三品系西方蜜蜂基因组DNA多态性分析研究（二）

采用９种随机引物（Ｋ,５’－ＣＧＧＣＣＣＣＴＧＴ－３’;５’－ＣＡＧＣＧＧＴＡＣＣ－３’;５’－ＡＣＣＡＧＧＴＴＧＧ－３’,５’－ＧＴＣＧＧＡＡＴＴＣ－３’;５’－ＣＧＧＣＣＣＣＧＧＴ－３’;Ｘ,５’－ＧＴＡＧＴＣＡＣＡＣ－３’;Ｙ,５’－ＣＴＧＣＡＧＧＡＣＡ－３’;Ｚ,５’－ＣＧＧＣＣＣＧＧＴＡ－３’）和ＰＣＲ技术扩增不同产蜜量的三品系西峰（喀尼阿兰、平湖、美意的ＤＮＡ基因组。结果Ｋ引物在高产蜜     

伊氏锥虫动基体DNA序列比较

对伊氏锥虫新疆骆驼株（ＸＪＣＡ）、安徽水牛株（ＡＨＢ）和云南水牛株（ＹＮＢ）的动基体ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增后,用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧核糖核酸法测定扩增产物的序列。结果表明,各虫株间ＤＮＡ序列同源性为９７％。内聚分析表明,ＡＨＢ株与ＸＪＣＡ株相似性高属一类,而ＹＮＢ株与中国伊氏锥虫ＳＨ株相似性高属另一类。证明我国不同伊氏锥虫在动基ＤＮＡ序列上存在一些差别,这可能由于点突变的缘故。     

RT-PCR法分离伊氏锥虫VSG基因的研究

应用异硫氰酸胍一酚一氯仿一步法分离伊锥虫安微株克隆虫体ＳｈＴａｔｌ的二信抗原变异体ＳｈＴａｔ１．３和ＳｈＴａｔ１．５总ＲＮＡ，在含有甲醛物琼脂糖凝胶电泳后，转印到硝酸纤维膜上。根据布氏锥虫ＶＳＧｍＲＮＡ３’端保守序列，设计合成了一个互补于它的含十八个碱基的寡核苷酸５’－－ＧＧＴＧＴＴＡＡＡＡＴＡＴＣＡＧ－３’，经＾３２Ｐ标记，Ｎｏｔｒｈｅｒｎ杂交，首次证明２伊氏锥虫含有同样的保守序列。利用合成的十     

制备K700bp成探针与美意和平湖两品系西蜂RAPD-PCR扩增产物及它们基因组DNA分子杂交的研究

Ｋ７００ｂｐ 是高产蜜西蜂引物Ｋ（５’－ ＣＧＧＣＣＣＣＴＧＣ－ ３’） ，通过ＲＡＰＤ－ ＰＣＲ 扩增出来的一个特有ＤＮＡ 片段。然后将Ｋ７００ｂｐ 制备成探针再与高、低产蜜西蜂的ＰＣＲ 产物及它们的基因组进行杂交。结果Ｋ７００探针只与高产蜜西蜂的ＰＣＲ 产物及其基因组杂交，证明Ｋ７００ｂｐ 确实是高产蜜西蜂的一个特有ＤＮＡ 片段。     

制备K700bp成探针与美意和平湖两品系西蜂RAPD—PCR扩增产物及它们基因 …

Ｋ７００ｂｐ是高产蜜西蜂引物Ｋ（５’－ＣＧＧＣＣＣＣＴＧＣ－３’），通过ＲＡＰＤ－ＰＣＲ扩增出来的一个特有ＤＮＡ片段。然后将Ｋ７００ｂｐ制备成探针再与高、低产蜜西蜂的ＰＣＲ产物及它们的基因组进行杂交。结果Ｋ７００探针只与高产蜜西蜂的ＰＣＲ产物及其基因组杂交，证明Ｋ７００ｂｐ确实是高产蜜西蜂的一个特有ＤＮＡ片段。     

猪生殖与呼吸综合征病毒ORF6片段的cDNA克隆及鉴定

根据已发表的ＰＲＲＳＶ基因组序列，设计并合成了１对特异扩增ＡＴＣＣ ＶＲ－２３３２株的ＯＲＦ６的基因的引物，以ＡＴＣＣ ＶＲ－２３３２基因组为模板，通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增出５８６ｂｐ的ｃＤＮＡ产物。将该ｃＤＮＡ片段经Ｔ－Ａ连接插入ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ载体中，用重组质粒转化大肠埃希氏菌ＪＭ１０９，获得重组质粒转化菌。对重南粒ＤＮＡ进行ＰＣＲ及酶切鉴定，证明插入的ＤＮＡ片段与ＰＣＲ扩增的ＤＮＡ片段大小相     

杜大长猪IGF-I基因的克隆及其序列分析

采用ＴＲＩzol法从杜大长杂交猪的肝脏中提出总ＲＮＡ,将其纯化后作为ＰＣＲ扩增模板 ,以设计的Ｐ１（５′－ＣＴＡＣＡＴＴＣＴＧＴＡＧＴＴＣＴＴＧＴＴＴＣＣ－３′）为引物合成ＩＧＦ－Ｉ基因cＤＮＡ的第１链,再以Ｐ１和Ｐ２（５′－ＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴＴＧＣＴＣＴＣＣＴＴ－３′）为引物扩增到大小约为３６０bp的产和,并将其达隆至pＧＥＭ－Ｔ载体上。经筛选、酶切、我分析,表明该片段为ＩＧＦ－Ｉ基因的cＤＮＡ     

伊氏锥虫HGPRT缺陷株和自然株的HGPRT基因的分离、克隆与比较

参照布氏锥虫ＨＧＰＲＴ基因的核苷酸序列，设计一对引物，分别以伊氏锥虫ＨＧＰＲＴ缺陷株和自然株的总ＲＮＡ为模板进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增，结果自然株出现６３０ｂｐ的ＤＮＡ条带，与设计大小一致，而缺陷株均为阴性，证明缺陷株的ＨＧＰＲＴ基因发生明显突变或缺失。自然株ＨＧＰＲＴ基因经与ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ连接，大肠杆菌转化，获得了阳性克隆。     

中国伊氏锥虫kDNA小环的克隆及kDNA探针的建立

本研究以质粒ｐＧＥＭ－７Ｚｆ（＋）为载体，对我国北方和南方疫区伊氏锥虫动基体株的ｋＤＮＡ小环进行了克隆，并以其中之ｐＴＫ０１１－Ｃ１为探针对不同地理区的动基体株和无动基体株的不同ＤＮＡ进行杂交。结果表明，我国北、南两大疫区动基体株的ｋＤＮＡ小环大小均约为１ｋｂ且均属Ａ型。ｐＴＫ０１１－Ｃ１只与动基体株的ｋＤＮＡ及ｔＤＮＡ杂交，不与其ｎＤＮＡ杂交，也不与无动基体株的任何ＤＮＡ及黄牛白细胞ＤＮＡ杂交。     

中国伊氏锥虫kDNA小环的克隆及kDNA探针的建立

本研究以质粒ｐＧＥＭ－７Ｚｆ（＋）为载体，对我国北方和南方疫区伊氏锥虫动基体株的ｋＤＮＡ小环进行了克隆，并以其中之ｐＴＫ０１１－Ｃ＿１为探针对不同地理区的动基体株和无动基体株的不同ＤＮＡ进行杂交，结果表明，我国北、南两大疫区动基体株的ｋＤＮＡ小环大小均约为１ｋｂ，且均属Ａ型，ｐＴＫ０１１·Ｃ＿１只与动基体株的ｋＤＮＡ及ｔＤＮＡ杂交，不与其ｎＤＮＡ杂交，也不与无动基体株的任何ＤＮＡ及黄牛白细胞ＤＮＡ杂交。说明具有特异性，可以用于诊断。ｔＤＮＡ的杂交信号与ｋＤＮＡ相当，诊断中可以代替ｋＮＤＡ作为检测对象。     

核基质附着区(MAR)调控的人胰岛素样生长因子(hIGF-1)转基因兔的制备

用ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄⅢ双酶解含鸡α－珠蛋白基因５′端核基质附着区（ＭＡＲ）、小鼠金属硫蛋白基因启动子（ＭＴ－１）和人胰岛素样生长因子－１（ｈＩＧＦ－１）基因的ｐＭＴＳＭＣＡＧ质粒，０．６％琼脂糖凝胶电泳，玻璃乳回收纯化ＭＡＲ／ＭＴ／ｈＩＧＦ－１片段（３．９ｋｂ），用该片段制备转基因兔。利用水平显微注射系统注射１－细胞兔胚胎４６８枚，移植到３６只受体兔，有８只妊娠，共产下１９只活仔兔。采仔兔耳样提取基因组ＤＮＡ，应用ＰＣＲ技术分析其外源基因整合情况，获得８只阳性兔（显示出约６００ｂｐ外源ＤＮＡ条带）。再对８只阳性兔的ＰＣＲ产物进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，得到５只整合有ＭＡＲ／ＭＴ／ｈＩＧＦ－１外源基因的转基因兔，转基因整合率为２６．３％（５／１９）。用１只阳性转基因公兔（５０２号）繁殖了６窝，共获得４２只仔兔。采仔兔耳样提取基因组ＤＮＡ后，如上用ＰＣＲ分析和做Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，Ｆ１代中有５只整合有ＭＡＲ／ＭＴ／ｈＩＧＦ－１融合基因。     

用长臂光敏生物素标记伊氏锥虫kDNA探针的研究

用长臂光敏生物素标记伊氏锥虫ｋＤＮＡ探针的研究王云飞，钟淑梅，周勇志（中国农科院上海家畜寄生虫病研究所）前言动基体ＤＮＡ（ｋＤＮＡ）是伊氏锥虫重要特征之一。应用同位素标记ｋＤＮＡ探针来检测伊氏锥虫，灵敏度高ｔ‘］。然而，同位素标记受实验条件限制，对于...     

伊氏锥虫HGPRT缺陷株驯化及生物学特性观察

为了获得伊氏锥虫次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶（ＨＧＰＲＴ）缺陷株,用不同浓度的８－氮鸟嘌呤（８－ＡＧ）和８－ＡＧ加紫外线照射的方法,对伊氏锥虫体外培养株进行了为期６０～１０１ｄ诱导驯化。结果,以每毫升含８－ＡＧ４０μｇ的培养液培养驯化,再配合紫外线照射,以及以每毫升含８－ＡＧ６０μｇ的培养液培养驯化,均获得了伊氏锥虫ＨＧＰＲＴ缺陷株。试验表明,培养虫体经过２～３个死亡期后逐步进入适应期,虫数升高到（１．５～２．５）×１０６／ｍＬ,饲养细胞通常于２～５ｄ变黑、崩解,应适时更换。培养驯化的１３株克隆虫株,经６－巯基鸟嘌呤（６－ＴＧ）抗性测定,１０株存活。克隆株在３倍量氨基喋呤的ＨＡＴ选择性培养液中死亡。生物学试验表明,ＨＧＰＲＴ缺陷株在无ＨＴ的培养液中生长良好,对小鼠致病力有下隆的趋势,虫血症和小鼠死亡时间比对照组延长１倍多。抗体凝集试验表明,ＨＧＰＲＴ缺陷株未发生抗原变异现象。超微结构显示,ＨＧＰＲＴ缺陷株的动基体、核和核仁比对照组明显增大,核膜电子密度区也明显增宽。     

应用PCR扩增检测伊氏锥虫的研究

本文建立了伊氏锥虫ＤＮＡ的ＰＣＲ扩增技术,并用于分裂工锥虫的检测,经ＰＣＲ增后的ＤＮＡ片断分子量约为２３７ｂｐ,可以检测到０．１ｐｇ总ＤＮＡ或１条虫体,可以诊断小鼠的早期感染（第一天）和重复感染,还可以用来考核抗锥虫药物疗效,该项技术对锥虫具有特异性,且灵敏性和准确性都很高。     

鸡IL-2基因的克隆及序列测定

应用逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术，参照Ｓｕｎｄｉｃｋ发表的鸡白细胞介素２（ＩＬ－２）ｃＤＮＡ基因序列，利用在行设计合成的１对引物，从ＣｏｎＡ活化的５周龄ＨＷＬ－ＳＰＦ鸡脾细胞中，扩增出长４４５ｂｐ的鸡ＩＬ－２ｃＤＮＡ基因，以ＰＵＣ１１９为载体，克隆了扩增片段，经酶切鉴定及ＤＮＡ序列测定，确认为鸡ＩＬ－２基因，该序列与Ｓｕｎｄｉｃｋ报道的结果一致。对氨基酸的比较发现，鸡ＩＬ－２与牛ＩＬ－２     

H_5和H_7亚型禽流感病毒HA基因的RT-PCR扩增及克隆

采用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法，以自行设计的Ｈ７和Н５亚型禽流感病毒血凝素（ＨＡ）基因特异的两对引物，分别扩增了禽流感病毒Ａ／ＡｆｒｉｃａｎＳｔａｒｌｉｎｇ／９８３／７９（Ｈ７Ｎ１）株和Ｇ株（广东鹅体分离株，Ｈ５Ｎ１）约１．７ｋｂ的ＨＡ全基因ｃＤＮＡ。将所扩增的两个基因ｃＤＮＡ未端经Ｔ４ＤＮＡ聚合酶修饰后分别插入ｐＵＣ１８和ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ质粒中，得到了两个基因的重组质粒。本研究为国内禽流感病毒分子生物学研究奠定了基础     

聚合酶链反应检测鸡贫血因子DNA序列

本实验建立了聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法检测鸡贫血因子（ＣＡＡ）ＤＮＡ，所用的一组２０个碱基的引物与位于ＣＡＡ复制型（ＲＦ）ＤＮＡ基因组的４８５－５０４及１０４８－１０６７位置的序列互补，扩增产物为５８３ｂｐ，并通过在扩增的序列上只有一个ＨｉｎｄⅢ位点而证实扩增的是ＣＡＡ，用地高辛标记的２５个碱基作为探针进行斑点杂交，表明扩增片段对ＣＡＡ ＲＦ ＤＮＡ是特异的。优化的ＰＣＲ方法检测ＣＡＡ不仅特异而且     

重组人白细胞介素6表达载体的构建及共在大肠杆菌中的高效表达

本研究合成了两个成熟人ＩＬ－６ｃＤＮＡ引物，采用ＰＣＲ法扩增出了成熟人ＩＬ－６基因片段，并在其５＇端加入了一个ＥｃｏＲＩ部位和ＡＴＧ，３＇端加入了一个ＢａｍＨＩ部位和ＴＡＡ。利用ｐＢＶ２２０质粒构建成功了ｐＢＶ２２０ＩＬ－６表达载体。将重组质粒导入Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ａ中，经３０℃扩增的４２℃诱导，表达出了分子量为２１０００的预期蛋白。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析与溥层证明具有明显的ＩＬ－６活性。实验还对     

基因探针和PCR对鲤吉陶单极虫的检测

采用液氮冷冻研磨法破碎吉陶单极虫（Ｔｈｅｌｏｈａｎｅｌｕｓｋｉｔａｕｅｉ）孢子，按常规法提取其基因组ＤＮＡ。取ＤＮＡＥｃｏＲＩ消化产物，采用低熔点琼脂糖回收法制备大（３．０～１５．０ｋｂ）、小（０．５～３．０ｋｂ）片段，将其克隆于ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｋｓＥｃｏＲＩ位点，经α－互补现象、酶切鉴定和虫体ＤＮＡ生物素标记探针筛选，构建了含２３个克隆的基因文库，克隆片段介于０．９～６．８ｋｂ之间；经阳性克隆标记筛选及特性分析，制备了长度为０．９ｋｂ（１９号质粒克隆片段）的探针，该探针具有较强的敏感性和特异性。对该探针两端ＤＮＡ序列进行分析，设计出１对引物。上游引物序列为：５′ＴＴＴＣＧＡＡＣＣＣＧＣＡＣＡＡＣＡＡＧ３′，下游引物序列为：５′ＴＧＡＧＴＧＧＡＴＡＧ－ＴＡＴＣＧＣＴＧＣ３′。应用该对引物对虫体进行了检测     

鸡传染性喉气管炎病毒王岗株gC和gD基因的克隆及序列分析

根据已发表的传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）ＳＡ－２株的核酸序列,设计了１对引物,以ＩＬＴＶ－中国王岗株ＤＮＡ为模板,ＰＣＲ法扩增出１条１．３９ｋｂ的基因片段,将扩增产物插入到真核表达质粒ｐＣＲ＾ＴＭ３－Ｕｎｉ,得到重组质粒ｐＴＡ－ｇＤ,另将克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ质料中的ｇＣ基因酶毁后,插入到ｐＣＲ＾ＴＭ３－Ｕｎｉ载体,得到重组质粒ｐＴＡ－ｇＣ,经电泳分析、酶分、ＰＣＲ鉴定后,进行序列测