陆地棉原生质体培养与植株再生技术研究

 分离培养陆地棉品种ZDM-3（Gossypium hirsutum L cv ZDM-3）胚性细胞悬浮系的原生质体,通过体细胞胚胎发生成功获得再生植株。试验结果表明,植物生长调节剂组合和碳源对原生质体培养具有重要的影响,添加2,4-D + KT + 1.5%（W/V）葡萄糖+ 1.5%（W/V）麦芽糖的KM8P培养基对于陆地棉原生质体培养的效果较好。激素组合0.46 μmol·L^-1 KT + 0.45 μmol·L^-1  2,4-D诱导的愈伤组织较松软,分化潜力高;胚性愈伤组织的增殖使用0.93 μmol·L^-1 KT + 2.46 μmol·L^-1 IBA的激素组合;1.2 μmol·L^-1 IBA + 1.39 μmol·L^-1 KT有利于体细胞胚胎发生,而MSB-5 + 0.67 μmol·L^-1 KT+2.69 μmol·L^-1 NAA的培养基适合体细胞胚胎萌发和植株再生。此外,愈伤组织诱导宜用葡萄糖作为碳源,而胚性愈伤组织增殖、保存和胚状体的萌发过程宜使用麦芽糖作碳源。     

四倍体野生棉毛棉体细胞胚胎发生与植株再生研究

通过对培养基激素配比,以及不同浓度的PEG、CuSO4和AgNO3等处理,对棉属四倍体野生棉种毛棉(G.tomentosum Nutt.Watt)进行了体细胞培养,获得了大量体细胞胚状体并实现植株再生。与四倍体陆地棉(G.hirsutum,cv.Coker 201)相比,毛棉体细胞培养难度较大,且体细胞胚畸形严重,萌发困难,但通过培养条件的调控可以得到大量胚状体和少量再生植株。试验结果表明,激素组合0.1 mg.L-1 KT+0.1 mg.L-1 2,4-D诱导的愈伤组织较松脆,分化潜力高;PEG处理不利于毛棉的胚性和非胚性愈伤的诱导,而不同浓度的CuSO4和AgNO3处理对于体细胞胚状体诱导和萌发以及植株再生效果有明显差异。其中3.5 mg.L-1 CuSO4+0.5 mg.L-1IBA+0.2 mg.L-1 KT和3 mg.L-1 AgNO3+0.5 mg.L-1 IBA+0.2 mg.L-1 KT组合利于胚性愈伤的增殖和体细胞胚的萌发。     

陇绿棉3号胚性愈伤组织的诱导及植株再生

 以陇绿棉3号为试验材料,针对从外植体培养到胚状体发生及分化成苗整个组织培养过程的不同阶段,研究探索绿色棉—陇绿棉3号的再生条件,获得再生植株,为拓宽彩色棉再生基因型和转基因研究奠定了基础。研究结果表明：陇绿棉3号外植体的最适培养条件为暗4 d/光2 d处理;愈伤组织诱导最佳激素组合为0.1 mg·L^-1 2,4-D+0.05～0.3 mg·L^-1 KT或0.1 mg·L^-1 2,4-D+0.1 mg·L^-1 KT+0.1 mg·L^-1 IAA的MSB培养基（MS培养基无机盐+B5培养基有机成分）;愈伤分化的最适条件为MSB中添加1.9 g·L^-1 KNO3和2.0 g·L^-1凝固剂gelrite;胚性愈伤增殖培养基为MSB（NH4NO3减半）中添加1.9 g·L^-1 KNO3并添加1.8 g·L^-1凝固剂gelrite、0.1 g·L^-1天冬酰胺和0.1 g·L^-1谷氨酰胺。在去除NH4NO3,添加0.1 mg·L^-1 KT和0.4 mg·L^-1 IBA的MSB培养基上,胚胎发生率和子叶胚萌发率均达到峰值,且子叶胚在1/2 MSB培养基上可成功分化成苗。     

绿色棉新彩棉7号体细胞胚胎发生及其植株再生

以绿色棉新彩棉7号的子叶、下胚轴为外植体,MSB(MS培养基附加B5维生素)基本培养基附加不同激素组合,诱导愈伤组织及调控分化,通过体细胞胚胎发生方式获得再生植株.结果表明:0.1 mg· L-1 KT(Kinetin,激动素)+ 0.1 mg·L-12,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic,2,4-二氯苯氧乙酸)为诱导愈伤组织的最适植物激素组合,不同外植体处理出愈率均达到100％,但下胚轴纵切面背向培养基放置培养更有利于诱导愈伤组织形成;分化调控阶段的最佳植物激素组合为0.15 mg·L-1 KT+ 0.3 mg·L-1 IBA(Indole-3-butyric acid,吲哚丁酸),胚性愈伤分化率可达23.33％; MSB中去除NH4NO3同时KNO3加倍,附加0.5 g·L-1Asn(Asparagine,天冬酰胺)和lg· L-1 Gln(Glutamine,谷氨酰胺),胚性愈伤可进一步分化获得体细胞胚,将成熟的子叶胚接种于1/2MS获得完整的再生植株. 本研究通过体细胞胚发生途径获得了新彩棉7号的再生植株,为天然彩色棉基因工程研究奠定了一定基础.     

新陆早42号体细胞胚发生和植株再生

 以新陆早33号为对照研究新疆主栽品种新陆早42号的体细胞胚胎发生。研究表明,所用4种激素组合均能有效诱导愈伤组织,但二者仅在经过IBA 1.0 mg·L^-1+KT 0.5 mg·L^-1和2,4-D 0.1 mg·L^-1+KT 0.1 mg·L^-1两种激素组合诱导初生愈伤后,才能胚胎发生。新陆早42号在IBA 1.0 mg·L^-1+KT 0.5 mg·L^-1培养基上46 d就开始胚胎发生;新陆早33号则不能直接胚胎发生,需继代到MSBP培养基上培养48 d才有胚胎发生。经2,4-D 0.1 mg·L^-1+KT 0.1 mg·L^-1组合培养的愈伤均需要继代到MSBP培养基上培养才能胚胎发生,新陆早42号和新陆早33号胚胎发生的最早时间分别是71 d和81 d。胚性愈伤在铺有滤纸的MSBF培养基上分化成胚并发育成再生植株。新陆早42号在140 d有根系发育良好的能嫁接植株（株高 7～8 cm）,而新陆早33需180 d。即成功建立了新陆早42号的再生体系,且其胚胎发生能力和再生能力均优于对照。     

大田棉花真叶叶柄组织培养特性研究

 利用已建立的叶柄组织培养体系,对大田棉株不同发育时期、不同部位的叶柄进行组织培养研究。叶柄和无菌苗下胚轴愈伤组织诱导培养基为MSB+IAA 0.1 mg·L^-1+KT 0.1  mg·L^-1+2,4-D 0.1 mg·L^-1+Glucose 30 g·L^-1+Gel 2 g·L^-1(pH 5.8);叶柄愈伤组织分化培养基为MSB+IAA 0.05 mg·L^-1+KT 0.05 mg·L^-1+Glucose 30 g·L^-1+Gel 2 g·L^-1(pH 6.5);无菌苗愈伤组织分化培养基为MSB+IAA 0.02 mg·L^-1+KT 0.04 mg·L^-1+Glucose 30 g·L^-1+Gel 2 g·L^-1(pH 6.5)。研究发现棉花主茎叶叶柄、果枝叶叶柄、营养枝叶叶柄在愈伤组织生长速度方面有一定差异,在愈伤组织诱导和分化方面,除严重衰老叶片的叶柄外,其它部位差异不显著。不同来源的胚性愈伤组织在MSB+6-BA 0.05 mg·L^-1+KT 0.02 mg·L^-1+Sucrose 30 g·L^-1+Gel 2 g·L^-1（pH 6.5）培养基上,均能得到胚状体,并获得再生植株。可见棉花叶柄是优良的组织培养外植体。     

两个新疆棉花品种体细胞胚胎发生的比较研究

以新疆棉区主栽品种新陆早33号和新彩棉7号为实验材料,比较不同激素组合对两者体细胞胚胎发生过程的影响,以建立高效再生体系。结果表明,新陆早33号和新彩棉7号在2,4-D+KT的激素组合下出愈率均为100%,降低2,4-D浓度有利于胚性愈伤组织的分化,分化率分别达到60.0%和7.5%;在IBA+KT的激素组合下出愈情况相对较差,分别为72.5%和85.0%;继代几次后,两个品种的胚性愈伤组织分化率可分别达到45%和55%,新陆早33号和新彩棉7号分别在DK和IK激素组合下更有利于体细胞胚胎发生过程。进一步观察发现,新彩棉7号分化形成胚状体的能力比新陆早33号更强,两品种均能在6个月内获得再生植株。再生体系的建立,为新疆棉花开展分子育种工作奠定了基础。     

新疆棉花4个主栽品种的体细胞胚胎发生及植株再生

以新疆4个主栽棉花品种新陆中20、新陆早24、新陆早33和03298为材料, 通过不同浓度的激素组合成功地诱导获得了体细胞胚并进一步发育成苗。研究发现, 所用的4种激素组合均能有效诱导愈伤组织, 其中又以0.02 mg L^-1或0.10 mg L^-1 KT和0.1 mg L^-1 2,4-D组合的诱导效果最佳; 两个诱导措施有利于胚性愈伤组织的产生, 即沿中柱纵切棉花下胚轴切段, 并以纵切面接触培养基; 愈伤组织诱导培养基中KNO₃用量加倍。挑选黄绿色、灰绿色或浅绿色的质地疏松的愈伤组织继代于无激素且KNO₃含量加倍的培养基中可产生胚性愈伤组织, 并在高比例KT/2, 4-D(0.05 mg L^-1或0.10 mg L^-1 KT和0.01 mg L^-1 2,4-D)促进下发育成胚。借助在培养基上垫滤纸产生干燥作用, 并间隔使用强透气效果的棉塞对培养三角瓶进行透气处理, 体细胞胚可成熟发育并产生根系发达的正常再生植株。应用此法, 4个实验材料在6~8个月内即可获得大量再生苗。     

mzhy@mail.hebau.edu.cn

 以陆地棉冀无2031无菌苗下胚轴为外植体，在MS中附加激素0.1mg/L IAA+0.1mg/L 2,4-D+0.1mg/L KT的培养基上诱导出愈伤组织。选择疏松愈伤组织继代到附加0.1mg/L ZT的培养基中，经2~3个月的继代培养诱导出颗粒状疏松胚性愈伤组织。胚性愈伤组织在无激素、每升加2g谷氨酰胺和0.5g天门冬酰胺的胚性愈伤增殖萌发培养基上培养2个月左右，可陆续形成不同时期的体胚苗。对冀无2031不同时期的体细胞萌发后的体胚苗进行观察，发现了真叶畸形苗、子叶节生根胚、胚轴侧生根胚、腋芽丛生苗和以腋     

低酚陆地棉直接体细胞胚胎发生和植株再生

选用低酚陆地棉无菌苗下胚轴为材料进行全固体组织培养,直接诱导获得了胚性愈伤组织,并进一步分化为再生植株.结果表明,激素是影响棉花直接体细胞胚胎发生的重要因素.MSB培养基中添加2,4-D有利于愈伤组织的形成,却不能直接诱导获得胚性愈伤组织.MSB培养基中添加IBA和BA也不能直接诱导获得胚性愈伤组织.MSB培养基附加适当浓度的IBA和KT能直接诱导出胚性愈伤组织.最适激素组合(1.0 mg/L IBA,0.5 mg/L KT)能使诱导棉花下胚轴产生大量胚性愈伤组织,并且在3个月内就可肉眼观察到不同发育时期的胚.MSB培养基中附加1.0 g/L谷氨酰胺和0.5 g/L天门冬酰胺有利于胚萌发成苗.本研究建立了简便高效的棉花直接体细胞胚胎发生和植株再生培养体系,从胚性愈伤组织诱导到植株再生约需5～6个月时间.     

Induction of Embryogenic Callus in Gossypium barbadense L. and Gossypium hirsutum L. by Hormone Treatments

The aim of this study was to induce embryogenic callus from various cultivars of cotton in tissue culture, so that a stable and efficient regeneration system could be developed to produce new cotton varieties for cultivation in Xinjiang. The explant materials were hypocotyls of the main cotton cultivars grown in Xinjiang, i. e. Xinhai 25, Xinhai 16, Xinluzao 39, and Xinluzao 42. We tested the effects of different combinations of two hormones (kinetin, KT; 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D) on induction of callus from these explants. Calli were produced by the explants under four different combinations of hormones in the media. The optimal hormone combination to induce callus from Gossypium hirsutum explants was 0.1 mg·L^-1 KT + 0.05 mg·L^-1 2,4-D, while that to induce callus from Gossypium barbadense explants was 0.1 mg·L^-1 KT + 0.1 mg·L^-1 2,4-D. Hormone-free medium and medium containing double to the normal concentration of KNO₃ promoted the emergence of embryogenic callus. Filter paper placed under the medium promoted somatic embryo growth and regeneration of the root system. The differentiation and embryogenesis processes occurred more rapidly in G. hirsutum explants than those in G. barbadense explants. Using this protocol, normal plantlets of these cotton cultivars with strong roots were produced within 10 to 12 months. These methods could be used to increase the number of cotton genotypes that can be regenerated in tissue culture.     

Research in Tissue Culture of Diploid Cotton Species

Diploid cotton species provide parental (ancestral) species for tetraploid cultivars and are the key germplasm resources for cotton genetic improvement. In addition, diploid cotton species supply excellent materials for mutant library construction and functional genomics. Diploid cotton species originated from Asia- Africa, America, Oceania regions with rich genetic diversity. The tissue culture research mainly involves regeneration of plant organs and cell culture, protoplast culture, somatic culture and fusion. The regenerated plants have been obtained in Gossypium klotzschianum, G. gossypioides, G. arboreum, G. davidsonii, G. raimondii, G. stocksii, G. nelsonii, G. bickii, etc. Among them, regenerated plants in shoot tip culture were only obtained in G. arboreum, G. bickii. Regenerated plantlets in protoplast culture were obtained in G. klotzschianum, G. davidsonii. Interspecific hybrids between G. hirsutum and diploid cotton of G. klotzschianum, G. stocksii and G. bickii were obtained, respectively. The tissue culture systems of diploid cotton were different from each other, and the strategy is similar to that in woody plants. This paper summarized the progresses in related researches and discussed the future research.     

五个澳洲野生棉种的核型研究

对斯特提棉（Ｇ．ｓｔｕｒｔｉａｎｕｍ）、南岱华棉（Ｇ．ｎａｎｄｅｗａｒｅｎｓｅ）、澳洲棉（Ｇ．ａｕｓｔｒａｌｅ）、纳尔逊氏棉（Ｇ．ｎｅｌｓｏｎｉ）和比克氏棉（Ｇ．ｂｉｃｋｉ）五个澳洲野生棉种的染色体核型进行了分析研究。结果表明，五个澳洲野生棉种的核型比较相似，均有两对随体染色体，种间的核型重合率均大于８５％，其中斯特提棉与南岱华棉、澳洲棉与纳尔逊氏棉，及其比克氏棉与澳洲棉或纳尔逊氏棉之间的核型重合率大于９０％。此外，本文对比克氏棉的系统发育和染色体组划分等问题进行了讨论。     

海岛棉愈伤组织诱导及分化的影响因素初探

本研究以新疆自育海岛棉品种新海16无菌苗下胚轴为外植体材料,进行愈伤组织诱导、分化及再生植株的初步研究,筛选出适合于海岛棉体细胞胚胎再生的培养体系。结果表明,最佳诱导愈伤组织及分化配方为MSB附加0.1mg/L2,4-D及0.05mg/LKT,分化率达到88%;于MSB1附加0.01mg/LKT及0.3mg/LNAA中对胚性愈伤组织进行增值培养;由MSB2附加0.1mg/LIBA中可分化出成熟体细胞胚胎及再生植株,分化率达73%。本研究通过体细胞胚胎发生途径获得了海岛棉再生植株,为海岛棉遗传转化体系的建立及分子育种奠定了基础。     

澳洲野生棉种的子叶棉酚动态及与色素腺体形态的关系

对斯特提棉、南岱华棉、澳洲棉、纳尔逊氏棉和比克氏棉五个澳洲野生棉种在种子萌发过程中的子叶棉酚含量进行了测定和分析。结果表明,五个澳洲野生棉种子叶中的棉酚积累过程与无色素腺体陆地棉品种基本相似,其休眠种子和萌发２４ｈ以内的子叶均检测不到棉酚,为典型的低酚棉类型。当种子萌发４８ｈ以后,其子叶开始出现棉酚,但含量极低;在子叶开始出现棉酚１～２ｄ后,棉酚含量开始迅速增加,到种子萌发第９ｄ达到最大值。此外,讨论了澳洲野生棉种的子叶色素腺体延缓形成的组织结构与棉酚积累的关系,以及该性状的遗传调控机理等。     

长江和黄河流域棉区棉花品种体细胞胚胎发生和植株再生比较研究

选用我国长江和黄河流域棉区各10个棉花品种以及珂字201和YZ1共22个基因型,研究和优化棉花体细胞胚胎发生的相关条件参数。在此基础上,比较了两生态区棉花品种的体细胞再生能力。结果表明, 在IBA+KT的激素组合下,多数基因型有较强再生能力;在愈伤组织诱导时期,铵态氮是必需的,而在愈伤组织继代分化时期,一定浓度的硝态氮则能促进分化;没有铁盐不能诱导出愈伤组织,而铁盐浓度为56 mg L^-1时有利于胚分化;长江流域和黄河流域棉花品种的植株再生潜力没有明显差别,但长江流域的品种体细胞胚胎发生所需的时间长。本文首次获得了鄂抗棉3号、5号、鄂棉20、鄂棉23、豫棉9号、豫早73、豫棉12、豫棉1221等8个品种的体细胞胚胎发生和植株再生。     

澳洲棉种遗传多样性的RAPD分析

利用ＲＡＰＤ（ＲａｎｄｏｍｌｙＡｍｐｌｉｆｉｅｄＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ）对斯特提棉（Ｇ．ｓｔｕｒｔｉａｎｕｍ）、南岱华棉（Ｇ．ｎａｎｄｅｗａｒｅｎｓｅ）、鲁滨逊氏棉（Ｇ．ｒｏｂｉｎｓｏｎｉ）、澳洲棉（Ｇ．ａｕｓｔｒａｌｅ）、比克氏棉（Ｇ．ｂｉｃｋｉ）和奈尔逊氏棉（Ｇ．ｎｅｌｓｏｎｉ）进行了研究，结果表明：６个澳洲棉种具有丰富的遗传多样性，在这６个澳洲棉种中，澳洲棉与鲁滨逊氏棉、南岱华棉与斯特提棉具有较近的亲缘关系。聚类分析发现，鲁宾逊氏棉和比克氏棉是两个较为特殊的棉种。此外，本文对比克氏棉和木槿组（Ｈｉｂｉｓ－ｃｏｉｄｅａ）的其它棉种的染色体组的归属问题进行了讨论     

五个澳洲野生棉种色素腺体和棉酚性状研究

本文研究了斯特提棉（Ｇ．ｓｔｕｒｔｉａｎｕｍ）、南岱华棉（Ｇ．ｎａｎｄｅｗａｒｅｎｓｅ）、澳洲棉（Ｇ．ａｕｓ－ｔｒａｌｅ）、纳尔逊氏棉（Ｇ．ｎｅｌｓｏｎｉ）和比克氏棉（Ｇ．ｂｉｃｋｉ）五个澳洲野生棉种的种仁和植株各主要器官的色素腺体和棉酚及其旋光体含量。结果表明，五个棉种均具有种子无色素腺体、植株有色素腺体的特性，但五个棉种植株各器官上色素腺体的分布差异较大，特别是花瓣，其中斯特提棉和南岱华棉的花瓣具有正常的色素腺体，比克氏棉和澳洲棉的花瓣具有少量的色素腺体，纳尔逊氏棉的花瓣无色素腺体。五个棉种种仁棉酚含量极低，但植株各器官均含有较高的棉酚；棉酚旋光体含量测定结果表明，五个棉种的叶片中均只有左旋棉酚，而不含右旋棉酚，其中斯特提棉和南岱华棉两个种的左旋棉酚含量显著低于其余三个棉种     

基因型对陆地棉花药离体培养反应的影响

对２７种棉花基因型的花药在离体培养中的反应进行了比较,结果表明：所有的基因型在合适的培养条件下均能高频率地形成愈伤组织,但不同基因型间愈伤组织诱导率和诱导量不同;再生植株的花药比原始亲本的花药易诱导出愈伤组织;品种间杂种表现出部分优势,但不明显。本试验中,仅鲁棉６号和Ｓｉｏｋｒａ１－３两个品种诱导获得了胚性愈伤组织、胚状体和再生植株,且二者之间也存在着差别。从基因型在棉花花药培养中的效应、外界调控对棉花不同基因型花药培养效果的影响、棉花花药培养与体细胞培养基因型差异的比较等三个方面进行了讨论,提出了棉花花药培养愈伤组织诱导和植株再生是受两套遗传基因控制的遗传性状,并提出了棉花组织培养植株再生的阈值问题     

澳洲野生棉种子叶色素腺体延缓形成的组织结构观察

对５个澳洲野生棉种休眠种子、种子发育过程中的子叶和种子萌发过程中的子叶进行连续切片观察,并以比克氏棉为例进行透视电镜观察。结果表明,具有子叶色素腺体延缓形成性状的澳洲野生棉种及其杂交后代的休眠种子,虽肉眼看不到色素腺体,但具有一群不同于其它细胞的特殊细胞群,其整体结构类似色素腺体的雏形。因此,提出了“色素腺体原”的新概念。澳洲野生棉种在开花后的幼胚器官形态建成期均先出现色素腺体细胞,然后经数次分裂形成一团色素腺体细胞群,挤压周围细胞而形成为色素腺体原,并保持该结构至种子成熟。当种子萌发１６ｈ后,色素腺体细胞解体,形成色素腺体。此外,本研究对澳洲野生棉种子叶色素腺体延缓形成性状的遗传调控等问题进行了讨论。