大田棉花真叶叶柄组织培养特性研究

 利用已建立的叶柄组织培养体系,对大田棉株不同发育时期、不同部位的叶柄进行组织培养研究。叶柄和无菌苗下胚轴愈伤组织诱导培养基为MSB+IAA 0.1 mg·L^-1+KT 0.1  mg·L^-1+2,4-D 0.1 mg·L^-1+Glucose 30 g·L^-1+Gel 2 g·L^-1(pH 5.8);叶柄愈伤组织分化培养基为MSB+IAA 0.05 mg·L^-1+KT 0.05 mg·L^-1+Glucose 30 g·L^-1+Gel 2 g·L^-1(pH 6.5);无菌苗愈伤组织分化培养基为MSB+IAA 0.02 mg·L^-1+KT 0.04 mg·L^-1+Glucose 30 g·L^-1+Gel 2 g·L^-1(pH 6.5)。研究发现棉花主茎叶叶柄、果枝叶叶柄、营养枝叶叶柄在愈伤组织生长速度方面有一定差异,在愈伤组织诱导和分化方面,除严重衰老叶片的叶柄外,其它部位差异不显著。不同来源的胚性愈伤组织在MSB+6-BA 0.05 mg·L^-1+KT 0.02 mg·L^-1+Sucrose 30 g·L^-1+Gel 2 g·L^-1（pH 6.5）培养基上,均能得到胚状体,并获得再生植株。可见棉花叶柄是优良的组织培养外植体。     

新陆早42号体细胞胚发生和植株再生

 以新陆早33号为对照研究新疆主栽品种新陆早42号的体细胞胚胎发生。研究表明,所用4种激素组合均能有效诱导愈伤组织,但二者仅在经过IBA 1.0 mg·L^-1+KT 0.5 mg·L^-1和2,4-D 0.1 mg·L^-1+KT 0.1 mg·L^-1两种激素组合诱导初生愈伤后,才能胚胎发生。新陆早42号在IBA 1.0 mg·L^-1+KT 0.5 mg·L^-1培养基上46 d就开始胚胎发生;新陆早33号则不能直接胚胎发生,需继代到MSBP培养基上培养48 d才有胚胎发生。经2,4-D 0.1 mg·L^-1+KT 0.1 mg·L^-1组合培养的愈伤均需要继代到MSBP培养基上培养才能胚胎发生,新陆早42号和新陆早33号胚胎发生的最早时间分别是71 d和81 d。胚性愈伤在铺有滤纸的MSBF培养基上分化成胚并发育成再生植株。新陆早42号在140 d有根系发育良好的能嫁接植株（株高 7～8 cm）,而新陆早33需180 d。即成功建立了新陆早42号的再生体系,且其胚胎发生能力和再生能力均优于对照。     

棉属G染色体组野生棉种的体细胞胚胎发生与植株再生研究

通过培养基激素配比、碳源种类等培养条件的筛选，对2个G染色体组棉种（纳尔逊氏棉，Gossypium nelsonii Fryx.；澳洲棉，Gossypium australe F. Muell.）进行体细胞培养并获得了体细胞胚，其中纳尔逊氏棉获得了再生植株，澳洲棉获得了大量的胚状体。与D染色体组棉种克劳茨基棉（Gossypium klotzschianum Anderss）相比，G染色体组棉种再生时间长，且体细胞胚畸形严重、萌发困难，但通过培养条件的调控可以得到大量胚状体和少量再生植株。激素组合0.1 mg L^-1 KT+0.1 mg L^-1 2, 4-D诱导的愈伤组织较松软，分化潜力高；胚性愈伤组织的增殖使用0.2 mg L^-1 KT+0.5 mg L^-1 IBA的激素组合；组合0.25 mg L^-1 IBA＋0.3 mg L^-1 KT有利于体细胞胚胎发生，而含激素组合MSB5+0.15 mg L^-1 KT+0.5 mg L^-1 NAA的培养基适合体细胞胚胎的萌发和植株再生。此外，愈伤组织诱导宜用葡萄糖作为碳源，而在胚性愈伤组织的增殖及保存和胚状体的萌发过程中用麦芽糖作碳源的效果更佳。     

陆地棉原生质体培养与植株再生技术研究

 分离培养陆地棉品种ZDM-3（Gossypium hirsutum L cv ZDM-3）胚性细胞悬浮系的原生质体,通过体细胞胚胎发生成功获得再生植株。试验结果表明,植物生长调节剂组合和碳源对原生质体培养具有重要的影响,添加2,4-D + KT + 1.5%（W/V）葡萄糖+ 1.5%（W/V）麦芽糖的KM8P培养基对于陆地棉原生质体培养的效果较好。激素组合0.46 μmol·L^-1 KT + 0.45 μmol·L^-1  2,4-D诱导的愈伤组织较松软,分化潜力高;胚性愈伤组织的增殖使用0.93 μmol·L^-1 KT + 2.46 μmol·L^-1 IBA的激素组合;1.2 μmol·L^-1 IBA + 1.39 μmol·L^-1 KT有利于体细胞胚胎发生,而MSB-5 + 0.67 μmol·L^-1 KT+2.69 μmol·L^-1 NAA的培养基适合体细胞胚胎萌发和植株再生。此外,愈伤组织诱导宜用葡萄糖作为碳源,而胚性愈伤组织增殖、保存和胚状体的萌发过程宜使用麦芽糖作碳源。     

新疆海岛棉的丛生芽诱导和茎尖遗传转化的研究

 以新疆海岛棉新海17号、新海14号、85H为材料,对海岛棉器官发生再生体系和遗传转化进行研究。结果表明：茎尖系统再生能力强,茎尖组培成苗率可达90.5%。在MSB5培养基中,6-BA浓度为0.5 mg ·L^-1时,芽诱导率最高;但每个外植体的出芽数所需的最佳浓度是1.5 mg·L^-1;当浓度为2.0 mg ·L^-1时,开始有抑制出芽的现象;每个外植体最多能诱导4个芽。用农杆菌介导法转化棉花的茎尖,对侵染的损伤和Kan的耐受能力强,对Kan棉花的茎尖选择压达100 mg· L^-1;抗性绿苗率可达88.9%。     

绿色棉新彩棉7号体细胞胚胎发生及其植株再生

以绿色棉新彩棉7号的子叶、下胚轴为外植体,MSB(MS培养基附加B5维生素)基本培养基附加不同激素组合,诱导愈伤组织及调控分化,通过体细胞胚胎发生方式获得再生植株.结果表明:0.1 mg· L-1 KT(Kinetin,激动素)+ 0.1 mg·L-12,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic,2,4-二氯苯氧乙酸)为诱导愈伤组织的最适植物激素组合,不同外植体处理出愈率均达到100％,但下胚轴纵切面背向培养基放置培养更有利于诱导愈伤组织形成;分化调控阶段的最佳植物激素组合为0.15 mg·L-1 KT+ 0.3 mg·L-1 IBA(Indole-3-butyric acid,吲哚丁酸),胚性愈伤分化率可达23.33％; MSB中去除NH4NO3同时KNO3加倍,附加0.5 g·L-1Asn(Asparagine,天冬酰胺)和lg· L-1 Gln(Glutamine,谷氨酰胺),胚性愈伤可进一步分化获得体细胞胚,将成熟的子叶胚接种于1/2MS获得完整的再生植株. 本研究通过体细胞胚发生途径获得了新彩棉7号的再生植株,为天然彩色棉基因工程研究奠定了一定基础.     

高频体细胞胚胎发生的优异棉花种质材料筛选

棉花的体细胞胚胎发生严重依赖于其基因型,这大大限制了细胞融合与基因工程在棉花遗传改良上的应用.为了拓展棉花体胚发生的基因型来源,本实验选择不同基因型的优异棉花品种(系)为材料,利用MSB基本培养基筛选高频体细胞胚胎发生棉花材料.结果表明,在添加2,4-D (0.1 mg/L)和KT (0.1 mg/L)的MSB培养基上所有材料都能诱导出愈伤组织,但继代3～4次后仅有大铃棉和邯8959两个材料能分化出胚性愈伤组织.在添加IBA (0.5 mg/L)和KT (0.15 mg/L)的MSB培养基上能,大铃棉和邯8959的胚性愈伤能够高频萌发形成胚状体,每克胚性愈伤组织能形成10～25个胚状体,并再生出完整植株.本研究筛选出的优异棉花种质材料大铃棉和邯8959为棉花基因工程开拓了新的种质资源.     

外源激素对棉花前期生长发育的影响

 以鲁棉28为材料,在大田条件下设置吲哚乙酸（IAA）5 mg·L^-1、10 mg·L^-1,6-苄基腺嘌呤（6-BA）50 mg·L^-1、100 mg·L^-1,赤霉素（GA）20 mg·L^-1、50 mg·L^-1 6个不同浓度水溶液处理,以清水为对照,在苗期至蕾期叶面喷施3次,研究外源激素对棉花前期生长与发育的影响。结果表明,外源激素处理后,棉花主茎纵向生长速度缓于对照,茎粗大于对照。50 mg·L^-1 GA处理的棉株出叶速度、单株叶面积高于对照。6个处理的棉株主茎功能叶叶绿素SPAD值均高于对照。不同浓度IAA、GA处理均促进棉花现蕾,其中20 mg·L^-1 GA处理棉花单株现蕾数多于对照。本试验条件下,苗期叶面喷施IAA 和GA能协调棉花营养与生殖生长,促进蕾的发育,GA处理效果优于IAA处理,其中20 mg·L^-1GA效果最佳,6-BA处理未能促进棉花现蕾。     

不同浓度激素处理对棉花愈伤组织诱导的影响

选用百棉1号的下胚轴为外植体,在MSB培养基中分别添加不同浓度组合的2,4-D、KT、IBA作为诱导培养基,以MSB为继代培养基,研究不同激素处理对棉花体细胞发生的影响.结果表明,适合百棉1号出愈2,4-D的浓度在0.05～0.1 mg/L之间:KT的浓度在0.05～0.1 mg/L之间;IBA的浓度在0～0.05 mg/L之间.通过对试验中9种不同浓度培养基的筛选,得出适宜培养基组成:MS无机盐+B5有机物+0.1 mg/L KT+0.05mg/LIBA+0.1 mg/L2,4-D(pH6.4～6.5).     

陆地棉体细胞再生植株技术的改进研究

以Coker201为材料,改进了棉花体细胞再生植株及移栽技术。MSB(MS无机盐+B5维生素)培养基附加IBA能直接诱导出胚性愈伤组织,适当浓度的KT可促进IBA的效应。最适激素组合(IBA1.0mg·L-1、KT0.5mg·L-1)能使几个陆地棉品种的下胚轴在两个月内诱导出大量胚性愈伤组织,诱导后第三个月可观察到胚状体的发生。适量的AgNO3能促进愈伤组织的增殖。继代时将激素降为IBA0.5mg·L-1、KT0.1～0.2mg·L-1,有利于胚状体发育长大。增加KNO31.9g·L-1,同时使用蔗糖和葡萄糖各15g·L-1作碳源有利于胚状体的分化。采用含0.4g·L-1活性碳的MS为成苗培养基,并结合1/6MS液培诱导生根技术,使苗粗壮易于移栽。从愈伤组织诱导至植株再生,约需5～6个月时间。     

低酚陆地棉直接体细胞胚胎发生和植株再生

选用低酚陆地棉无菌苗下胚轴为材料进行全固体组织培养,直接诱导获得了胚性愈伤组织,并进一步分化为再生植株.结果表明,激素是影响棉花直接体细胞胚胎发生的重要因素.MSB培养基中添加2,4-D有利于愈伤组织的形成,却不能直接诱导获得胚性愈伤组织.MSB培养基中添加IBA和BA也不能直接诱导获得胚性愈伤组织.MSB培养基附加适当浓度的IBA和KT能直接诱导出胚性愈伤组织.最适激素组合(1.0 mg/L IBA,0.5 mg/L KT)能使诱导棉花下胚轴产生大量胚性愈伤组织,并且在3个月内就可肉眼观察到不同发育时期的胚.MSB培养基中附加1.0 g/L谷氨酰胺和0.5 g/L天门冬酰胺有利于胚萌发成苗.本研究建立了简便高效的棉花直接体细胞胚胎发生和植株再生培养体系,从胚性愈伤组织诱导到植株再生约需5～6个月时间.     

四倍体野生棉毛棉体细胞胚胎发生与植株再生研究

通过对培养基激素配比,以及不同浓度的PEG、CuSO4和AgNO3等处理,对棉属四倍体野生棉种毛棉(G.tomentosum Nutt.Watt)进行了体细胞培养,获得了大量体细胞胚状体并实现植株再生。与四倍体陆地棉(G.hirsutum,cv.Coker 201)相比,毛棉体细胞培养难度较大,且体细胞胚畸形严重,萌发困难,但通过培养条件的调控可以得到大量胚状体和少量再生植株。试验结果表明,激素组合0.1 mg.L-1 KT+0.1 mg.L-1 2,4-D诱导的愈伤组织较松脆,分化潜力高;PEG处理不利于毛棉的胚性和非胚性愈伤的诱导,而不同浓度的CuSO4和AgNO3处理对于体细胞胚状体诱导和萌发以及植株再生效果有明显差异。其中3.5 mg.L-1 CuSO4+0.5 mg.L-1IBA+0.2 mg.L-1 KT和3 mg.L-1 AgNO3+0.5 mg.L-1 IBA+0.2 mg.L-1 KT组合利于胚性愈伤的增殖和体细胞胚的萌发。     

不同植物生长调节剂处理对陆地棉子叶节再生的影响

为了建立高效的棉花子叶节再生体系用于遗传转化,以3个陆地棉品种的子叶节为材料,对棉花子叶节再生体系进行了优化,特别对子叶节诱导生根进行了探讨。结果表明：在子叶节丛生芽诱导中,不同材料的最佳诱导培养基存在差异,‘百棉1号’适宜的培养基为MSB+1.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L IBA;‘百棉2号’适宜的培养基为MSB +2.5 mg/L 6-BA +2.5 mg/L KT;‘珂字312’适宜的培养基为MSB +2.0 mg/L 6-BA,每个外植体可以得到3~4个芽,且大部分芽都可以伸长。生根培养基为MSB+0.5 mg/L NAA。     

冬小麦遗传再生体系及根癌农杆菌介导的转化研究

摘要:以冬小麦品种临优145的幼胚为外植体,消毒后用解剖刀挑取幼胚,盾片朝上接种于MS+2,4-D 2 mg/L+肌醇100 mg/L＋MES 400 mg/L＋CH 100 mg/L[7]＋40g/L麦芽糖＋8g/L琼脂的培养基中诱导愈伤组织, 每两周继代一次,将诱导出的淡黄色、颗粒状Ⅱ型胚性愈伤组织接种于分化培养基（MS+ZT 1 mg/L+IAA 1mg/L+ MES 400 mg/L＋CH 100 mg/L+麦芽糖40g/L+gelrite 2.6g/L,PH5.8）上培养2－3周,然后转接到再生培养基(1/10MS+NAA 0.5mg/L+KT 0.5mg/L+蔗糖30g/L+ gelrite 2.6g/L,PH5.8)中进行再生成苗。接种1229块幼胚,得到987块愈伤组织, Hyg抗性愈伤组织123块,抗性再生植株34株。在建立了再生体系的基础上,用根癌农杆菌介导法将GUS基因导入幼胚愈伤组织,抗性植株的PCR检测呈阳性。X－gluc染色表明, 少部分愈伤组织出现肉眼可见的蓝色晕斑,说明GUS基因已经在小麦幼胚愈伤组织中表达。     

陆地棉体细胞植株再生及其移栽技术研究

以7个陆地棉（Gossypium hirsutum L.）品种为材料，对体细胞植株再生及移栽技术进行了研究。在含IAA和KT和0.5ppm的MSB培养基上，Coker312、Coker201、鲁棉1024、冀合3016和河南79等5个品种能形成数量不等的胚性愈伤组织，中棉12和邯郸14的愈伤组织继代后便褐化死亡。胚性愈伤组织振荡培养1个月以上转移到成熟培养基上获得大     

硝普钠缓解花生铝毒害作用和影响AhSAG和AhBI-1基因表达

以花生为材料，研究了铝胁迫诱导花生发生细胞程序性死亡的条件下，加入外源NO供体SNP对不同耐性花生品种根尖生长及相关细胞程序性死亡基因的影响。根长生长、根尖苏木精染色和铝含量测定结果表明，适当浓度的SNP能够缓解一定浓度铝对花生根生长的毒害作用，1.0 mmol L^–1的SNP缓解作用最明显，此浓度下，99-1507和中花2号与对照相比，根长增加45%和52%，根尖铝含量降低10%和23%，苏木精染色变浅。加入1.0 mmol L^–1的SNP处理后，与对应铝胁迫相比，花生衰老基因AhSAG的相对表达量在耐铝品种99-1507中先升高后降低，在0.1 mmol L^–1和0.4 mmol L^–1 Al³⁺处理时，显著下降；在铝敏感品种中花2号中呈缓慢升高的趋势，在0.1 mmol L^–1和0.4 mmol L^–1 Al³⁺处理时，显著上升；花生细胞程序性死亡相关基因AhBI-1的相对表达量在99-1507中呈先升高后降低的趋势，在中花2号中则先降低后升高，当99-1507在0和0.02 mmol L^–1 Al³⁺处理时，中花2号在0、0.02和0.1 mmol L^–1 Al³⁺处理时，SNP处理后的AhBI-1表达量均低于对应的单独铝处理。由此说明，NO对花生铝毒害有一定的缓解作用，其作用机理可能与影响细胞程序性死亡基因表达而调控细胞程序性死亡有关。     

宁夏优质水稻品种D10高效再生体系的建立

为了利用基因沉默技术定向改良宁夏香稻品种,短期内建立可获得成苗的高效成熟胚再生体系,以宁夏优质水稻品种D10成熟胚作为外植体,通过植物组织培养的方法,研究了培养基、外源激素、光照和温度对外植体培养及再生的影响。结果表明：不同培养基对愈伤组织诱导率有着不同的影响,MS培养基最低,N6D培养基最高;32℃持续光照培养的愈伤组织明显优于30℃ 12 h/d光照培养;在分化培养基中添加TDZ,发现浓度为1 mg/L的TDZ与低浓度的IAA结合使绿苗分化率提高到100%;另外添加2 mg/L ABA的N6D培养基中愈伤组织诱导率为100%。最终该品种的最优再生体系为：32℃持续光照培养并添加ABA 2 mg/L的N6D培养基;分化培养基为B5+TDZ 1mg/L+IAA 0.2mg/L;生根培养基为1/2MS+KT 2 mg/L+NAA 0.2 mg/L+CH 2 g/L+Sorb 30 g/L。本研究建立了宁夏优质水稻品种D10成熟胚再生体系。     

盐胁迫条件下外源Ca2+对蚕豆气孔运动及质膜K+通道的调控

研究了Ca²⁺ 对NaCl胁迫下蚕豆气孔运动及质膜K+通道的影响。结果表明,100 mmol L^-1 NaCl可明显诱导气孔开放,该现象可被10 mmol L^-1 CaCl₂ 显著抑制。为探讨盐胁迫下Ca²⁺对K⁺和Na⁺跨膜运输的调控机制,我们利用膜片钳技术记录全细胞K⁺ 电流发现,在100 mmol L^-1 NaCl胁迫下,加入10 mmol L^-1 CaCl₂胞外处理,显著抑制质膜K+内向及外向通道电流,这种抑制可被1 mmol L^-1 La³⁺ (Ca²⁺通道抑制剂)缓解。非盐胁迫下,10 mmol L^-1 CaCl₂ 胞外处理也能显著抑制质膜内向K⁺通道,但明显激活其外向通道,加入1 mmol L^-1 La³⁺并不能被缓解。用H₂O₂专一的荧光探针二氯荧光素二乙酸酯(H2DCF-DA)单细胞分析保卫细胞内H₂O₂含量变化显示,在100 mmol L^-1 NaCl盐胁迫下,10 mmol L^-1 CaCl₂ 处理明显诱导H₂O₂在保卫细胞中积累;100 mmol L^-1 NaCl和10 mmol L^-1 CaCl₂单独处理并不能诱导H₂O₂积累。推测Ca²⁺在盐胁迫下可能先诱导H₂O₂在胞内积累,进而激活质膜Ca²⁺通道,迅速提高胞内Ca²⁺浓度以抑制Na⁺通过质膜K⁺通道跨膜内流,同时调节Na⁺外流,两种效应共同作用促使气孔关闭,减少盐胁迫下水分的过度散失。上述结果将为Ca²⁺调控作物抗盐机制研究提供新的思路。     

陆地棉抗病品种中521植株再生的研究

以农艺性状优良且抗枯黄萎病的陆地棉品种中521的下胚轴为外植体,采用固液结合的体细胞培养方法建立细胞悬浮系并进行植株再生的研究。结果表明,愈伤组织的诱导以MS 1.0 mg.L-1IBA 0.05 mg.L-1KT 0.1 mg.L-12,4-D 30g.L-1葡萄糖的固体培养基为最佳;体细胞胚的形成以MS 0.01 mg.L-1IBA 0.01 mg.L-1KT 0.005 mg.L-12,4-D 1.0g.L-1谷氨酰胺的液体培养基为最佳,悬浮30 d后可以发现体细胞胚的形成。之后转接入四种不同的MSB固体培养基上诱导再生植株形成,发现MSB 2 g.L-1谷氨酰胺 0.5 g.L-1天冬酰胺 30g.L-1蔗糖 6.0 g.L-1琼脂为最佳培养基,且发现此方法比全程固体培养缩短了体细胞再生的周期,此品种在本研究建立的再生体系下植株再生周期为6个月左右。     

响应面优化棉子饼粕中棉酚的提取条件

 采用响应曲面法的Box-Behnken模式,以盐酸和80%乙醇混合溶液作为提取液浸提棉子饼粕中棉酚工艺条件进行了研究,并建立提取棉酚的二次多项数学模型,探讨了主要因素的影响效应及其交互作用。采用响应曲面法优化得出的最佳工艺条件为：浸提温度60℃,提取液用量为26 mL·g^-1,盐酸浓度为1 mol·L^-1,浸提时间为3.6 h,提取次数1次时,提取量为8.80 mg·g^-1。