茶树体内咖啡碱生物代谢研究进展

咖啡碱是由嘌呤核苷酸衍生的次生代谢产物,通常占茶叶干重的2%～4%,是茶叶苦味品质的主要贡献成分。茶树中的咖啡碱主要分布在幼嫩的芽叶中,并随芽叶的老化而逐渐减少。咖啡碱在茶树中的主要合成途径为:黄苷→7-甲基黄苷→7-甲基黄嘌呤→可可碱→咖啡碱,N-甲基转移酶在此过程中起着重要的作用。本文从茶树中咖啡碱的含量分布、生物合成与分解代谢途径以及相关基因的表达研究进行综述,并展望其发展前景。     

茶树体内黄嘌吟核苷到咖啡碱的转化

将用~(14)C标记的甲硫氨酸、黄嘌呤核苷和7—甲基黄嘌呤核苷喂饲离体茶树新梢。在摄取后的培养初期,甲硫氨酸的甲基基团就被结合进7—甲基黄嘌呤核苷(约10%)。在24小时内就约有50%的黄嘌呤核苷的放射性经 7—甲基黄嘌呤核苷,7—甲基黄嘌呤、3、7—二甲基黄嘌呤(可可碱)迅速结合进咖啡碱。7—甲基黄嘌呤核苷也以高速率转化成咖啡碱。本研究结果提出咖啡碱的生物合成途径如下:黄嘌呤核苷→7—甲基黄嘌呤核苷→7—甲基黄嘌呤→3、7—二甲基黄嘌呤(可可碱)→咖啡碱。     

国外茶叶文献摘要(二十四)

0134 茶树中黄嘌呤核苷向咖啡碱的转化Osamu NEGLSHL等给离体茶芽饲喂~14C标记的甲基蛋氨酸,黄嘌呤核苷和7—甲基黄嘌呤核苷。在饲喂后的初期,便有约10％的甲基蛋氨酸的甲基参入7—甲基黄嘌呤核苷。在24小时内,便有约50％的黄嘌呤核苷的放射活性通过7—甲基黄嘌呤核苷、7—甲基黄嘌呤和可可碱而     

茶叶微生物固态发酵中咖啡碱降解途径初探

为探究微生物作用下咖啡碱的降解产物与途径,将普洱茶发酵中筛选鉴定的Aspergillus sydowii NRRL250（聚多曲霉）、Aspergillus pallidofulvus NRRL4789、Aspergillus sesamicola CBS137324和Penicillium mangini CBS253.31等优势菌株分别接种至晒青毛茶进行单菌种固态发酵,并采用高效液相色谱（HPLC）测定咖啡碱、可可碱、茶碱的含量,探究微生物对咖啡碱代谢的影响;另外,基于UHPLC-QTOF-MS代谢组学技术,以灭菌处理组（ST组）和原料组（RM组）为对照,对聚多曲霉接种发酵样进行代谢组学分析。结果表明,A. pallidofulvus NRRL4789、A. sesamicola CBS137324和Penicillium mangini CBS253.31等优势菌株对咖啡碱等嘌呤类碱代谢均无显著影响,而在聚多曲霉接种发酵中,咖啡碱含量显著下降（P<0.05）,降幅达83.89%;茶碱含量显著增加（P<0.05）,发酵末期含量为(25.03±1.17) mg·g^-1;而可可碱保持基本稳定。由此可知,聚多曲霉对咖啡碱降解代谢有显著影响。采用UHPLC-QTOF-MS方法检出茶碱、3-甲基黄嘌呤、1,7-二甲基黄嘌呤等9种与咖啡碱降解相关的代谢物。在聚多曲霉作用下,茶碱、3-甲基黄嘌呤、1,7-二甲基黄嘌呤、7-甲基黄嘌呤含量显著提高（P<0.05）。茶碱、3-甲基黄嘌呤、1,7-二甲基黄嘌呤和1-甲基黄嘌呤与咖啡碱及其相关代谢物的N-脱甲基化途径相关。1,7-二甲基尿酸、1-甲基尿酸与咖啡碱相关代谢物的氧化途径相关。由此可知,聚多曲霉为降解普洱茶咖啡碱的优势菌株,且具有将咖啡碱转化为茶碱的潜在能力;在咖啡碱降解代谢过程中,存在聚多曲霉作用下的N-脱甲基化和氧化,并以N-脱甲基化为主。     

植物甘油脂合成途径第一步酰化反应的研究进展

甘油脂是生物膜的主要组成成分,参与能量与信号转导、蛋白转运等一系列生物学过程,在植物的生长发育过程中发挥着重要作用。3-磷酸甘油酰基转移酶（Glycerol-3-phosphate acyltransferase, GPAT）催化磷脂酸从头生物合成的第一步关键反应,磷脂酸不仅是膜脂与中性三酰甘油的合成前体,同时还是一个重要的信号分子。然而,目前仍不清楚植物中GPAT酶究竟由多少基因编码的,造成这种现象的一个主要原因是缺乏可简易且有效地鉴定此酶的方法。本文分析总结甘油脂生物合成及GPAT基因克隆与鉴定的研究进展;随后介绍GPATs的鉴定方法,特别是酵母遗传互补法的建立与运用;最后对甘油脂合成途径第一步反应的未来研究进行展望。     

茶氨酸酶促生物合成研究进展

茶氨酸系茶树（Camellia sinensis）特征性成分,具有放松镇静、增强记忆、保护神经、化疗调节等诸多生理活性。目前发现能催化茶氨酸生物合成的酶有7种,它们分别是茶氨酸合成酶、谷氨酰胺合成酶、γ-谷氨酰甲胺合成酶、谷氨酸合成酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷氨酰胺酶和γ-谷氨酰转肽酶。茶氨酸生物合成反应有两种代表类型：（1）谷氨酸和乙胺为底物的连接合成反应（需ATP供能）;（2）谷氨酰胺和乙胺为底物的酰基转移反应。本文对茶氨酸酶促合成途径进行了综述,以此为茶氨酸微生物合成技术的开发应用提供参考依据。     

茶叶咖啡碱生物合成能力的季节性变化

常绿茶树的嘌呤代谢与其他多数有机体不同,因为它具有一从嘌呤核苷酸到咖啡碱的特殊代谢途径。尽管在花等器官中观察到咖啡碱,其生物合成主要在叶片中。茶叶咖啡碱含量的季节变化已有报道,茶叶的嘌呤代谢在年周期中似乎有相当大的波动。本研究检测了茶叶嘌呤代谢的季节性变化,并测定了咖啡碱生物合成中几个关键酶的活性。结果表明:咖啡碱在早期发育阶段(4～6月)的茶丛叶片中,由腺嘌呤核苷酸合成,合成速率看来主要取决于N-甲基转     

真空充氮及沸水脱咖啡碱工艺对绿茶品质的影响

研究探讨了真空充氮和沸水脱咖啡碱工艺对绿茶品质的影响。结果表明：真空充氮和沸水脱咖啡碱工艺都能够显著改变绿茶挥发性风味成分的组成,使其色、香、味以及功能成分发生了一系列变化。单纯真空充氮处理后,茶样风味接受性下降,挥发性成分相对含量总量减少了39%,检出挥发性成分种类减少27种;酸类、呋喃类和其它杂类挥发性成分组成百分比增加,醇类减少。富集γ-氨基丁酸且脱咖啡碱茶样与只经过富集处理茶样相比,有55种挥发性成分相对含量减少了,有28种挥发性成分相对含量增加了,挥发性成分相对含量总量减少了56%。酸类、呋喃类在脱咖啡碱且富集处理茶样中所占百分比要较未脱咖啡碱富集处理茶样低,风味可接受性提高,说明脱咖啡碱加工工艺能改善高γ-氨基丁酸绿茶产品功能组成和风味可接受性。     

合成茶树咖啡碱相关的N-甲基转移酶基因家族的克隆及序列分析

咖啡碱是茶叶中重要的功能成分,它以黄苷为底物,以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）为甲基供体,通过N-甲基转移酶（NMT）类催化的一系列甲基化反应合成的产物。根据NMT基因高度相似的特性,利用长片段PCR法和侧翼序列克隆技术分离了白叶一号6种NMTs的基因组DNA全长,其中有2种为已报道的茶树咖啡碱合成酶基因TCS1、TCS2,1种为假基因,另3种基因分别被命名为TCS3、TCS4、TCS5,基因结构分析发现这6种基因均由4个外显子和3个内含子组成。山茶属植物的NMTs可聚为5类,其中TCS4和TCS5为与其他基因的相似性相对较低的一类。这些结果为今后更好地从基因组水平上剖析茶树咖啡碱的遗传机制提供有用参考。     

茶树中甲基转移酶的研究进展

甲基转移酶普遍存在于茶树中,它与茶叶类黄酮物质及咖啡碱的形成、茶树冷驯化过程中DNA甲基化模式的变化和硒代半胱氨酸的形成有关。本文综述了茶树甲基转移酶的基因研究、原核表达和催化特性研究,为以后茶树体内的甲基化修饰提供理论依据。     

开发茶叶多酚类生物化学改良途径的遗传控制研究

茶叶的特征性成分是茶多酚、类黄酮衍生物和咖啡因,茶多酚的基本组成是类黄酮衍生化合物的次生代谢产物——儿茶素;儿茶素与其它类黄酮化合物的主要生物合成途径享有共性,因而具有相似的合成机制。多种植物的广泛研究表明,该生物合成途径受到决定主要产物的一系列结构和调控基因的严格控制。欲在茶树遗传改良产生最大价值,必须了解茶多酚合成途径的生物化学、分子和遗传控制。本文综述了儿茶素合成过程中类黄酮化合物合成途径和关键基因的最新研究结果,并列举了该途径的知识潜力及其应用。     

苦茶碱代谢关键转录因子基因的筛选鉴定

苦茶是我国特异的茶树资源,主要分布于西南地区,富含苦茶碱(1,3,7,9-四甲基尿酸).苦茶碱具有镇静、催眠和抗抑郁等多种生理活性,其合成关键基因(苦茶碱合成酶基因)已经得到克隆和研究,但是苦茶碱代谢调控机制的研究鲜有报道.为了挖掘与苦茶碱代谢调控相关的转录因子,本研究以高苦茶碱(GKC)、低苦茶碱(LKC)茶树品种以...     

Towards Generating Caffeine-free Tea by Metabolic Engineering

Tea is a rich source of antioxidants which are contributing substantially to the promotion of health and the prevention of various chronic diseases. Despite the fact that tea has various important compounds, it also contains a purine alkaloid, caffeine. High intake of tea leads to an increase in level of caffeine in addition to its important antioxidant constituents. Increased level of caffeine causes several health related problems. Therefore, tea can become a most useful source of beneficial compounds, if only its caffeine level is either decreased or eliminated all together from the plant itself. This could be achieved through either of the techniques; overexpressing caffeine degradative pathway genes or silencing caffeine biosynthesis pathway gene. The identification and cloning of caffeine biosynthesis in tea and degradative genes in microorganisms opens up the possibility of using genetic engineering to produce naturally decaffeinated tea. Here we review these different strategies which can be employed to make caffeine-free tea, a human health beneficial drink.     

茶树咖啡因合成酶基因RNA干涉表达载体构建

咖啡因合成酶（TCS）是茶树咖啡因生物合成途径中的一个关键酶,催化7-甲基黄嘌呤转变为可可碱和可可碱转变为咖啡因。抑制TCS基因表达是培育低咖啡因茶树的最有效途径。用RT-PCR方法扩增茶树TCS基因的两个cDNA片段,并克隆入T-载体中。干涉载体和TCS基因片段的T克隆经限制性内切酶两次双酶切与连接,将两个TCS基因片段分别反向重复插入到干涉载体pFGC5941,构建了TCS基因的RNA干涉载体,分别命名为pFGC5941-TCS02和pFGC5941-TCS03。经PCR和DNA测序获得验证。TCS基因RNA干涉载体的构建为培育低咖啡因茶树奠定了基础。     

胡椒瘟病生防菌 Bacillus subtilis VD18R19 全基因组测序及 比较基因组学分析

Bacillus subtilis VD18R19 具有促进胡椒生长和防治胡椒瘟病的效果,全基因组测序是其分子机理研究和开发 利用的重要基础。本研究采用第二代 Illumina 平台与第三代 PacBio 平台相结合的测序技术,对生防菌 VD18R19 进行 全基因组测序,并进行比较基因组学分析。结果发现,VD18R19 全基因组大小为 4 123 380 bp,GC 含量为 43.80%, 编码基因 4 245 个;含有 tRNA 85 个、rRNA 30 个、sRNA 33 个;含有串联重复序列 60 个,其中小卫星 DNA 43 个、 微卫星 DNA 1 个;共线性分析、core-pan 基因分析及基因家族分析结果均显示 VD18R19 与模式菌株 B. subtilis 168 具 有高度的同源性;antiSMASH 软件预测及同源序列比对结果显示,VD18R19 菌株中含有 6 个抑菌次生代谢产物合成基 因簇,编码 surfactin、plipastatin、bacillibactin、bacilysin、bacillaene、subtilosin A 等抑菌物质,其合成途径涵盖了核 糖体途径、非核糖体途径和聚酮合酶途径。本研究为深入研究生防菌 VD18R19 的分子机理奠定生物信息学基础,有利 于生防菌株及其抑菌次生代谢产物的开发和利用。     

Low Temperature and Cold Stress Significantly Increase Saxitoxins (STXs) and Expression of STX Biosynthesis Genes sxtA4 and sxtG in the Dinoflagellate Alexandrium catenella

Toxic dinoflagellate Alexandrium spp. produce saxitoxins (STXs), whose biosynthesis pathway is affected by temperature. However, the link between the regulation of the relevant genes and STXs’ accumulation and temperature is insufficiently understood. In the present study, we evaluated the effects of temperature on cellular STXs and the expression of two core STX biosynthesis genes (sxtA4 and sxtG) in the toxic dinoflagellate Alexandrium catenella Alex03 isolated from Korean waters. We analyzed the growth rate, toxin profiles, and gene responses in cells exposed to different temperatures, including long-term adaptation (12, 16, and 20 °C) and cold and heat stresses. Temperature significantly affected the growth of A. catenella, with optimal growth (0.49 division/day) at 16 °C and the largest cell size (30.5 µm) at 12 °C. High concentration of STXs eq were detected in cells cultured at 16 °C (86.3 fmol/cell) and exposed to cold stress at 20→12 °C (96.6 fmol/cell) compared to those at 20 °C and exposed to heat stress. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) revealed significant gene expression changes of sxtA4 in cells cultured at 16 °C (1.8-fold) and cold shock at 20→16 °C (9.9-fold). In addition, sxtG was significantly induced in cells exposed to cold shocks (20→16 °C; 19.5-fold) and heat stress (12→20 °C; 25.6-fold). Principal component analysis (PCA) revealed that low temperature (12 and 16 °C) and cold stress were positively related with STXs’ production and gene expression levels. These results suggest that temperature may affect the toxicity and regulation of STX biosynthesis genes in dinoflagellates.     

龙眼miRNA合成途径相关基因的鉴定及表达分析

为了解龙眼miRNA合成途径相关基因的生物学功能,本研究依据龙眼第3代基因组数据对龙眼miRNA合成途径相关基因进行了鉴定和生物信息学分析,并利用龙眼转录组对其在体胚发生早期定量表达进行分析。研究结果如下：共鉴定到12条龙眼miRNA合成途径相关基因,分别是DlDDL1、DlDDL2、DlDDL3、DlDCL1、DlSE、DlHYL1a、DlHYL1b、DlHYL1c、DlCBP20、DlCBP80、DlHEN1、DlHASTY。这些基因编码的氨基酸数目400~1000 aa,蛋白分子质量23.92~220.25 kDa;大部分蛋白均为酸性蛋白,所有蛋白均为不稳定蛋白,除DlHASTY外,其余蛋白均为亲水性蛋白;基因结构分析表明,各成员内含子数目差别较大,为2~23个;所有成员均含有保守结构域,数目差别较大,为1~7个;启动子顺式原件分析显示,基因启动子区域均含有大量光反应元件及激素响应元件;蛋白互作预测分析显示龙眼miRNA合成途径相关基因具有较强的互作关系。对龙眼体胚发生早期过程中表达分析显示,各基因在EC阶段具有较高的转录水平。本研究表明：龙眼miRNA合成途径相关基因可能参与龙眼体胚发育早期进程且在EC阶段发挥重要作用,同时响应多种激素应答及非生物胁迫,推测其在生物学功能方面具有多样性和差异性。     

Induction of apoptosis and non-apoptosis in human breast cancer cell line (MCF-7) by cisplatin and caffeine

Background: Molecular targeted therapy by different cell death inducers are recently considered in cancer therapy. The aim of this study was to compare the effect of cisplatin and inositol trisphosphate kinase inhibitor (caffeine) on human breast cancer cell line (MCF-7). The pattern of cell death in MCF-7 cells following the exposure to cisplatin and caffeine in individual and combination forms was characterized. Methods: MCF-7cells at late exponential phase were divided into two groups: control and experimental groups. Experimental group was exposed to cisplatin, caffeine and combination of them and control group was treated by vehicle. Forty-eight hours after incubation, floating and attached cells were collected separately. Flowcytometry analysis and electron microscopy were carried out on both attached and floating cells. Results: Two types of apoptotic and non-apoptotic cells were observed in the floating cells as well as in sub G1 cells of both experimental and control groups by electron microscopy. Both early and late stages of apoptosis were characterized and the attached cells remained unaffected. Conclusion: Although two different forms of cell death (apoptosis and non-apoptosis) were appeared in MCF-7 following exposure to cisplatin and caffeine, apoptosis was the major mechanism of cell death. The combination form of anti-cancer drugs with different mechanisms could decrease the dosage of employed anti-cancer drugs.Key Words: Cisplatin, Caffeine, Apoptosis     

TaJAZ7D蛋白在冬小麦JA抗寒途径中的作用

转录抑制因子JAZ（Jasmonate ZIM-domain）蛋白是茉莉酸（Jasmonate,JA）信号转导途径的核心元件,前人研究发现,拟南芥中AtJAZ1、AtJAZ4与AtICE1蛋白互作可抑制 AtICE1基因的转录,负调控拟南芥的抗寒性,然而小麦中TaJAZ与TaICE蛋白的互作调控机制尚不清楚。本研究以强抗寒冬小麦品种东农冬麦1号（Dn1）为试验材料,以与拟南芥AtJAZ1、AtJAZ4蛋白高度同源的TaJAZ7、TaJAZ12蛋白为对象,检测外源茉莉酸甲酯（MeJA）对低温胁迫下 TaJAZ7、 TaJAZ12基因表达量的影响。结果发现, TaJAZ7基因的表达量与温度变化呈明显负相关,故对TaJAZ7(以TaJAZ7D为研究对象进行后续研究)蛋白进行生物信息学分析和亚细胞定位,并利用酵母双杂交技术验证TaJAZ7D蛋白与TaMYC2和TaICE41蛋白的互作。生物信息学分析表明, TaJAZ7D基因编码区序列全长为633 bp,为不稳定的亲水性混合型蛋白;TaJAZ7D蛋白有典型的TIFY和Jas结构域,属于TIFY家族。亚细胞定位发现,TaJAZ7D蛋白位于细胞核中。酵母双杂交验证试验发现,TaJAZ7D蛋白与TaMYC2和TaICE41蛋白分别存在互作关系。