生防菌株Bacillus velezensis Z全基因组测序分析

生防菌株Bacillus velezensis Z对胡椒瘟病等多种植物病害具有良好的生防效果;全基因组测序能够为其分子机理研究和开发应用提供信息基础。本研究开展该菌株全基因组测序,并进行比较基因组学和抑菌次生代谢产物合成基因簇预测研究。结果表明：B. velezensis Z菌株的基因组中含有1条4 054 780 bp大小的环形染色体DNA和1个17 122 bp大小的环形质粒,总基因组的GC含量为46.24%,共编码基因4173个;包含27个rRNA,86个tRNA基因,34个sRNA;含有串联重复序列179个,其中13个微卫星DNA,138个小卫星DNA;通过比较基因组学分析,结果发现该菌株与贝莱斯芽孢杆菌模式菌株FZB42同源性极高,与枯草芽孢杆菌模式菌株168之间具有一定的遗传距离;同时发现B. velezensis Z基因组中共编码次生代谢产物合成基因簇13个,其中8个与表面活性素（surfactin）、泛革素（fengycin）、溶杆菌素（bacilysin）、macrolactin H、bacillaene、difficidin、plantazolicin、amylocyclicin等已知基因簇完全相似或高度相似,其他5个基因簇皆功能未知。总之,本研究揭示了B. velezensis Z的全基因组遗传信息,明确其与贝莱斯芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的比较基因组学关系,预测了抑菌产物合成编码基因簇,为该生防菌株及其抑菌产物的机理研究和开发应用奠定基础。     

产EPA海洋细菌Shewanella baltica 6-42全基因组测序及比较基因组分析

新近发现来源于北极的海洋细菌Shewanella baltica 6-42在低温条件下合成超长链多不饱和脂肪酸二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid C20∶5,EPA)。为了进一步探讨EPA合成调控机理,本研究通过第三代高通量测序技术对S.baltica 6-42菌株进行全基因组测序,得到高质量且无间断的总长度为5.15 Mb的全基因组序列信息。分析表明全基因组的GC含量为46.17%,预测编码基因有4 597个,共有2 577个基因具有明确的生物学功能,其中348个基因参与环境适应性调节,60个基因参与油脂代谢途径。全基因组存在64 053个甲基化修饰位点,且甲基化修饰类型主要是m6A和少量的m4C。根据同源序列比对,解析了该菌株中参与EPA合成的聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)途径5个关键基因及调控因子。同时对脂肪酸合成途径的其他关键基因和次级代谢产物合成基因簇进行了预测。根据已报道的另两株不同亚种S.baltica OS155和S.baltica OS678的基因组信息进行全基因组关联比较分析,结果显示三株细菌都保存有参与合成EPA的PKS基因簇,但其他功能基因的进化差异较大。本研究结果为S.baltica 6-42 EPA合成关键基因以及其他功能基因的挖掘和应用提供数据支持。     

灵芝免疫调节蛋白基因的克隆和分析

采用同源克隆方法,分别以6个灵芝品种和1个云芝品种的基因组DNA为模板,进行灵芝免疫调节蛋白基因的PCR扩增。扩增产物克隆进T-载体后,进行DNA测序和BLASTn序列分析。结果表明,从赤芝、紫芝、韩芝和甜芝4个菌株中克隆到的PCR扩增片段,含有灵芝免疫调节蛋白基因编码区全长,顺次编号为gimp01,gimp02,gimp03,gimp04。它们已经在国际GeneBank中登记注册,注册号:AY449802,AY449805,AY449804,AY449803。     

芒果炭疽病菌环境pH信号调控基因PalF的克隆与分析

通过本地查找胶孢炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)橡胶菌株全基因组测序数据,获得PalF基因的序列信息。利用同源克隆的方法扩增胶孢炭疽病菌芒果菌株PalF基因,获得片段大小为2 369 bp的目的基因片段。对该基因序列进行分析发现,该片段含有完整的开放式阅读框,与橡胶炭疽菌PalF基因的序列同源性达100%。用RT-PCR的方法获得PalF基因的cDNA序列,序列进行分析发现该基因全长为2 310 bp,其中含有1个大小为59 bp的内含子,推测编码769个氨基酸。对PalF基因的氨基酸序列进行推测保守结构域分析可知PalF蛋白中含有Arrestin-C保守结构域,推测该基因参与环境pH感应信号转导途径(Ambient pH-sensing signal transduetion pathway)的调控,为进一步研究该基因在环境pH感应信号转导途径中的作用奠定了基础。     

剑麻茎腐病菌基因组SSR标记开发

下载Aspergillus niger ATCC 1015菌株全基因组序列,利用GRAMENE网站提供的SSR鉴定工具SSRIT(Simple Sequence Repeat Identification Tool),并按含有2~10个碱基重复、碱基数在18 bp以上的SSR基元为标准进行SSR鉴定。结果从A.niger ATCC 1015全基因组中,共发现4 000个2~10碱基SSR,其中含9个碱基重复基元类型最多,共有1 433个,占所鉴定SSR总数的35.8%。其次为6个碱基重复基元类型,共有753个,占SSR总数的18.8%;接着为3个碱基重复类型,共有547个,占13.6%。从鉴定出来的SSR中,选择含有SSR的合适区段,从中设计了36对引物,对剑麻茎腐病菌17个菌株的基因组DNA进行了PCR检测,发现这些引物都能从剑麻茎腐病菌基因组DNA中有效扩增。由此表明,黑曲霉ATCC 1015菌株基因组SSR在剑麻茎腐病菌基因组中具有通用性。这为研究剑麻茎腐病菌群体遗传变异、多样性和进化,定位和克隆功能基因等提供了分子标记。     

福州宦溪野生蕉（Musa spp.，AB group）CHUP1基因克隆及其生物信息学分析

CHUP1(chloroplast unusual positioning 1)参与了叶绿体移动信号转导过程,对植物避免光伤害及提高光合效率方面具有重要作用,并且与植物抗寒性有密切关系.本研究以福州宦溪野生蕉(Musa spp.AB group)叶片为材料,采用同源克隆的方法,分离出CHUP1基因cDNA和DNA序列,GenBank登录号分别为JX123753、JX880084,命名为Mu-CHUP1.Mu-CHUP1 cDNA全长3232 bp,ORF 2931 bp,编码976个氨基酸.福州宦溪野生蕉Mu-CHUP1 cDNA序列与小果野蕉(M.acuminata,AA Group)全基因组测序中的CHUP1 cDNA序列的相似性为84.71％;福州宦溪野生蕉Mu-CHUP10RF的DNA序列含8个内含子、9个外显子,而小果野蕉全基因组测序中的CHUP1基因组DNA序列则有11个内含子、12个外显子,两者相差较大.生物信息学预测分析表明,Mu-CHUP1磷酸化位点多达62个,并且含有3个保守结构域,可能与其行使多样性的功能有关.     

大豆响应低磷胁迫的数字基因表达谱分析

以Os PT6转基因T5代大豆为材料,以其受体亲本东农50为对照,对低磷胁迫处理下的根系c DNA文库进行数字基因表达谱分析,共筛选得到33个差异表达基因。以受体亲本为对照,在Os PT6转基因大豆中上调表达的差异基因有21个、下调表达的差异基因有12个。GO功能显著性富集分析表明,有25个差异表达基因在蛋白、核酸等生物大分子代谢、次生代谢和酶活性调节等过程中表现为富集。KEGG代谢通路分析表明仅有1个过氧化物酶超蛋白家族基因参与到苯丙合成、苯丙氨酸代谢和次生代谢产物合成等次生代谢途径中。综合分析表明:通过光合作用相关酶类活性的调节控制光合作用速率从而影响次生代谢途径可能是大豆适应低磷胁迫的主要途径。以上结果为大豆响应低磷胁迫相关分子机制的深入研究和功能基因的筛选奠定了基础。     

强优势玉米杂交种雌穗均一化cDNA文库的构建与鉴定

以强优势玉米杂交种豫玉22发育时期的雌穗为材料构建cDNA文库,为进一步研究和分离杂种优势相关基因构建技术平台。选择玉米雌穗发育过程中的4个时期(生长锥伸长、小穗分化、小花分化和花丝始伸期)的雌穗组织分别构建了4个定向cDNA文库,依据基因组DNA饱和杂交的原理,将从4个独立的cDNA文库中提取的质粒混合,通过基因组DNA亲和体系饱和杂交,获得雌穗全发育时期均一化cDNA文库。该文库平均插入片段1.3kb,含有3×104个克隆。对文库中随机的150个克隆进行测序,81.6%的序列为非冗余序列,11.2%的序列含有两个或两个以上的拷贝,并且主要来自多基因家族转录本,说明此文库的均一化有效。对测序结果进行功能聚类分析,发现文库序列涉及水解酶、转移酶、核苷酸结合蛋白、蛋白激酶、转录因子等基因,涉及环境应答、蛋白代谢、物质转运、个体发育等多个生化途径,说明该均一化文库基因覆盖度较高。该文库还包含有大量的未知基因,有待进一步的发掘和研究。     

西藏青稞品种藏青13高氮处理的SSH文库构建及分析

为了分析青稞高氮处理相关基因的表达,以藏青13为实验材料,通过抑制差减杂交构建了青稞高氮处理下的差减c DNA文库。在随机挑取的281个阳性克隆中,测序获得219条高质量的EST,含有212条非重复且与Genbank中的基因或蛋白具有较高的同源性的序列。对其进行Blast2Go功能注释可将差异表达的基因定位到细胞组件、分子功能和代谢过程3大类内。通过KEGG代谢途径分析,212个比对结果中的117个ESTs有详细的KO功能注释,定位到17个具体的代谢途径上,且主要定位在光合作用碳固定途径和氮素代谢途径。此外,分析还发现这些基因主要是编码参与结构和功能代谢合成途径中的一些酶,且参与信号转导、转录调节和光合作用等生理过程,说明这些基因很可能参与到青稞在高氮处理下的抗性反应中。     

番茄SlAGO7基因的克隆及表达分析

根据番茄基因组数据库中AG07的EST序列信息,利用RACE和PCR技术从番茄花cDNA和叶基因组DNA中分别克隆S/A G07的cDNA全长序列和基因组序列,用生物信息学方法对其基因序列特征进行分析;利用Real-time PCR分析S/AG07在整个生长与发育过程中的时空表达模式.结果表明,SlAG07的cNDA全长片段为3 238 bp(GenBank登录号:JX467714),含有3 003 bp的完整开放阅读框,编码1 000个氨基酸,共包含3个外显子和2个内含子.所编码的氨基酸序列含有两个高度保守的PAZ和PIWI结构域,具有典型的AGO类蛋白的结构特征;与已报道的AGO7蛋白序列有较高的同源性;SlAG07基因属于AGO蛋白家族中ZIPPY/AG07亚族.SlAG07在营养组织叶中微弱表达,主要集中在根和茎表达；而在生殖器官花中强烈表达,表达丰度从花蕾到盛开的花呈递增趋势,但在果实不同发育时期中表达都非常微弱甚至不表达.由此推测,SlAG07蛋白可能与番茄花器官的发育相关.这为进一步研究该基因通过ta-siRNA干扰途径来调控番茄花器官发育形成的分子机制奠定了基础.     

豆豉纤溶酶基因的克隆及其在枯草杆菌中的表达

以实验室筛选的UD8豆豉芽孢杆菌的总DNA为模板,应用PCR技术根据豆豉纤溶酶基因DNA序列(GeneBank AY720895.2)设计并合成1对引物,扩增出了豆豉纤溶酶基因,将该基因克隆到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒EC-BS8上,构建成表达质粒EC-BS8,再将其转化到枯草芽孢杆菌Bs6中。筛选表达菌株,实现了豆豉纤溶酶基因在枯草杆菌中高效表达。获得重组菌纤溶酶活力高达9 830 IU.mL-1,是出发菌株活力的2.9倍。经纯化SDS-PAGE鉴定重组豆豉纤溶酶相对分子质量为31.0 kDa。     

辣椒DNA甲基化修饰酶基因的鉴定与表达特征分析

DNA甲基化与去甲基化是表观遗传修饰中一种保守的分子机制,参与植物生长发育、次生代谢和逆境胁迫响应等多种生物过程,受DNA甲基化修饰酶基因的调控.为了解DNA甲基化修饰酶基因在辣椒基因组中的特征,利用生物信息学手段鉴定出14个辣椒DNA甲基转移酶和去甲基化酶基因,并对其进行系统分析.结果表明:辣椒基因组中含10个DNA...     

桃蚜取食对抗、感蚜辣椒品种水杨酸、茉莉酸信号途径的影响

为了明确水杨酸及茉莉酸信号途径在辣椒抗蚜性中的重要作用,本研究在获得遗传稳定的抗、感蚜参照辣椒品种的基础上,系统开展了桃蚜为害前后抗、感蚜参照辣椒品种叶组织中水杨酸、茉莉酸含量及相关基因表达量的差异分析。结果表明,桃蚜为害后,水杨酸含量在抗蚜辣椒品种‘猪大肠’（ZDC）和感蚜辣椒品种‘大羊角椒’（DYJJ）中均比为害前显著提高,而茉莉酸含量在ZDC中显著提高,在DYJJ中则先显著降低之后又恢复到为害前水平。水杨酸信号途径相关基因PR1、EDS5、PAD4的表达量在ZDC、DYJJ被桃蚜为害后均能够显著诱导,并且桃蚜为害早期PR1和EDS5基因在ZDC中的表达量显著高于DYJJ。ZDC被桃蚜为害后,茉莉酸信号途径基因LOX2、AOC的表达量比为害前先显著提高,之后又逐渐降低至为害前水平,而这2个基因在DYJJ中的表达被显著抑制,并且也显著低于ZDC中的表达水平。研究结果表明,抗蚜辣椒品种可以同时激活水杨酸、茉莉酸信号途径抵御桃蚜为害,而感蚜辣椒品种激活水杨酸途径、显著抑制茉莉酸途径则有利于桃蚜为害。本研究从以上2个防御信号途径初步揭示了辣椒的抗蚜性分子机理。     

基于加权关联网络分析的辣椒（Capsicum annuum L.）果实颜色转变相关基因的鉴定

辣椒属于茄科（Solanaceae）辣椒属（Capsicum L.）一年生或多年生植物,其播种面积和产值在中国均居蔬菜首位。果色是辣椒众多经济性状中最直观的性状之一,直接影响人们的购买选择。辣椒果色受多种因素调控,相关色素生物合成的分子调控还需进一步解析。本研究以果实发育过程中呈现5种颜色的辣椒种质HNCA0076为实验材料,进行了生理检测、转录组测序以及WGCNA分析。在果实5个不同颜色时期,叶绿素含量变化较大,类胡萝卜素含量整体呈现递增趋势,类黄酮含量无明显变化,花色苷含量在紫色果期后逐渐降低,橙色果期后又逐渐升高。RNA测序数据质量满足进一步分析要求。4个转色期的上调（下调）表达基因数分别为826（276）、390（588）、1248（1800）和1528（2485）,随着果实的逐步发育,相邻比较组合中的差异基因的数量逐渐增加。差异表达基因经GO富集分析,主要集中在分子功能中的四吡咯结合、血红素结合、转移酶活性、氧化还原酶活性、铁离子结合和水解酶活性等过程;KEGG富集分析主要富集在类胡萝卜素生物合成、类黄酮生物合成和淀粉、蔗糖代谢等信号通路,其中类胡萝卜素代谢途径的3个基因在紫色时期向黄色时期的转变过程中表达上调,类黄酮代谢途径的11个基因在黄色时期向红色时期的转变过程中表达下调。4个对比组合差异基因分别注释到8877、8736、8689、8573个转录因子,共同注释到8049个转录因子,包括AP2、F-box、MYB和UDPGT等类型。利用非冗余的差异表达基因进行了加权关联网络分析,关联到4个与叶绿素、类胡萝卜素、花色苷、类黄酮含量相关的模块,进一步分析表明p450（LOC107859314）、Pkinase（LOC107839192、LOC107875415）、F-box（LOC107863894）和zf-MYND（LOC107852593）等29个转录因子可能参与辣椒果实转色的调控。本研究为进一步探索辣椒果实色素形成过程中的关键调控因子以及分析相关色素生物合成的调控提供了重要数据。     

CaDREB3启动子分离及其缺失体转基因烟草的获得

CaDREB3是辣椒DREB家族中1个成员,为明确CaDREB3受逆境胁迫诱导表达的分子机制,从辣椒基因组DNA中分离获得了CaDREB3上游的启动子,利用生物信息学软件进行顺式作用元件的分析,结果表明该启动子的TATA框为起始密码子ATG上游-89 bp至-86 bp的TATA,同时含有多种与逆境胁迫相关的顺式作用元件,如ABRE、HSE、MYB和TCA等,并使用Gateway技术构建了启动子6个缺失体的GUS融合载体,获得了6个缺失体的烟草转基因植株,这些结果为将来分析该启动子应答逆境胁迫的调控区域奠定了一定的基础。     

转基因甘蔗BtG-2的T-DNA侧翼序列分析及其转化事件特异性检测

转基因甘蔗BtG-2是利用农杆菌介导法把Cry1Ac-2A-gna融合抗虫基因导入‘新台糖22号’的转基因甘蔗株系,具有良好的抗虫特性和农艺性状。为了明确转基因甘蔗BtG-2的分子特征及其检测方法,推进其生物安全性评价工作,以BtG-2的T2代为研究材料,利用Southern杂交检测外源基因在转基因甘蔗基因组内的拷贝数;利用染色体步移技术分离外源基因在甘蔗基因组中插入位点的侧翼序列,并建立了该转化体高效灵敏的特异性PCR检测方法。结果表明：Southern杂交检测证明外源T-DNA以单拷贝方式插入BtG-2株系;经过3次的热不对称巢式PCR扩增,获得外源基因T-DNA左边侧翼序列984 bp和右边侧翼序列705 bp;以这2个序列和相应的T-DNA的左右端序列分别设计3对检测引物对,建立了BtG-2株系的转化事件特异性PCR检测方法,扩增效率最高的引物对LS011/LA451和RS160/RA588分别扩增到440 bp和428 bp的特异片段。其中T-DNA左侧设计的LS011/LA451检测引物对扩增的灵敏度高、特异性强,能够在甘蔗BtG-2基因组DNA相对含量为0.1%的模板中检测出转基因目的成分,相当于9个单倍体基因组拷贝数。本研究完成了转基因株系BtG-2的分子特征及其转化事件特异性检测,为该转基因甘蔗及其衍生产品的检测和身份识别提供技术依据。     

辣椒基因组中XTH基因家族的鉴定与表达特征分析

为全面了解木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶(xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase,XTH)基因在辣椒基因组中的特征,利用生物信息学方法鉴定出了所有辣椒XTH基因家族成员,并对基因的结构、染色体定位、系统进化关系和保守结构域等进行了预测,同时基于转录组数据集分析了XTH基因在辣椒不同器官、不同发育时期果实中的表达特征。结果表明,辣椒XTH家族包含23个基因成员,不均衡分布在除10号染色体外的其余11条染色体上;23个基因包含1~5个不等的内含子;系统进化分析表明,辣椒XTH蛋白可分为3个亚家族;基因表达特征分析显示,大多数辣椒XTH的表达具有组织特异性,CaXTH2、CaXTH21、CaXTH13和CaXTH23极有可能与辣椒果实的膨大与成熟相关。本研究为深入了解辣椒XTH基因的功能奠定了基础。     

稻曲病菌T-DNA插入突变体B2510的插入位点分析

以稻曲病菌T-DNA插入突变体库中致病力减弱突变菌株B2510为材料,通过分析T-DNA插入位点的侧翼序列和突变基因,分离出在稻曲病菌致病过程中起作用的基因。通过测定突变菌株B2510的生长速率、产孢能力及致病力发现,与野生型菌株P1相比,B2510田间接种表现为致病性减弱;在MM培养基上生长速率下降,而在PSA和TB3培养基中生长速率与野生型没有显著差异,但丧失产孢能力。Southern杂交显示T-DNA在突变菌株B2510中以双拷贝形式插入,利用TAIL-PCR技术扩增紧邻T-DNA两侧的侧翼序列,经过比对分析发现,T-DNA分别插在基因UV8b_1412的启动子区域和UV8b_1386的下游3′端,且稻曲菌基因组序列均未丢失,T-DNA上只有几个碱基发生变化。半定量RT-PCR分析基因的表达情况,显示两个基因在突变体B2510的表达量较P1均显著下降,推测T-DNA插入位点处的基因与稻曲病菌致病性相关,可能在某一阶段参与调控稻曲病菌在水稻上的致病过程。     

1株广谱抗真菌芽孢杆菌TR21的鉴定

利用API50CH鉴定系统、16S rDNA、gyrA和gyrB基因序列分析法,对1株分离自石斛兰叶片的广谱抗真菌芽孢杆菌TR21进行生化和分子鉴定。通过API50CH系统测试,TR21菌株与枯草芽孢杆菌相似性为90.3%,被鉴定为枯草芽孢杆菌。利用16SrDNA序列分析发现TR21菌株与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、B.subtilis subsp.subtilis、B.subtilis subsp.spizizenii和B.velezensis的相应核苷酸序列具有很高的同源性,其序列相似性皆为99%,而基于gyrA和gyrB基因序列构建的系统发育树显示,该菌株与枯草芽孢杆菌的相似性分别为96%和91%。结合16SrDNA、gyrA和gyrB基因序列分析,也确定该菌为枯草芽孢杆菌。比较API鉴定和基于不同基因的鉴定发现,分子鉴定更加快速、灵敏。