microRNA-let-7家族在约克夏猪甲状腺生长发育过程中的表达分析

miR-let-7广泛参与动物组织器官发育调控,是研究猪甲状腺发育的重要候选miRNAs。为了研究miR-let-7家族在约克夏猪(Sus scrofa)甲状腺生长发育过程中的作用,本实验一方面通过对不同发育阶段(胚龄105,出生后60、90、150日龄)的猪甲状腺组织切片进行苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE),研究甲状腺发育形态学的变化;另一方面,采用原位杂交(in situ hybridization,ISH)和荧光定量PCR技术鉴定miR-let-7家族在不同生长阶段(胚龄105,出生后60、90、150日龄)约克夏猪甲状腺中的表达。HE染色结果发现,甲状腺滤泡随着日龄的增加逐渐增大。原位杂交结果显示,miR-let-7主要位于甲状腺的滤泡上皮细胞中,并且let-7的表达在出生后有先减少后增加的态势。通过荧光定量PCR结果发现,在生长期随着日龄的增加,let-7d-5p、let-7f和let-7g的相对表达量逐渐上升,let-7c、let-7d-3p、let-7e和let-7i的表达先升后降。研究结果提示,约克夏猪甲状腺miR-let-7的表达直接或间接影响甲状腺激素水平的变化,在甲状腺生长发育中发挥了重要的作用,为深入研究猪的生长发育提供了一个新的思路。     

阉割对金华猪甲状腺球蛋白(TG)和甲状腺过氧化酶(TPO)基因表达的影响

采用荧光定量PCR技术分析阉割与非阉割金华猪甲状腺组织中甲状腺球蛋白(TG)和甲状腺过氧化酶(TPO)基因在60、90和120日龄时表达水平.结果表明:(1)组内日龄间比较,阉割组猪TG和TPO基因在90日龄时的表达量均显著高于60和120日龄(P＜0.05);非阉割组猪TG基因在120日龄时的表达量显著低于60和90日龄(P＜0.05),TPO基因在不同日龄间的表达量差异不显著(P＞0.05).(2)组间同日龄比较,发现阉割后TG和TPO基因在60,90和120日龄的表达量都显著高于或低于非阉割组(P＜0.05).研究结果提示,阉割后,TG和TPO基因表达量的升高可能会加快猪的生长发育和提高猪肉的肌内脂肪含量.     

大白猪二脂酰甘油酰基转移酶1和2基因(DGAT1和DGAT2)发育性表达特点及其与背膘厚的关联分析

二脂酰甘油基转移酶(acryl CoA:diacylglycerol acyltransferase,DGAT)在细胞甘油脂类的代谢中起着重要的中心作用.本研究应用荧光定量PCR技术,研究了在60、90和120日龄,二脂酰甘油酰基转移酶l和2(DGAT1和DGAT2)基因在大白猪肝脏、皮下脂肪和眼肉中的表达特点,并将组织表达谱与肩部、6～7肋处、胸腰椎接合处和腰荐接合处4个部位的背膘厚进行了关联分析.结果表明,大白猪DGA T1在不同日龄的表达差异均不显著(P＞0.05),但DGA T2在60和90日龄的表达差异极显著(P＜0.01).对不同组织DGA T1和DGA T2的表达量分析,DGAT1表达量在肝脏中最高,皮脂次之;DGAT2表达量在皮脂中最高,肝脏次之;眼肉的DGAT1和DGA T2表达量最低.关联分析结果表明,在肝脏中DGA T1表达量与第6～7肋背膘厚(r=0.71,P＜0.01)和胸腰椎接合处背膘厚(r=0.62,P＜0.01)呈极显著的正相关,在皮脂中DGA T2表达量与前背膘厚呈显著的负相关(r= -0.46,P＜0.05)、与第6～7肋背膘厚呈显著的正相关(r=0.49,P＜0.05).研究结果提示,DGA T2基因在2个日龄的表达以及DGAT1和DGA T2基因在3个组织中的相对表达水平均存在差异,并且与部分背膘厚相关显著,可考虑将DGA T1和DGA T2基因作为大白猪背膘厚选育的候选基因.     

牛肌细胞生成素基因(MyoG)启动子的活性及组织特异性分析

肌细胞生成素(myogenin,MyoG)在肌肉细胞分化过程中起着中心调控的作用。为了研究牛(Bos)MyoG基因启动子的启动效率和组织特异性。本研究首先克隆了牛MyoG基因启动子区域,以pDsRed2载体为外源载体,红色荧光蛋白为目的基因,构建了pDsRed-BosMyoG真核表达载体。利用脂质体介导转染体外培养的绵羊(Ovis aries)骨骼肌卫星细胞和成纤维细胞,最后通过实时定量PCR和Western blot检测红色荧光蛋白的表达,从而确定牛MyoG基因启动子的启动效率及组织特异性。结果显示,pDsRed-BosMyoG转染绵羊骨骼肌卫星细胞后在显微镜下可观察到红色荧光蛋白的表达,但在转染后的成纤维细胞中并没有观察到红色荧光蛋白的表达。在mRNA水平上,转基因骨骼肌卫星细胞中红色荧光蛋白mRNA表达量明显高于转基因成纤维细胞(P0.01)。Western blot结果显示,转基因骨骼肌卫星中高表达红色荧光蛋白,而在转基因成纤维细胞中并未检测到此蛋白。结果表明,本研究克隆得到的牛MyoG基因启动子可以特异性的在绵羊骨骼肌卫星细胞中驱动外源基因的高表达,是一种有效的肌肉细胞特异性启动子。克隆MyoG基因的启动子,探讨启动子区域的启动活性,有助于从理论上揭示MyoG基因表达的关键调控位点,同时也有利于揭示肌肉发育调控的相关机理,为改良家畜肉质研究提供实验依据。     

猪MiR-148a对肝脏发育调控的初步研究

mi R-148a是mi R-148/152家族中的一员,对细胞增殖、细胞分化、癌症发生等生物过程有重要的调控作用。本研究采用Real-time quantitative PCR(q RT-PCR)方法,定量检测mi R-148a在金华猪(Sus scrofa)不同发育时期肝脏中的表达变化,结果显示,mi R-148a在胚胎期的肝脏中表达量最高;出生后,随着日龄的增加表达量逐渐降低;为了了解mi R-148a的生物学功能和过程,对其进行GO(gene ontology)功能注释和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析。结果显示,mi R-148a参与肝脏的生长发育调控过程。为了验证mi R-148a的靶基因,利用胎鼠(Mus musculus)肝细胞构建mi R-148a过表达和抑制表达的细胞模型,以此来探究mi R-148a的表达变化对靶基因在m RNA水平的影响。结果发现,在小鼠胎肝细胞中过表达mi R-148a可以显著降低CCAAT增强子结合蛋白α基因(CCAAT-enhancer binding protein-alpha,Cebpa)的表达量(P<0.05)。进一步检测发现,在金华猪肝脏生长过程中Cebpa与mi R-148a的表达呈负相关。根据这些结果推测,mi R-148a可能在肝脏发育过程中通过降低Cebpa的表达来调控细胞增殖和分化效应之间的平衡。     

鸡下丘脑高丰度差异性表达let-7a的组织表达谱及其功能分析

前期对固始鸡1日龄和36周龄下丘脑miRNA的Solexa测序分析表明,let-7a为鸡(Gallus domesticus)下丘脑发育过程高丰度差异性表达miRNA.为全面了解鸡let-7a的功能,采用实时定量PCR检测了1日龄和36周龄固始鸡两个发育阶段13种组织中let-7a的表达情况.结果表明:let-7a在所检测的组织中呈广泛性表达,其在下丘脑中的表达趋势与高通量测序结果一致;1日龄时,let-7a在下丘脑和肾脏中高丰度表达,在肺中低丰度表达,其他组织中适度表达;36周龄时,let-7a在各组织中的表达量都较低,除了在肺中的表达量较1日龄上升外,其余各组织的表达量都下降.同时,采用两种算法预测了let-7a的靶基因,并对107个共有靶基因进行了基因本体功能(Go)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析,结果显示:靶基因主要在生物学过程调节相关的生物学过程中富集,尤其是与矿物质和磷代谢相关的调节过程;且在粘着斑、细胞外基质受体互作、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路等3个通路中显著富集(P＜0.01).这些结果为进一步研究let-7a功能提供了有益线索.     

牛MEN1基因真核表达载体的构建及其表达分析

多发性内分泌腺瘤致病因子1 (multiple endocrine neoplasia Ⅰ,MEN1)参与乳腺发育与泌乳行为的调控.本研究克隆了牛(Bos taurus) MEN1基因(bMEN1)的全长cDNA,并在不同细胞中检测bMEN1mRNA及其编码蛋白menin的表达情况.根据GenBank中bMEN1基因序列,设计特异性引物,用qRT-PCR方法得到附带EcoR Ⅰ和HindⅢ酶切位点的bMEN1片段,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1-myc-his(A)中.体外转染物种同源性细胞牛乳腺上皮细胞(bovine mammary gland epithelial cell,MAC-T)和异源性细胞中国仓鼠(Cricetulus barabensis)卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO)、小鼠(Mus musculus)成肌细胞(mouse myoblast cells,C2C12),利用qRT-PCR和Westem blot技术检测转染前后bMEN1 mRNA和蛋白menin的表达.双酶切和基因测序结果表明,成功构建了bMEN1基因的真核表达载体pcDNA3.1-myc-his-bMEN1.所建立的转染体系可以使目的基因bMEN1在3种不同细胞中成功表达mRNA和目的蛋白,转染后24 h都达到最高表达量,并达到极显著水平(P＜0.01),之后逐渐降低.其中,CHO细胞中的转染24 h后bMEN1 mRNA和menin蛋白的表达量分别是对照的28 415倍和5.65倍.本研究建立了bMEN1基因的真核表达载体及其转染体系,能够在不同细胞中成功表达,为体外研究MEN1基因对于乳腺的调节功能及其对于机体代谢的调节机制提供了一种工具和技术体系.     

维甲酸X受体α(RXRα)对猪前体脂肪细胞凋亡的影响

采用semi-qRT-PCR、细胞转染、Hoechst 33342和吖啶橙(AO)荧光染色、流式细胞术等方法,检测体外培养的猪前体脂肪细胞经维甲酸X受体α(RXRα)的配体9顺式维甲酸(9-cis Retinoic acid,9-cisRA)处理、转染增强型绿色荧光蛋R(pEn-hanced green fluorescent proteins C2)-RXRα(pEGFPC2-RXRα)重组质粒和化学合成的RXRa-小分子干扰RNA (small interferingRNA)(RXRα-siRNA)后细胞凋亡的变化.结果表明.猪前体脂肪细胞发牛凋亡的形态学变化为细胞首先体积缩小.细胞浆凝缩,染色质逐渐凝集.细胞核固缩呈均一的致密物,进而断裂,胞膜仍完整,然后胞膜小断出芽、脱落.最后细胞变成数个大小不等的由膜包裹的凋亡小体;10nmol/L 9-cisRA组与对照组相比,凋亡率显著降低(P相似文献   

猪miR-369靶基因肿瘤坏死抑制因子-α(TNF-α)的鉴定

microRNAs(miRNAs)是一类长约22nt的非编码小RNA分子,作为关键的转录后调控因子调控真核生物的基因表达,广泛参与细胞的生长发育、分化和凋亡等生物学过程。本研究通过生物信息学预测发现,猪(Susscrofa)肿瘤坏死抑制因子-α(TNF-α)的3’非编码区具有2个潜在的miR-369的靶位点。并进一步通过双荧光素酶报告系统分析,将猪TNF-α3’非编码区构建到双荧光素酶载体中,转染至猪髋动脉内皮细胞系,荧光素酶活性测定显示,miR-369过表达组的荧光比值显著低于对照组(P<0.05),而miR-369抑制组相比对照组没有显著差异(P=0.752)。研究结果提示,猪miR-369能靶向调控TNF-α的表达,对深入研究脂肪沉积性状重要候选基因TNF-α的转录后调控机制具有重要价值。     

GnRH主动免疫对雄性藏绵羊血液中甲状腺激素含量的影响

为探讨GnRH并列体二聚物(GnRH-TDK)对雄性藏绵羊甲状腺功能的影响,采用GnRH-TDK主动免疫雄性藏绵羊,并将雄性藏绵羊随机分为免疫去势、手术去势及对照3个组,其中免疫去势组于25周龄时初免,8周后加免;手术去势组在试验开始前1周进行外科手术去势;对照组不做任何处理。以初免当天为0周,每4周采集血样1次,加免后8周屠宰所有试验羊并分离两侧睾丸,应用酶联免疫法(ELISA)测定血清抗体滴度及LH、FSH、T、TSH、T3和T4含量变化。结果表明,免疫去势组绵羊产生了良好的抗体反应,初免及加免后体内抗GnRH抗体滴度均快速升高,且血清T含量显著下降(P0.05),至屠宰时仍维持在较低水平(4.27 ng·m L~(-1)),同时睾丸严重萎缩。与对照组相比,免疫去势组血清TSH、T3及T4未显著下降。由此可见,GnRH主动免疫对血清中TSH、T3及T4浓度无明显影响,即GnRH主动免疫对雄性藏绵羊甲状腺功能无影响。本研究结果为GnRH主动免疫去势的分子机制以及对机体的影响奠定了理论基础。     

猪甲状腺激素应答基因SPOT14(THRSP)的原核表达及其融合蛋白的亲和纯化

甲状腺激素应答基因（thyroidhormone responsive SPOT14,THRSP）是受甲状腺激素诱导表达的核内基因,参与脂肪合成代谢途径限速酶的转录调控,对动物脂肪生成具有重要的调控作用。为进一步研究猪SPOT14基因所编码蛋白质的生物学功能,本实验将猪SPOT14（GenBank登录号:JF₉51726）的ORF片段与表达载体pET-28α（+）进行重组,获得的重组子pET-28α（+）-S14,转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL2l（DE3）感受态细胞,重组菌经IPTG诱导,通过SDS-PAGE分析显示,目的蛋白分子量约为20.91kD,且主要以包涵体形式存在,最佳诱导条件是37℃1mmol/LIPTG诱导5h。将获得的包涵体用6xHisNi-NTA纯化柱纯化后,采用Western blot进一步检测到了21kD目的蛋白的表达。重组质粒pET-28α（+）-S14在大肠杆菌BL21（DE3）中成功地得到了表达,不仅为SPOT14基因生物学功能的研究,而且为进一步研究S14蛋白功能,了解脂肪代谢调控机制提供了基础资料。     

Towards bioremediation of toxic unresolved complex mixtures of hydrocarbons: identification of bacteria capable of rapid degradation of alkyltetralins

Background, aim and scope  Unresolved complex mixtures (UCMs) of aromatic hydrocarbons are widespread, but often overlooked, environmental contaminants. Since UCMs are generally rather resistant to bacterial degradation, bioremediation of UCM-contaminated sites by bacteria is a challenging goal. Branched chain alkyltetralins are amongst the individual classes of components of aromatic UCMs which have been identified in hydrocarbon-contaminated sediments and a number of synthetic alkyltetralins have proved toxic in laboratory studies. Thus, alkyltetralins should perhaps be amongst the targets for UCM bioremediation strategies. The slow degradation of several alkyltetralins by a microbial consortium has been reported previously; however, the bacteria involved remain unidentified and no single strain capable of alkyltetralin biodegradation has been isolated. The present project therefore aimed to enrich and identify bacterial consortia and single strains of bacteria from a naturally hydrocarbon-contaminated site (Whitley Bay, UK), which were capable of the degradation of two synthetic alkyltetralins (6-cyclohexyltetralin (CHT) and 1-(3’-methylbutyl)-7-cyclohexyltetralin (MBCHT)). Materials and methods  Bacteria were enriched from sediment collected from Whitley Bay, UK by culturing with CHT and MBCHT for a period of 4 months. Biodegradation experiments were then established and degradation of model compounds monitored by gas chromatography–mass spectrometry. Internal standards allowed the generation of quantitative data. 16S rRNA gene clone libraries were constructed from individual enrichments to allow assessment of microbial community structure. Selective media containing MBCHT were used to isolate single bacterial strains. These strains were then tested in liquid culture for their ability to degrade MBCHT. Results  The consortia obtained through enrichment culture were able to degrade 87% of CHT and 76% of MBCHT after only 46 days compared with abiotic controls. The 16S ribosomal RNA gene clone libraries of these bacteria were dominated by sequences of Rhodococcus spp. Using selective media, a strain of Rhodococcus was then isolated that was also able to biodegrade 63% of MBCHT in only 21 days. Discussion  The present report describes the isolation of a single bacterial strain able to degrade the resistant MBCHT. Although significant losses of MBCHT were observed, putative metabolites were not detectable. Rhodococcus sp. have been reported previously to be able to biodegrade a range of hydrocarbon compounds. Recommendations and perspectives  Due to their environmental persistence and toxicity, aromatic UCMs require bioremediation. The culturing and identification of such bacteria capable of rapid degradation of alkyltetralins may be an important step toward the development of bioremediation strategies for sites contaminated with toxic UCMs.     

食用仙人掌萎蔫气象条件分析

塑料大棚内种植的食用仙人掌在土壤墒情较好时也有萎蔫现象发生，通过试验观测和对仙人掌生理习性的分析，发现阴雨过后天气突然放晴温度急剧上升易使仙人掌发生萎蔫现象，并提出了田间管理的应对措施。     

姬松茸多糖提取工艺的优化

对姬松茸子实体多糖提取的工艺条件中的多糖提取温度、提取时间、浸提液pH值3因子的最优化组合问题进行了定量研究,建立了具有良好预测性能的姬松茸多糖提取条件的模型,并利用回归模型对工艺条件的最优化组合,对各单因子要素的多糖得率及其交互作用进行了探讨。试验表明,当浸提温度为100℃、浸提时间为3h、浸提液pH值为6.3时多糖得率处于较高水平     

植物恢复措施对鸡西矿区废弃地土壤养分的影响

以黑龙江省鸡西市矿区废弃地为研究区,对不同矿区废弃地的土壤养分元素进行含量分析。结果表明：应用植物恢复措施后的基质土壤各养分指标绝大多数要大大高于原废弃地土壤和经过自然恢复的土壤,说明该措施对石墨尾矿、矸石发电厂粉煤灰废弃地和平排矸石山土壤养分改善效果明显;其中石墨尾矿除全磷外,各种养分指标与林地土壤差距较大,而旱柳对石墨尾矿土壤的改善效果最好,其有机质含量为37．28g／kg,是残渣的2．6倍;种植大果沙棘对粉煤灰废弃地土壤养分的积累效果明显,有机质含量为48．25g／kg,是残渣的1．5倍;植物恢复措施使平排矸石山的土壤养分积累速度加快,已接近林地,混交种植兴安落叶松和家榆总体恢复效果最好,有机质含量分别为193．42和151．46g／kg,是自然恢复条件下的8．9和7倍。建议引入优势种群（如松科等）以加快演替速度,使矿区废弃地更快地恢复到原始状态。