L-1IBA+0.2 mg.L-1 KT和3 mg.L-1 AgNO3+0.5 mg.L-1 IBA+0.2 mg.L-1 KT组合利于胚性愈伤的增殖和体细胞胚的萌发。     

陆地棉抗病品种中521植株再生的研究

以农艺性状优良且抗枯黄萎病的陆地棉品种中521的下胚轴为外植体,采用固液结合的体细胞培养方法建立细胞悬浮系并进行植株再生的研究。结果表明,愈伤组织的诱导以MS 1.0 mg.L-1IBA 0.05 mg.L-1KT 0.1 mg.L-12,4-D 30g.L-1葡萄糖的固体培养基为最佳;体细胞胚的形成以MS 0.01 mg.L-1IBA 0.01 mg.L-1KT 0.005 mg.L-12,4-D 1.0g.L-1谷氨酰胺的液体培养基为最佳,悬浮30 d后可以发现体细胞胚的形成。之后转接入四种不同的MSB固体培养基上诱导再生植株形成,发现MSB 2 g.L-1谷氨酰胺 0.5 g.L-1天冬酰胺 30g.L-1蔗糖 6.0 g.L-1琼脂为最佳培养基,且发现此方法比全程固体培养缩短了体细胞再生的周期,此品种在本研究建立的再生体系下植株再生周期为6个月左右。     

胡萝卜高效再生体系的建立

以胡萝卜下胚轴为外植体,研究其愈伤组织诱导及植株再生各个时期的影响因素。试验结果表明：0．1mg／L2,4-D或0．1mg／L2,4-D 0．2mg／L KT的激素组合有利于胡萝卜下胚轴的愈伤组织诱导;在0．1mg／L2,4-D的培养基上形成的愈伤组织主要以胚状体的形式再生,而在含0．1mg／L2,4-D 0．2mg／L KT激素组合的培养基上形成的愈伤组织主要以发生不定芽的方式再生;再生过程中,B5基本培养基上的苗子不易生根,需要附加0．1mg／L的IBA,而在MS培养基上苗子可直接形成根。     

棉属G染色体组野生棉种的体细胞胚胎发生与植株再生研究

通过培养基激素配比、碳源种类等培养条件的筛选，对2个G染色体组棉种（纳尔逊氏棉，Gossypium nelsonii Fryx.；澳洲棉，Gossypium australe F. Muell.）进行体细胞培养并获得了体细胞胚，其中纳尔逊氏棉获得了再生植株，澳洲棉获得了大量的胚状体。与D染色体组棉种克劳茨基棉（Gossypium klotzschianum Anderss）相比，G染色体组棉种再生时间长，且体细胞胚畸形严重、萌发困难，但通过培养条件的调控可以得到大量胚状体和少量再生植株。激素组合0.1 mg L^-1 KT+0.1 mg L^-1 2, 4-D诱导的愈伤组织较松软，分化潜力高；胚性愈伤组织的增殖使用0.2 mg L^-1 KT+0.5 mg L^-1 IBA的激素组合；组合0.25 mg L^-1 IBA＋0.3 mg L^-1 KT有利于体细胞胚胎发生，而含激素组合MSB5+0.15 mg L^-1 KT+0.5 mg L^-1 NAA的培养基适合体细胞胚胎的萌发和植株再生。此外，愈伤组织诱导宜用葡萄糖作为碳源，而在胚性愈伤组织的增殖及保存和胚状体的萌发过程中用麦芽糖作碳源的效果更佳。     

陆地棉体细胞再生植株技术的改进研究

以Coker201为材料,改进了棉花体细胞再生植株及移栽技术。MSB(MS无机盐+B5维生素)培养基附加IBA能直接诱导出胚性愈伤组织,适当浓度的KT可促进IBA的效应。最适激素组合(IBA1.0mg·L-1、KT0.5mg·L-1)能使几个陆地棉品种的下胚轴在两个月内诱导出大量胚性愈伤组织,诱导后第三个月可观察到胚状体的发生。适量的AgNO3能促进愈伤组织的增殖。继代时将激素降为IBA0.5mg·L-1、KT0.1～0.2mg·L-1,有利于胚状体发育长大。增加KNO31.9g·L-1,同时使用蔗糖和葡萄糖各15g·L-1作碳源有利于胚状体的分化。采用含0.4g·L-1活性碳的MS为成苗培养基,并结合1/6MS液培诱导生根技术,使苗粗壮易于移栽。从愈伤组织诱导至植株再生,约需5～6个月时间。     

mzhy@mail.hebau.edu.cn

 以陆地棉冀无2031无菌苗下胚轴为外植体，在MS中附加激素0.1mg/L IAA+0.1mg/L 2,4-D+0.1mg/L KT的培养基上诱导出愈伤组织。选择疏松愈伤组织继代到附加0.1mg/L ZT的培养基中，经2~3个月的继代培养诱导出颗粒状疏松胚性愈伤组织。胚性愈伤组织在无激素、每升加2g谷氨酰胺和0.5g天门冬酰胺的胚性愈伤增殖萌发培养基上培养2个月左右，可陆续形成不同时期的体胚苗。对冀无2031不同时期的体细胞萌发后的体胚苗进行观察，发现了真叶畸形苗、子叶节生根胚、胚轴侧生根胚、腋芽丛生苗和以腋     

Phenotype Variations in Plant Regeneration of Upland Cotton (Gossypium hirsutum L.)

以陆地棉冀无2031无菌苗下胚轴为外植体，在MS中附加激素0.1mg/L IAA+0.1mg/L 2,4-D+0.1mg/L KT的培养基上诱导出愈伤组织。选择疏松愈伤组织继代到附加0.1mg/L ZT的培养基中，经2~3个月的继代培养诱导出颗粒状疏松胚性愈伤组织。胚性愈伤组织在无激素、每升加2g谷氨酰胺和0.5g天门冬酰胺的胚性愈伤增殖萌发培养基上培养2个月左右，可陆续形成不同时期的体胚苗。对冀无2031不同时期的体细胞萌发后的体胚苗进行观察，发现了真叶畸形苗、子叶节生根胚、胚轴侧生根胚、腋芽丛生苗和以腋     

高频体细胞胚胎发生的优异棉花种质材料筛选

棉花的体细胞胚胎发生严重依赖于其基因型,这大大限制了细胞融合与基因工程在棉花遗传改良上的应用.为了拓展棉花体胚发生的基因型来源,本实验选择不同基因型的优异棉花品种(系)为材料,利用MSB基本培养基筛选高频体细胞胚胎发生棉花材料.结果表明,在添加2,4-D (0.1 mg/L)和KT (0.1 mg/L)的MSB培养基上所有材料都能诱导出愈伤组织,但继代3～4次后仅有大铃棉和邯8959两个材料能分化出胚性愈伤组织.在添加IBA (0.5 mg/L)和KT (0.15 mg/L)的MSB培养基上能,大铃棉和邯8959的胚性愈伤能够高频萌发形成胚状体,每克胚性愈伤组织能形成10～25个胚状体,并再生出完整植株.本研究筛选出的优异棉花种质材料大铃棉和邯8959为棉花基因工程开拓了新的种质资源.     

陇绿棉3号胚性愈伤组织的诱导及植株再生

 以陇绿棉3号为试验材料,针对从外植体培养到胚状体发生及分化成苗整个组织培养过程的不同阶段,研究探索绿色棉—陇绿棉3号的再生条件,获得再生植株,为拓宽彩色棉再生基因型和转基因研究奠定了基础。研究结果表明：陇绿棉3号外植体的最适培养条件为暗4 d/光2 d处理;愈伤组织诱导最佳激素组合为0.1 mg·L^-1 2,4-D+0.05～0.3 mg·L^-1 KT或0.1 mg·L^-1 2,4-D+0.1 mg·L^-1 KT+0.1 mg·L^-1 IAA的MSB培养基（MS培养基无机盐+B5培养基有机成分）;愈伤分化的最适条件为MSB中添加1.9 g·L^-1 KNO3和2.0 g·L^-1凝固剂gelrite;胚性愈伤增殖培养基为MSB（NH4NO3减半）中添加1.9 g·L^-1 KNO3并添加1.8 g·L^-1凝固剂gelrite、0.1 g·L^-1天冬酰胺和0.1 g·L^-1谷氨酰胺。在去除NH4NO3,添加0.1 mg·L^-1 KT和0.4 mg·L^-1 IBA的MSB培养基上,胚胎发生率和子叶胚萌发率均达到峰值,且子叶胚在1/2 MSB培养基上可成功分化成苗。     

大田棉花真叶叶柄组织培养特性研究

 利用已建立的叶柄组织培养体系,对大田棉株不同发育时期、不同部位的叶柄进行组织培养研究。叶柄和无菌苗下胚轴愈伤组织诱导培养基为MSB+IAA 0.1 mg·L^-1+KT 0.1  mg·L^-1+2,4-D 0.1 mg·L^-1+Glucose 30 g·L^-1+Gel 2 g·L^-1(pH 5.8);叶柄愈伤组织分化培养基为MSB+IAA 0.05 mg·L^-1+KT 0.05 mg·L^-1+Glucose 30 g·L^-1+Gel 2 g·L^-1(pH 6.5);无菌苗愈伤组织分化培养基为MSB+IAA 0.02 mg·L^-1+KT 0.04 mg·L^-1+Glucose 30 g·L^-1+Gel 2 g·L^-1(pH 6.5)。研究发现棉花主茎叶叶柄、果枝叶叶柄、营养枝叶叶柄在愈伤组织生长速度方面有一定差异,在愈伤组织诱导和分化方面,除严重衰老叶片的叶柄外,其它部位差异不显著。不同来源的胚性愈伤组织在MSB+6-BA 0.05 mg·L^-1+KT 0.02 mg·L^-1+Sucrose 30 g·L^-1+Gel 2 g·L^-1（pH 6.5）培养基上,均能得到胚状体,并获得再生植株。可见棉花叶柄是优良的组织培养外植体。     

陆地棉原生质体培养与植株再生技术研究

 分离培养陆地棉品种ZDM-3（Gossypium hirsutum L cv ZDM-3）胚性细胞悬浮系的原生质体,通过体细胞胚胎发生成功获得再生植株。试验结果表明,植物生长调节剂组合和碳源对原生质体培养具有重要的影响,添加2,4-D + KT + 1.5%（W/V）葡萄糖+ 1.5%（W/V）麦芽糖的KM8P培养基对于陆地棉原生质体培养的效果较好。激素组合0.46 μmol·L^-1 KT + 0.45 μmol·L^-1  2,4-D诱导的愈伤组织较松软,分化潜力高;胚性愈伤组织的增殖使用0.93 μmol·L^-1 KT + 2.46 μmol·L^-1 IBA的激素组合;1.2 μmol·L^-1 IBA + 1.39 μmol·L^-1 KT有利于体细胞胚胎发生,而MSB-5 + 0.67 μmol·L^-1 KT+2.69 μmol·L^-1 NAA的培养基适合体细胞胚胎萌发和植株再生。此外,愈伤组织诱导宜用葡萄糖作为碳源,而胚性愈伤组织增殖、保存和胚状体的萌发过程宜使用麦芽糖作碳源。     

不同植物生长调节剂处理对陆地棉子叶节再生的影响

为了建立高效的棉花子叶节再生体系用于遗传转化,以3个陆地棉品种的子叶节为材料,对棉花子叶节再生体系进行了优化,特别对子叶节诱导生根进行了探讨。结果表明：在子叶节丛生芽诱导中,不同材料的最佳诱导培养基存在差异,‘百棉1号’适宜的培养基为MSB+1.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L IBA;‘百棉2号’适宜的培养基为MSB +2.5 mg/L 6-BA +2.5 mg/L KT;‘珂字312’适宜的培养基为MSB +2.0 mg/L 6-BA,每个外植体可以得到3~4个芽,且大部分芽都可以伸长。生根培养基为MSB+0.5 mg/L NAA。     

新陆早42号体细胞胚发生和植株再生

 以新陆早33号为对照研究新疆主栽品种新陆早42号的体细胞胚胎发生。研究表明,所用4种激素组合均能有效诱导愈伤组织,但二者仅在经过IBA 1.0 mg·L^-1+KT 0.5 mg·L^-1和2,4-D 0.1 mg·L^-1+KT 0.1 mg·L^-1两种激素组合诱导初生愈伤后,才能胚胎发生。新陆早42号在IBA 1.0 mg·L^-1+KT 0.5 mg·L^-1培养基上46 d就开始胚胎发生;新陆早33号则不能直接胚胎发生,需继代到MSBP培养基上培养48 d才有胚胎发生。经2,4-D 0.1 mg·L^-1+KT 0.1 mg·L^-1组合培养的愈伤均需要继代到MSBP培养基上培养才能胚胎发生,新陆早42号和新陆早33号胚胎发生的最早时间分别是71 d和81 d。胚性愈伤在铺有滤纸的MSBF培养基上分化成胚并发育成再生植株。新陆早42号在140 d有根系发育良好的能嫁接植株（株高 7～8 cm）,而新陆早33需180 d。即成功建立了新陆早42号的再生体系,且其胚胎发生能力和再生能力均优于对照。     

脱落酸对棉花体细胞胚胎发生的影响

【目的】研究脱落酸(Abscisic acid, ABA)对棉花体细胞胚胎发生过程中下胚轴脱分化和再分化的影响,优化体细胞胚胎发生体系和初步解析脱落酸调控棉花体细胞胚胎发生分子机制。【方法】以棉花品种中棉所24(CCRI 24)下胚轴为外植体,设置5个ABA浓度0、0.02、0.04、0.06、0.08μmol·L^-1,分别以A0、A1、A2、A3、A4表示,添加至MSB(MS培养基+B5维生素)培养基诱导愈伤和胚性愈伤,研究ABA对棉花下胚轴初始细胞脱分化、愈伤组织诱导和胚性愈伤组织诱导的影响。【结果】ABA促进下胚轴初始细胞脱分化;显著提高愈伤组织的脱分化率和增殖率;0.02μmol·L^-1ABA显著提高胚性愈伤分化率,0.04~0.08μmol·L^-1ABA显著降低胚性愈伤分化率。ABA处理后胚性愈伤和非胚性愈伤的增殖率均显著提高且质地受到影响。0.02~0.08μmol ABA处理下,LBD和LBD在愈伤起始期上调表达。0.02μmol·L^-1ABA处理下,在愈伤增殖早期和中期BBM、LEC1和AGL15上调表达,愈伤增殖后期FUS3、LEA、ABI3基因上调表达。【结论】脱落酸调控的棉花体细胞胚胎发生与相关标记基因的时空性表达密切相关,这些基因表达水平的增加是ABA调控愈伤和胚性愈伤分化的分子基础。     

Induction of Embryogenic Callus in Gossypium barbadense L. and Gossypium hirsutum L. by Hormone Treatments

The aim of this study was to induce embryogenic callus from various cultivars of cotton in tissue culture, so that a stable and efficient regeneration system could be developed to produce new cotton varieties for cultivation in Xinjiang. The explant materials were hypocotyls of the main cotton cultivars grown in Xinjiang, i. e. Xinhai 25, Xinhai 16, Xinluzao 39, and Xinluzao 42. We tested the effects of different combinations of two hormones (kinetin, KT; 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D) on induction of callus from these explants. Calli were produced by the explants under four different combinations of hormones in the media. The optimal hormone combination to induce callus from Gossypium hirsutum explants was 0.1 mg·L^-1 KT + 0.05 mg·L^-1 2,4-D, while that to induce callus from Gossypium barbadense explants was 0.1 mg·L^-1 KT + 0.1 mg·L^-1 2,4-D. Hormone-free medium and medium containing double to the normal concentration of KNO₃ promoted the emergence of embryogenic callus. Filter paper placed under the medium promoted somatic embryo growth and regeneration of the root system. The differentiation and embryogenesis processes occurred more rapidly in G. hirsutum explants than those in G. barbadense explants. Using this protocol, normal plantlets of these cotton cultivars with strong roots were produced within 10 to 12 months. These methods could be used to increase the number of cotton genotypes that can be regenerated in tissue culture.     

基因枪介导的海岛棉(Gossypium barbadense L.)茎尖遗传转化体系的建立

以新疆海岛棉品种新海13号的茎尖为转化受体,采用基因枪介导法,研究DNA包裹浓度、微载体种类、前渗处理时间、轰击条件、筛选方法等对茎尖转化的影响,建立了基因枪法介导的海岛棉茎尖转化体系。研究结果表明,采用1.5μg·μL-1的质粒DNA包裹1.0μm金粉微载体,前渗处理12 h,轰击压力为7.584 MPa(1100 psi),轰击距离为6 cm,后渗处理16 h,恢复处理24 h,在120 mg·L-1卡那霉素浓度下直接筛选35 d。在添加4g·L-1活性炭粒的生根培养基中诱导抗性幼苗生根,获得抗性再生植株。通过PCR和RT-PCR检测,共得到5株转抗除草剂基因EPSPS的阳性植株。该研究体系的建立为海岛棉的遗传转化奠定了基础,为海岛棉的育种工作提供了材料。