龙眼胚性愈伤组织DlRan3A和DlRan3B基因启动子的克隆及其生物信息学分析

植物Ran蛋白与核质运输、微管形成等过程密切相关。通过Tail-RCR结合接头连接介导PCR法克隆了龙眼胚性愈伤组织(Embryogenic callus,EC)Ran家族DlRan3A和DlRan3B基因的5′调控序列,长度分别为1276和714 bp。结合生物信息学法,分析启动子的转录起始位点和顺式作用元件。结果表明:龙眼EC DlRan3A和DlRan3B基因启动子分别存在1处和3处转录起始位点,且除了含有TATA box和CAAT box等基本顺式作用元件外,还含有多个光响应元件、激素应答元件、防御与逆境胁迫响应元件等。龙眼EC DlRan3A和DlRan3B启动子转录活性可能受到光、激素信号及逆境胁迫因素的诱导,在龙眼体胚发生过程中的信号转导应答过程中发挥重要作用。此外,在DlRan3A启动子区预测到1个长度为214 bp的CpG岛,为后续研究该基因启动子甲基化水平及分子调控机制提供了线索。龙眼EC Ran基因启动子的克隆与生物信息学分析有助于揭示Ran在体胚发生过程中的作用。     

木薯低温诱导基因MeLTI6A的启动子的克隆与序列分析

MeLTI6A（Manihot esculenta low temperature inducible 6A）是木薯低温干旱诱导基因,本研究从MeLTI6A 的序列出发,利用电子克隆设计引物进行PCR扩增的方法获得该基因的启动子,其序列共1 304 bp。生物信息学分析发现该启动子中具有真核生物典型的核心启动子区（TATA-box和CAAT-box）,并利用α-互补,蓝白斑筛选原理验证了该启动子核心序列具有活性;该启动子具有与干旱胁迫相关的激素类（如脱落酸、乙烯）的响应元件和逆境胁迫（如低温、干旱胁迫）的响应元件;还具有与木薯组织特异表达相关的调控元件和其它光响应元件;并通过Real time PCR检测了低温胁迫（4 ℃）下的木薯组培苗中MeLTI6A的表达变化,说明了该启动子区的低温胁迫顺式作用响应元件可能调节MeLIT6A在低温胁迫下的表达。这些说明木薯的MeLIT6A基因可能是通过对干旱胁迫激素信号响应以及逆境胁迫响应起作用,使木薯获得一定的抗胁迫的能力,同时还可能参与了木薯相关组织发育过程的调控。本研究有利于对MeLTI6A基因抗逆境胁迫功能的理解,为探索木薯高效抗逆的分子机制作初步研究。     

大豆GmWRI1a基因启动子克隆及其功能分析

为了探究大豆种子油脂合成与储存基因GmWRI1a的调节,分析其启动子功能,从大豆品种东农50基因组中扩增获得GmWRI1a基因转录起始位点上游1669bp的启动子序列,转化拟南芥。GUS染色确定了启动子的有效性,继而根据顺式作用元件的分布,分别扩增得到4个启动子5'端缺失片段1138bp,1087bp,690bp和437bp。4个启动子缺失片段分别转化拟南芥后,通过GUS组织染色结果发现,这些启动子片段能够驱动下游GUS基因表达。GUS酶活表明,启动子存在乙烯、茉莉酸、赤霉素3种激素响应元件,其中乙烯、茉莉酸和赤霉素的响应元件分别分布在-1138^-1087bp、-1087^-690bp和-690^-437bp。     

一个花生早期胚特异性表达基因AhDGAT3启动子的克隆及功能分析

为获得在早期胚中特异性表达启动子,本研究通过基因组步移技术对AhDGAT3（GenBank: AY875644.1）的启动子进行克隆。研究结果表明,获得了AhDGAT3 起始密码子ATG上游 5´侧翼序列2181 bp,应用PLACE和plantCARE在线分析显示,AhDGAT3启动子除了含有核心调控元件TATA-box和CAAT-box之外,还有多个非生物胁迫作用元件,如茉莉酸响应元件、防御和干旱胁迫响应元件TC-rich repeats、光响应元件、干旱诱导的MYB结合位点、光响应MYB结合位点等之外,还包含种子表达相关顺式作用元件及分裂组织表达相关元件。构建重组载体pBI121-PAhDGAT3,转化拟南芥,GUS染色结果显示,该启动子能驱动下游GUS基因,仅在发育早期的心型胚期至鱼雷型胚期较短时间内的胚中特异性表达。     

小麦LEAsm基因及其启动子的克隆与功能研究

胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA)是一个小的高亲水性的蛋白家族,该蛋白家族在逆境胁迫下大量积累,保护植物免受逆境胁迫。LEA蛋白可分为7组,其中重复的11-氨基酸基序是第3组LEA蛋白的特征。为深入分析第3组LEA蛋白在小麦响应逆境胁迫中的作用机制,利用芯片技术从小麦表达谱中筛选出一个渗透胁迫诱导表达的第3组LEA蛋白基因TaLEAsm,然后根据该基因序列设计引物筛选石麦15的BAC文库,获得1个含有该基因的BAC单克隆,以该BAC单克隆质粒为模板,通过BAC延伸测序克隆了TaLEAsm基因及其启动子序列,并对TaLEAsm序列特征、表达模式和启动子功能进行了初步分析。结果表明,TaLEAsm基因序列仅含有1个105bp的内含子,其开放读码框长675bp,编码224个氨基酸。TaLEAsm含有10个11-氨基酸重复序列,属于第3组LEA蛋白。低温、高盐和渗透胁迫均诱导TaLEAsm基因上调表达,但在根和叶中表达模式不同。在TaLEAsm基因起始密码子上游1 500bp序列中,预测含有14个逆境响应顺式元件。在拟南芥中,TaLEAsm基因启动子能够启动GUS基因表达,渗透胁迫诱导GUS基因明显上调表达。以上结果表明,TaLEAsm为小麦脱水响应基因,其启动子为渗透胁迫诱导启动子。     

陆地棉脱水素基因GhDHN1启动子序列分析

为了筛选棉花抗逆转基因育种的候选启动子，根据陆地棉脱水素基因GhDHN1的cDNA序列和陆地棉基因组序列，利用生物信息学分析方法，获得棉花陆地棉脱水素基因GhDHN1启动子序列。结果表明，该启动子上多个位点含有启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box，并含有非生物逆境胁迫响应元件、响应植物激素顺式作用元件、多种光调控相关的顺式作用元件以及胚乳表达顺式调控元件等。推测GhDHN1基因的启动子受光诱导，同时受低温和干旱胁迫等非生物逆境的诱导，参与棉花的生长发育。     

辣椒CaMAPK7启动子顺式作用元件及其表达分析

促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)在植物生长、发育和适应环境中起着十分重要的作用,但对该家族多数成员的表达调控机制认识仍十分有限。前期实验已分离获得辣椒一个MAPK家族成员Ca MAPK7,并发现该基因的表达受病原菌、高温等逆境的诱导,但其表达调控机制仍不清楚。本研究进一步分离了Ca MAPK7的启动子序列(p Ca MAPK7),发现其TATA框位于-165 bp与-170 bp之间,此外还发现W-box,HSE,TCA,LTR,ERE等多种与生物及非生物逆境胁迫应答相关的顺式作用元件。通过构建该启动子与报告基因GUS融合表达载体p Ca MAPK7::GUS,利用农杆菌介导的本氏烟草叶片瞬间表达系统分析发现p Ca MAPK7可应答青枯菌接种及水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(Me JA)、油菜素内酯(BR)、脱落酸(ABA)和乙烯(ET)等外源激素处理,表明Ca MAPK7应答青枯菌、外源激素处理主要是通过该启动子介导的转录调节实现的。     

茶树CsMYB基因启动子的克隆与功能分析

以茶树新品系“1005”嫩芽为材料,克隆得到CsMYB基因gDNA全长序列1β828βbp,通过染色体步移技术,分离得到CsMYB基因启动子片段1β038βbp,命名为proMYB。生物信息学分析表明,CsMYB gDNA由2个内含子和3个外显子组成,该启动子含有与提高基因转录水平相关的5′UTR Py-rich stretch顺式作用元件、启动子核心元件TATA-box和CAAT-box,还存在有激素响应元件、光响应元件、逆境应答元件以及大量功能未知或功能特异的顺式作用元件,说明proMYB具有诱导型启动子特性,CsMYB基因在茶树植物体中可能参与多种非生物胁迫应答和激素信号传导;通过烟草的瞬时表达结果表明,该启动子能驱动下游基因表达,具有启动子活性。     

白木香查尔酮合成酶基因(AsCHS1)启动子克隆及激素应答元件功能的初步鉴定

利用染色体步移法克隆了白木香查尔酮合成酶基因(As CHS1)ATG上游1 082 bp的启动子序列,该启动子序列中AT含量高达69.03%,符合真核生物启动子的序列特征。通过启动子预测软件分析可知,该序列的转录起始位点位于翻译起始位点-65 bp处,并且其上游-25~30 bp区域存在TATA-box等典型的真核生物启动子核心元件,同时含有一些顺式作用元件如赤霉素应答元件GARE-motif、茉莉酸甲酯应答元件CGTCA-motif、水杨酸应答元件TCA-element等激素调控元件,光应答元件BoxⅠ、G-Box、ACE,厌氧诱导元件ARE等。通过构建p C-1 082pro As CHS1植物表达载体,借助农杆菌将重组载体转化到烟草叶片中。蛋白定量结果表明,该序列可以驱动GUS的表达,具有启动子活性;脱落酸显著增强该启动子的活性,乙烯则显著抑制该启动子的活性。     

芥菜型油菜BjuA03.TTG2基因启动子克隆及表达载体构建

为进一步分析芥菜型油菜BjuA03.TTG2启动子在调控该基因表达中的作用，本研究以含有该基因的BAC单克隆质粒DNA为模板，通过普通PCR获得BjuA03.TTG2上游1 839 bp的DNA序列。利用PlantCARE在线分析软件分析BjuA03.TTG2启动子序列，含有许多与应答相关的顺式作用元件，如激素、光、低温等。根据BjuA03.TTG2启动子顺式作用元件的位置设计引物，采用5’端系列缺失分析法，利用PCR方法对BjuA03.TTG2基因上游启动子序列进行特异扩增，分别克隆了1 839、1 497、1 165、863、627、377和297 bp的启动子片段并构建到pCAMBIA1304植物表达载体中。鉴定结果说明7个BjuA03.TTG2启动子不同区段与GUS融合的植物表达载体构建成功。研究结果为进一步分析BjuA03.TTG2启动子的功能作用提供前期基础。     

辣椒CaDREB3基因的克隆和表达特性分析

从构建的辣椒c DNA文库中筛选阳性克隆,测序并获得辣椒CaDREB3基因,研究该基因的亚细胞定位、瞬时表达及组织表达特性,揭示CaDREB3的功能及其在植物抗逆过程中的分子机制。应用预测软件对其进行功能及生物信息学分析,利用q RT-PCR分析CaDREB3基因的瞬时表达及在不同组织中的表达特性,并以基因枪轰击洋葱表皮的方法,对CaDREB3基因进行亚细胞定位分析。结果表明,辣椒CaDREB3长度为1 997 bp,含有1071bp的完整的开放阅读框,编码357个氨基酸,含有ERF亚族的AP_2/ERF保守结构域,与西红柿(NP_001234707.1)、马铃薯(AET99101.1)及拟南芥(NP_177931.1)具有较高的氨基酸相似性,其中与西红柿的相似性最高,达83%。亚细胞定位表明该基因位于细胞核,瞬时表达表明CaDREB3可以和GCC-box结合,q RTPCR检测表明,CaDREB3基因的相对表达量在辣椒茎、叶和果实中表达量较高。实验明确了辣椒CaDREB3基因亚细胞定位信息和组织表达情况,为进一步研究其功能及分子机制提供依据。     

龙眼Mn-SOD基因的表达及其启动子功能分析

以龙眼胚性愈伤组织为材料,研究龙眼Mn-SOD基因在应答非生物因子和外源激素处理下的转录情况,并利用烟草瞬时转化法分析其启动子的表达活性。结果表明:龙眼胚性愈伤组织中Mn-SOD基因的表达受到红光和蓝光的抑制;而在白光处理下,Mn-SOD呈现先上升再下降的趋势,在绿光中,则是先下调再上升。在盐胁迫处理下,Mn-SOD基因的表达受到抑制,在蔗糖和不同天数处理中则不受影响。在一定浓度范围内,外源激素IAA、GA3、Me JA、SA和ETH均能诱导或抑制龙眼胚性愈伤组织中Mn-SOD基因的表达,提示其参与外源激素的应答。构建4个不同启动子缺失片段驱动报告基因GUS的植物表达载体并转化烟草。结果表明,龙眼Mn-SOD基因4个不同启动子缺失片段启动GUS基因的能力均低于Ca MV35S启动子,但均可启动GUS基因的表达。瞬时表达和定量表达结果显示,3’缺失的MSD-pro4(-669~-267 bp)启动GUS基因的能力最强,其次为5’缺失的MSD-pro1(-669~-1 bp),最弱的为MSD-pro2(-432~-1bp)和MSD-pro3(-267~-1 bp),提示Mn-SOD启动子-669~-432 bp区段内含有重要的正向顺式调控元件;而-432~-1 bp区段含有负调控元件。     

巴西橡胶树HbSERK1启动子的克隆及功能鉴定

利用Genome Walker方法从巴西橡胶树中克隆了Hb SERK1起始密码子上游1 395 bp的5′调控序列,序列分析表明,该序列A/T含量高达66.2%,符合真核生物启动子序列的特征。Hb SERK1启动子序列中含有多个典型的真核生物启动子基本元件,如:TATA-box,CAAT-box等,同时存在其它应答元件,如:CAT-box、02-site、ERE、ARE、TCA-element、GCN4-motif、ACA-motif等。将Hb SERK1启动子进行5′缺失,并构建了5个植物缺失表达载体。利用真空渗透法和农杆菌介导法将植物缺失表达载体转化烟草,对烟草转化植株进行GUS活性定量分析结果表明,除了SP5外,其它缺失表达载体均可以驱动GUS蛋白的表达,说明在Hb SERK1启动子-1 395~-252 bp区域可以驱动GUS的表达,表明Hb SERK1启动子是具有生物活性的启动子。     

拟南芥AtLURP1基因启动子在转基因烟草和水稻中的功能分析

克隆拟南芥LURP1基因上游1515 bp的启动子调控序列并命名为AtLURP1p,将其与GUS报告基因融合,构建成植物表达载体,分别遗传转化烟草和水稻,获得LURP1p::GUS的烟草和水稻转基因植株及其相应的T2代株系,分别研究LURP1p对水稻稻瘟病、辣椒青枯病侵染及SA、MeJA、ABA等几种重要的植物激素信号分子处理的应答.结果表明:(1)转基因烟草和水稻在几种激素,包括SA、MeJA、ABA的诱导处理下,GUS基因均可以被诱导表达;(2)转基因烟草在细菌性病菌青枯病的侵染下,GUS可被诱导表达并表现出持续表达的趋势,转基因水稻在稻瘟病的侵染下,其GUS基因也被诱导表达,并表现出后期持续上调的趋势.这些研究结果表明,拟南芥LURP1的应答逆境信号通路也存在于烟草和水稻等植物,该启动子可用作诱导型启动子广泛地应用于不同植物抗病基因工程.     

灰树花gpd-GF启动子的克隆与表达载体的构建

根据已经报道有强启动子活性的香菇gpd启动子设计引物，从灰树花基因组PCR扩增获得大小分别为1018,615bp的2个片段gpd-GF1和gpd-GF2，通过DNA序列测定得知二者的大小分别为1018,615bp，经NCB1中的BLASTN比较，gpd-GF1，gpd-GF2与已报道的香菇中克隆的gLeGPD基因上游序列的同源性分别为96%，98%，通过启动子预测软件分析，结果表明，gpd-GF1和gpd-GF2含有多个顺式作用元件如TATA box,GAtA box,CAAT box等，初步证实 gpd-GF1,gpd-GF2可能有较强的启动子活性。将gpd-GF1,gpd-GF2分别与切除CaMV35S启动子的pCAMB1A1301大片段进行亚克隆，构建成表达载体pCBgpdGF1和pCBgodGF2。     

棉花GbGAI2启动子克隆及表达分析

通过染色体步移方法获得棉花GbGAI2基因的上游2378bp启动子序列,并对其进行生物信息学分析。将启动子序列与GUS基因连接,转化拟南芥,并对转化植株进行组织化学分析。结果表明,启动子区域内含有丰富的与光信号途径、激素信号途径(GA/IAA)、逆境胁迫相关等的顺式作用元件。在外施GA条件下,启动子活性增强。通过对启动子表达模式的分析表明,棉花GbGAI2基因在GA信号途径中起很大作用。     

茉莉花香气相关基因JsTPS启动子的克隆与活性分析

以茉莉(Jasminum sambac)的花苞为材料,采用染色体步移技术,分离出JsTPS基因的5'端调控序列,对该启动子序列进行顺式作用元件预测.根据茉莉花TPS基因启动子的顺式作用元件分布,扩增出5个不同片段长度的启动子,分别命名为JsTPS-1(494 bp)、JsTPS-2(689 bp)、JsTPS-3(10...     

光敏核不育水稻OsRacD启动子的分离及其育性相关性分析

以水稻OsRacD的cDNA序列为探针筛选光敏核不育水稻农垦58S基因组文库,获得了一个包含2 kb的OsRacD启动区和396 bp编码区序列的阳性克隆。与反向PCR克隆的水稻农垦58N该基因的启动区比较,证实该基因的启动区在农垦58S和农垦58N的同源性达到99.8%,且在预测的调控元件上不存在碱基差异。说明农垦58S和农垦58N在长日照条件下表现出的育性差别,并非两者在OsRacD调控序列结构上的差别所致,而与基因表达的发育调控有关。     

Isolation and Analysis of the Promoter of OsRacD from Photoperiod Sensitive Genic Male Sterile Rice

The photoperiod sensitive genic male sterile (PSGMS) rice Nongken 58S, was discovered as a spontaneous mutant in Hubei Province by Mr. Shi Ming-song in 1973 [1]. It showed the characteristics of photoperiod fertility conversion (PFC), i.e. being sterile under long-day treatment but fertile under short-day treatment, and became the typical material for studying the molecular mechanism of genic male sterile induced by photoperiod, and also for studying the photoperiod-regulating expression …