伊氏锥虫体外培养株的建立及其HGPRT活性测定

用带虫培养法和带虫传代法建立了伊氏锥虫体外培养株，无论有、无饲养细胞，虫体均能快速增殖。培养７０ｄ以上，虫体仍保持原有生物学特性，对小鼠有感染性，活力旺盛，在体外能连续培养传代。虫数最高达２．４８×１０６／ｍＬ，群体增倍时间为８．８６～１０．８ｈ。液氮保存、复苏后的虫体可在饲养细胞上立即增殖。培养中发现由巨噬细胞转化的巨核母细胞对虫体生长有促进作用，经胰酶消化能与虫体一道连续传代。通过ＨＡＴ选择性培养液测定，伊氏锥虫对氨基喋呤不敏感，试验组虫体与对照一样生长良好，证明伊氏锥虫具有次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶（ＨＧＰＲＴ）     

伊氏锥虫HGPRT缺陷株和自然株的HGPRT基因的分离、克隆与比较

参照布氏锥虫ＨＧＰＲＴ基因的核苷酸序列，设计一对引物，分别以伊氏锥虫ＨＧＰＲＴ缺陷株和自然株的总ＲＮＡ为模板进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增，结果自然株出现６３０ｂｐ的ＤＮＡ条带，与设计大小一致，而缺陷株均为阴性，证明缺陷株的ＨＧＰＲＴ基因发生明显突变或缺失。自然株ＨＧＰＲＴ基因经与ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ连接，大肠杆菌转化，获得了阳性克隆。     

体外培养对伊氏锥虫血液型毒力的影响及其代谢产物的免疫原性

体外培养对伊氏锥虫血液型毒力的影响及其代谢产物的免疫原性在以ＢＨＫ细胞作为支持细胞的ＲＰＭＩ－１６４０培养液中接种伊氏锥虫，在培养８、１２、１８、２８ｄ后，取其带虫的培养液接种于小鼠，接种后８～１５ｄ出虫，１２～２２ｄ死亡；在以Ｃ６／３６蚊虫细胞作为...     

犬肾传代细胞HGPRT缺失株的诱变

应用８－氮鸟嘌呤（８－Ａｚａｇｕｉｚｉｎｅ），通过大剂量追加细胞法、剂量递增法和紫外线预先照射交替培养法，区获得９株犬肾传代细胞系（ＭＤＣＫ）抗药细胞（剂量分别为２０μｇ／ｍＬ和５０μｇ／ｍＬ），经ＨＡＴ系统敏感性试验和６－巯鸟嘌呤抗性鉴定，其中有８株为犬肾传代细胞ＨＧ－ＰＲＴ缺失突变株（ＭＤＣＫ／ＨＧＰＲＴ＾－）。该突变株细胞Ｇｉｅｍｓａ染色后呈卵圆形，核呈圆形，８３世代细胞（ＭＤＣＫ８３／ＨＧ     

理化因素对体外培养伊氏锥虫致弱的影响

本试验观察了理化因素（γ－射线、紫外线、低浓度杀虫药）对体外培养伊氏锥虫致弱的影响，结果如下：受γ－射线辐照的伊氏锥虫开始时存活数随辐照剂量的增加而减少，随后表现出无规律性，辐照剂量５万ｒａｄ以下对锥虫的存活影响较小，５～１０万ｒａｄ辐照后２ｄ锥虫的存活数明显减少，对小白鼠的感染性消失。伊氏锥虫受紫外线照射的存活曲线为“Ｃ”型，群体抗辐射不均一，平均致死剂量（Ｄ＿（３７））为波长２６５０Ａ的２０Ｗ紫外灯离样品４０ｃｍ处照射约２ｈ。虫体照射后根据体外跟踪观察，其存活数随照射剂量的增大而减少，照射了３ｈ和４ｈ第３天的活虫数近似１００条或不足１００条，对小白鼠的感染性均消失。用０．１μｇ／ｍｌ的苏拉灭和０．８μｇ／ｍｌ的贝尼尔两种低浓度杀虫药在体外对伊氏锥虫诱导４０ｄ仅造成药敏性的改变，未造成毒力减弱。     

人血清中伊氏锥虫溶虫活性因子的鉴定

将伊氏锥虫在体外与人血清一起培养，虫体出现渐进性水肿，由蝌蚪形变成环形，最后崩解。将人血清注入感染鼠体内，可以清除体内虫体，使感染鼠得到保护。人血清对接种１０３个锥虫感染鼠的最小保护剂量为０．２ｍＬ，感染后５ｄ注入人血清，血中虫体数量逐日下降，至第１０天全部消失。对体外伊氏锥虫不同变异株，人血清均有同样的溶虫效果。经ＤＥＡＥ层析和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００过滤后，人血清中只有富ＩｇＭ的Ｆ－１有溶虫活性，而富ＩｇＧ的Ｆ－２和富ＨＤＬ的Ｆ－３均无溶虫活性，表明人血清对伊氏锥虫的溶虫活性与ＩｇＭ类天然抗体有关。另外，去补体的人血清体外溶虫活性明显减弱，而体内保护仍然有效。     

家畜伊氏锥虫多因素致弱苗免疫试验研究

用伊氏锥虫多用因素致弱免疫小白鼠３０只，在免疫后３０，４５，６０ｄ各取１０只小白鼠攻虫，保护率依次为９／１０，８／１０，６／１０；３次空白对照小白鼠均球 注锥虫后４－７ｄ死亡。免疫豚鼠３０只，在免疫后３０，６０，９０ｄ各取１０只豚鼠攻虫，保护率依次为１０／１０，９／１０，８／１０；３次空白对照豚鼠均于注锥诟１７－２３ｄ玖民。免疫马９区，在免疫后３０，６０，９０ｄ各取３匹马攻虫，均获３／３保护；继续     

体外培育抗苏拉灭伊氏锥虫克隆

将３个苏拉灭敏感的伊氏锥虫原种的克隆连续培养于改良Ｂａｌｔｚ无细胞培养系统中，通过逐步提高培养基中苏拉灭的含量，培育了３个抗苏拉灭的伊氏锥虫克隆─ＪＧｃ１－１６０、ＪＸ－１ｃ１－１６０和ＺＪｃ１－１４０。它们体外药敏试验的ＩＣ５０依次为３５８．５、４１２．３和２４６．４μｇ／ｍＬ，是各自亲本克隆的１２９２．５、１８７４．１和１７６０．ｏ倍；小鼠治疗试验的ＣＤ１００，对免疫功能正常小鼠依次为８０、１２０和３０ｍｇ／ｋｇ，为各自亲本克隆的５．３、８．０和３．０倍，对免疫抑制小鼠为２５０、３００和１００ｍｇ／ｋｇ，分别是相应免疫正常小鼠的３．１、２．５和３．３倍。试验结果表明，抗锥虫药治疗剂量不足和宿主免疫功能不全是导致产生抗药虫株的重要因素，各自既可单独发挥作用，又可相互协同。本文报道了体外培育伊氏锥虫抗药虫株的方法，这一方法对研究锥虫抗药性具有重要作用。     

RT-PCR法分离伊氏锥虫VSG基因的研究

应用异硫氰酸胍一酚一氯仿一步法分离伊锥虫安微株克隆虫体ＳｈＴａｔｌ的二信抗原变异体ＳｈＴａｔ１．３和ＳｈＴａｔ１．５总ＲＮＡ，在含有甲醛物琼脂糖凝胶电泳后，转印到硝酸纤维膜上。根据布氏锥虫ＶＳＧｍＲＮＡ３’端保守序列，设计合成了一个互补于它的含十八个碱基的寡核苷酸５’－－ＧＧＴＧＴＴＡＡＡＡＴＡＴＣＡＧ－３’，经＾３２Ｐ标记，Ｎｏｔｒｈｅｒｎ杂交，首次证明２伊氏锥虫含有同样的保守序列。利用合成的十     

伊氏锥虫动基体DNA序列比较

对伊氏锥虫新疆骆驼株（ＸＪＣＡ）、安徽水牛株（ＡＨＢ）和云南水牛株（ＹＮＢ）的动基体ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增后,用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧核糖核酸法测定扩增产物的序列。结果表明,各虫株间ＤＮＡ序列同源性为９７％。内聚分析表明,ＡＨＢ株与ＸＪＣＡ株相似性高属一类,而ＹＮＢ株与中国伊氏锥虫ＳＨ株相似性高属另一类。证明我国不同伊氏锥虫在动基ＤＮＡ序列上存在一些差别,这可能由于点突变的缘故。     

伊氏锥虫抗独特型抗体疫苗的研究Ⅱ．伊氏锥虫变异表面糖蛋白抗独特型抗体制备与检测

用纯化的伊氏锥虫变异表面糖蛋白（ＶＳＧ）免疫大白鼠制备出抗血清，经饱和硫酸铰盐析，ＤＥ－５２纤维素离子交换层析和Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析提取ＶＳＧ特异性多克隆ＩｇＧ抗体（Ａｂｌ）。用Ａｂｌ免疫大白鼠和家兔制备出抗独特型血清。ＥＬＩＳＡ抑制试验检测结果表明，８份大白鼠抗独特型血清的抑制率高于２５％。用正常大白鼠ＩｇＧ致敏的醛化绵羊红细胞吸收兔抗独特型血清除去异种抗体，采用Ａｂｌ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析，可从每毫升兔抗独特型血清中获得９７．４微克抗独特型抗体（Ａｂ２）。经ＥＬＩＳＡ抑制试验检测表明，提取的兔抗独特型抗体（Ａｂ２）对Ａｂｌ与ＶＳＧ的结合反应可产生明显的抑制效应，能识别Ａｂｌ的抗原结合部位，其配位的空间构型与ＶＳＧ表位具有相似性。     

分泌抗伊氏锥虫单克隆抗体的杂交瘤细胞株的建立

通过3次sp2/0骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾细胞间的融合试验,筛选出7株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。对其中2G_6细胞株作了进一步的检定分析,用2G_6上清液对T.e抗原进行ELISA试验,显示出高度的特异性,与血吸虫、弓形虫均未出现交叉反应。效价为1∶5.1×10~3,诱生腹水抗体的效价为1∶1.6×10~7,免疫球蛋白类型属IgG_1亚美。该细胞株在外培养下,稳定地分泌特异性抗体已达6个月之久,在液氮冻存近8个日之后仍深持分泌抗体的能力。     

用毛细管电泳检测伊氏锥虫微环DNA PCR扩增产物

毛细管电泳技术用于ＤＮＡ电泳分析，具有快速，样品用量少，高重复率等特点。本文应用毛细管电泳对动基体微环ＤＮＡ ＰＣＲ扩增产物进行检测，结果表明扩增产物分子量片段为３００ｂｐ到６００ｂｐ之间，与实验设计相符，且比较纯净，可用于下一步测序分析。     

运用伊氏锥虫抗原变异规律进行免疫的初步研究

为了克服锥虫抗原变异对宿主免疫反应的干扰，探索伊氏锥虫病高效保护性抗原，根据伊氏锥虫在宿主体内第一次发生变异产生的变异抗原免疫原性相同的规律，设计了伊氏锥虫变异前抗原（VSG1）和第二次变异所产生的抗原（VSG2）复合物作免疫原，对小鼠进行免疫与单用变异前抗原免疫鼠相比较，两组鼠都用带变异前抗原的虫攻击，另以未免疫的鼠作对照，结果VSG1＋VSG2免疫组小鼠8只全部获得保护，单用VSG1免疫组小鼠10只和未免疫组小鼠10只血中全部出虫而死亡，前者比后者出虫时间和存活时间延长，提示运用伊氏锥虫抗原变异这一规律设计的这种免疫复合物，能激收缩主克服虫体抗原变异对免疫保护的干扰。     

伊氏锥虫与小鼠细胞的粘附反应研究

本文探讨了伊氏锥虫在体外与小鼠淋巴细胞、巨噬细胞和上皮细胞间的粘附反应。结果表明，三种健康细胞与锥虫有不同程度的粘附性，不同个体来源的细胞的粘附反应存在差异，但是，各类细胞的粘附率之比基本稳定。动物受到感染后，粘附细胞数大幅度减少。人α－干扰素可以促进健康细胞以及受感染动物细胞与锥虫的粘附性。细胞粘附水平高的个体在疾病的后期表现有较强的耐受力。作者认为，小鼠多种细胞表面存在着伊氏锥虫的病原性受体，后者与动物的抗锥虫感染能力以及疾病发生都有明显相关性。     

用免疫抑制小鼠快速培育抗苏拉明伊氏锥虫

将伊氏锥虫克隆ＪＧｍｃ５用环磷酰胺处理的免疫抑制小鼠频繁地连续传代，并予以亚治疗剂量的苏拉明治疗，连续传代１４次，历时８８日，即获得对苏拉明具有高水平抗药性的伊氏锥虫群体。在用免疫活性正常的健康小鼠测定抗药性时，此抗苏拉明锥虫群体仍保持高水平的抗药性，ＣＤ１００＞４００ｍｇ／ｋｇ。在以体外药敏试验测定时，其ＩＣ５０为１２３．２μｇ／ｍｌ。实验结果表明，宿主免疫系统的损害，在实验条件下，可导致伊氏锥虫迅速产生抗药性。在野外条件下，机体免疫系统的损害对锥虫抗药性的产生可能也起一定作用。     

用DEAE—纤维素柱分离伊氏锥虫

本文报道了用国产DEAE—纤维素从人工感染伊氏锥虫的小鼠、大鼠和犬的血液分离伊氏锥虫的具体方法,测定了压积DEAE—纤维素对小鼠、大鼠和犬的血液吸附值分别为0.25～0.41、0.23～0.39、0.33;伊氏锥虫的回收率,小鼠为83.19～98.19％,大鼠为84.87～93.85％。分离的锥虫形态正常,运动活泼,离心浓集后呈炼乳状,镜检无任何血细胞。此外,对用DEAE—纤维素分离伊氏锥虫的有关技术问题作了讨论。     

骆驼锥虫病研究现状

锥虫病是世界卫生组织认定的由锥虫引发的主要的人畜共患原虫病之一。在我国流行的主要是骆驼、马、牛等家畜的伊氏锥虫病。骆驼锥虫病可造成骆驼日渐消瘦、心肌衰竭甚至死亡,随着疾病的蔓延会造成较大的经济损失。通常使用苏拉明、贝尼尔、安锥赛等药物可达到防治该病的目的。为了让更多的人们较为系统地了解和有效防治骆驼锥虫病,从骆驼锥虫病的病原体特征、流行病学、临床症状、病理变化和防治措施等方面进行了综述。此外,对骆驼锥虫病的防治提出了新的方法和思路,为骆驼锥虫病的诊断、治疗及预防提供参考。     

12株中国伊氏锥虫对小鼠的毒力试验

为了确定中国伊氏锥虫各株的毒力强弱,对中国伊氏锥虫:安徽水牛株(AHB)、广东阳江水牛株(GDB_1)、广东水牛株(GDB_2)、广东马株(GDH)、广西骡株(GXM)、湖北骡株(HBM)、湖南水牛株(HNB)、江苏高邮水牛株(JSB_1)、江苏盱眙水牛株(JSB_2)、新疆骆驼株(XJCA)、云南水牛株(YNB)、浙江水牛株(ZJB)进行小鼠的毒力试验。以各组鼠死亡率和平均存活天数作为毒力强弱的主要依据。结果表明最强致死率为100%,最弱30%;致死所需时间平均为7.5 d～25 d。对小鼠的致病力强弱依次是:AHB>YNB>GDB_2>XJCA>HBM>HNC>JSB_1>GXM>GDB_1>GDH>JSB_2>ZJB。提示不同株的毒力差异显著,测定结果可为伊氏锥虫相关科学研究选株提供依据。