12株中国伊氏锥虫对苏拉明的药敏试验

用体外培养生长抑制试验检测了中国伊氏锥虫安徽水牛株（AHB）、广东阳江水牛株（GDB1）、广东水牛株（GDB2）、广东马株（GDH）、广西骡株（GXM）、湖北骡株（HBM）、湖南水牛株（HNB）、江苏高邮水牛株（JSB1）、江苏盱眙水牛株（JSB2）、新疆骆驼株（XJCA）、云南水牛株（YNB）、浙江水牛株（ZJB）对苏拉明的敏感性。它们的50％生长抑制浓度（IC50）依次为0．114、0．041、0．120、0．1490．752、0．252、0．171、0．127、0．339、0．094、0．106、0．118ng/L。结果显示，不同虫株的伊氏锥虫对苏拉明的敏感性明显不同，提示中国伊氏锥虫不同虫株存在抗药性差异。在12株伊氏锥虫中，GXM株对苏拉明的抗药性水平明显高于其他株。小鼠体内治疗试验显示，GXM株以10mg/kg剂量苏拉明治疗无效，在临床上表现出一定的抗药性，而GDB1株以10mg/kg剂量苏拉明治疗则全部治愈。由此可见，体外药敏试验结果与体内治疗结果一致。这一结果提示，多数中国伊氏锥虫株对苏拉明的敏感性偏低，少数虫株已表现出一定的抗药性。     

抗安锥赛克隆伊氏锥虫的生物特性

为了解对安锥赛有抗药性的伊氏锥虫的特性和危害，将伊氏锥虫浙江株克隆，然后人工诱导其对安锥赛产生抗药性，观察抗药性锥虫的生物特性。克隆繁殖后的伊氏锥虫分为3组C(0)0为原种对照组；C(15)0为不接触安锥赛的同步繁殖对照组；第3组为连续经环磷酰胺免疫抑制小鼠人工诱导对安锥赛产生的5种不同程度抗药性锥虫C(1)6、C(3)16、C(6)43、C(9)83和C(15)199。采用无细胞培养技术分别测定C(0)0、C(15)0、C(1)6、C(3)16、C(6)43、C(9)83和C(15)199的IC50，结果依次为0.01550、0.01346、0.0263、0.10237、1.40929、1.92290和9.92330。将这7种锥虫各自按1.0×104条/只经腹腔感染5只小鼠，镜检它们在小鼠尾血中的出虫时间，结果依次为69.6、67.2、76.8、86.4、93.6、98.4、96.0h；各组感染小鼠存活时间依次为154、142、194、207、205、198、202h；各组死亡率均为100%。结果表明，伊氏锥虫经安锥赛作用于小鼠体内传15代后，其生长繁殖和对小鼠的毒性均发生变化，随着伊氏锥虫对安锥赛的抗药性程度升高至IC50为1.92290，抗药锥虫的生长繁殖速度降低，对小鼠的毒性减弱，但毒性并不随锥虫抗药性程度的提高而进一步减弱。这些结果显示，伊氏锥虫在安锥赛作用下，以生长、繁殖、毒力的代谢发生变化来适应安锥赛的作用而生存。     

伊氏锥虫苏拉灭抗药性的稳定性和对其他抗锥虫药敏感性的影响

将实验室培育的分别源于伊氏锥虫克隆ＪＧｃ１和ＪＸ１ｃ１的抗苏拉灭伊氏锥虫亚克隆ＪＧＳＲ和ＪＸＳＲ以小鼠连续传代，每３个月用体内药物敏感性试验测定１次苏拉灭的ＩＤ１００和ＣＤ１００；另于传代初和传代１２个月后测定它们和它们各自对苏拉灭敏感的亲本克隆对硫胂聚氰胺、喹嘧胺硫酸盐和贝尼尔的敏感性。传代初，ＪＧＳＲ和ＪＸＳＲ的苏拉灭ＩＤ１００均为１００ｍｇ／ｋｇ，ＣＤ１００分别为４００ｍｇ／ｋｇ和＞４００ｍｇ／ｋｇ。连续传代２１个月，ＪＧＳＲ的苏拉灭抗药性仍保持原水平；ＪＸＳＲ于头１５个月保持原水平，传代１８个月，ＩＤ１００降至５０ｍｇ／ｋｇ，２１个月ＩＤ１００进一步降至２５ｍｇ／ｋｇ，ＣＤ１００降至１００ｍｇ／ｋｇ。ＪＧＳＲ和ＪＸＳＲ对喹嘧胺硫酸盐的敏感性比各自的亲本克隆提高了３倍，而对硫胂聚氰胺的敏感性则与亲本克隆相同或相近。ＪＧＳＲ和ＪＸＳＲ仍保持各自亲本克隆的贝尼尔抗药性，传代１２个月也无改变。这些受试伊氏锥虫的贝尼尔抗药性是单一抗药性，对硫胂聚氰胺无显著交叉抗药性。     

伊氏锥虫体外培养株的建立及其HGPRT活性测定

用带虫培养法和带虫传代法建立了伊氏锥虫体外培养株，无论有、无饲养细胞，虫体均能快速增殖。培养７０ｄ以上，虫体仍保持原有生物学特性，对小鼠有感染性，活力旺盛，在体外能连续培养传代。虫数最高达２．４８×１０６／ｍＬ，群体增倍时间为８．８６～１０．８ｈ。液氮保存、复苏后的虫体可在饲养细胞上立即增殖。培养中发现由巨噬细胞转化的巨核母细胞对虫体生长有促进作用，经胰酶消化能与虫体一道连续传代。通过ＨＡＴ选择性培养液测定，伊氏锥虫对氨基喋呤不敏感，试验组虫体与对照一样生长良好，证明伊氏锥虫具有次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶（ＨＧＰＲＴ）     

体外培育抗苏拉灭伊氏锥虫克隆

将３个苏拉灭敏感的伊氏锥虫原种的克隆连续培养于改良Ｂａｌｔｚ无细胞培养系统中，通过逐步提高培养基中苏拉灭的含量，培育了３个抗苏拉灭的伊氏锥虫克隆─ＪＧｃ１－１６０、ＪＸ－１ｃ１－１６０和ＺＪｃ１－１４０。它们体外药敏试验的ＩＣ５０依次为３５８．５、４１２．３和２４６．４μｇ／ｍＬ，是各自亲本克隆的１２９２．５、１８７４．１和１７６０．ｏ倍；小鼠治疗试验的ＣＤ１００，对免疫功能正常小鼠依次为８０、１２０和３０ｍｇ／ｋｇ，为各自亲本克隆的５．３、８．０和３．０倍，对免疫抑制小鼠为２５０、３００和１００ｍｇ／ｋｇ，分别是相应免疫正常小鼠的３．１、２．５和３．３倍。试验结果表明，抗锥虫药治疗剂量不足和宿主免疫功能不全是导致产生抗药虫株的重要因素，各自既可单独发挥作用，又可相互协同。本文报道了体外培育伊氏锥虫抗药虫株的方法，这一方法对研究锥虫抗药性具有重要作用。     

四种抗锥虫药治疗伊氏锥虫病效果比较试验

目前,在我国应用治疗伊氏锥虫病药物有纳嘎诺尔(拜尔—205,苏拉明),贝尼尔(三氮脒),安锥赛(喹嘧腰),沙莫林(Trypamidium)四种。对其疗效,据各地兽医工作者临床应用结果,评价不一。有的发现纳嘎诺尔有抗药性,有的认为贝尼尔疗效差,有的认为沙莫林疗效差。我们曾用这4种药进行治疗伊氏锥虫(江苏株)病试验,结果提示不同地理虫株对各药的抗性不同°为此,我们又对伊氏锥虫(浙江株)病作     

多价伊氏锥虫灭活疫苗制备及免疫保护试验

用湖北株、广西株和江苏株伊氏锥虫经体外培养增殖，再等量混合，制备多价伊氏锥虫灭活苗。疫苗免疫接种小鼠后，再分别用强毒湖北株、广西株和江苏株伊氏锥虫攻击，结果3组小鼠均获12／12保护。免疫保护鼠于免疫后105d时，再作第二次攻虫，结果湖北、广西和江苏组分别获得1／5，3／5，4／5保护，对照组小鼠均100％发病死亡。结果表明多价伊氏锥虫灭活苗对多种虫株均产生了良好免疫保护作用，免疫期达3个月，从而为大面积推广伊氏锥虫病苗提供了有效途径。     

克隆伊氏锥虫对安锥赛抗药性的培育

为了深入观察伊氏锥虫对安锥赛抗药性的形成,将伊氏锥虫浙江水牛株克隆,克隆繁殖后的虫体一部分作为原种对照组,即C01组;一部分虫体连续经环磷酰胺免疫抑制的小鼠,再用安锥赛亚治疗剂量治疗该小鼠,使其伊氏锥虫对安锥赛产生7个不同程度的抗药性组,即C1～C7组;另一部分虫体也连续经环磷酰胺免疫抑制的小鼠,作为伴随C7的同步繁殖组,即不用药物的C02组.结果C01、C02、C1～C7组所用安锥赛剂量依次为0、0、6、16、40、80、196、406、638mg/kg,它们经小鼠传代数依次为0、28、1、3、6、9、15、22、28代.用体外生长繁殖抑制法测得它们的ICs0值依次为0.015 50、0.016 87、0.082 60、0.102 37、1.409 29、1.922 90、9.923 30、23.563 00、43.84000.结果表明,安锥赛亚治疗剂量与伊氏锥虫抗药性的IC50值呈曲线关系,从C1到C4的IC50值上升较缓慢,从C4后的ICs0值上升较快,并且几乎呈直线上升;伊氏锥虫所经小鼠的代数与它们的IC50值的关系呈抛物线型,从C1到C4的ICs0值上升很慢,C4以后的IC50值上升很快.用体内试验测试C01～C4组的CD100值,每个组感染35只小鼠,每只小鼠接种1.0×104条锥虫,其中30只小鼠分为安锥赛的3个剂量治疗小组,另5只小鼠为不治疗对照组.结果C01组和C1组的CD100值分别为7.0、13.0 mg/kg,这表明C1组只经1代免疫抑制小鼠,注射安锥赛剂量3×2 mg/kg,就使该组伊氏锥虫对安锥赛的抗药性提高了6 mg/kg,并且它们的IC50值C1是C01的6.6倍.C2、C3和C4组由于抗药性程度过高均不能治愈,因此尚未测到它们的CD100值.这些结果表明,伊氏锥虫经免疫抑制小鼠对安锥赛产生抗药性的速度是非常快的.     

伊氏锥虫对安锥赛抗药性的分子基础初探

为了探讨伊氏锥虫对安锥赛抗药性的分子基础，将伊氏锥虫单虫克隆，一部分克隆虫通过28只免疫抑制小白鼠，用安锥赛亚治疗剂量治疗，使其产生抗药性，为抗药锥虫；另一部分克隆锥虫也通过28只免疫抑制小白鼠,，但不用药物治疗，为敏感锥虫，即对照，用体外生长抑制法测得抗药和敏感锥虫的IC50分别为43．8和0．16878μg/ml。分别提取它们的总RNA和mRNA，总RNA分离出3条带，即从电泳的阴极到阳棚分别为26s,21s和5s,mRNA主要分布在21sRNA之后。用抑制性消减杂交法，以敏感锥虫的cDNA为试验组（Tester)，抗药锥虫的cDNA为驱动组（Driver)，共挑选出34个阳性克隆，以cDNA来合成探针，用Southern dot blot鉴定，其中18个片段所在的基因是由于抗药性产生而表达量降低，这18个片段长度为300－700bp。     

低温状态下伊氏锥虫的放射性核素标记及测定

为了明确伊氏锥虫在低温状态下是否仍有代谢活动，在-20℃和-80℃条件下，在伊氏锥虫保存液中添加3H-TdR活锥虫样品和未添加3H-TdR活锥虫样品，用液闪计数器测定保存的锥虫体内CPM值。结果，添加3H-TdR的活锥虫样品与未添加3H-TdR的活锥虫样品CPM值差异非常显著（P＜0．01），在保存液中添加3H－TdR的活锥虫样品与死锥虫样品的CPM值差异也非常显著。说明3H-TdR渗入到活锥虫体内，在低温条件下伊氏锥虫仍有代谢活动。