基于转录组数据对陆地棉GhHMP1的克隆及表达分析

本研究就转录组数据分析得到一个与镉胁迫相关的基因GhHMP1(Heavy metal transport/detoxification superfamily protein1),并从陆地棉耐镉品种‘邯242’中克隆成功。为研究该基因的功能和特点,对其进行生物信息学分析、转录组分析和实时荧光定量表达分析。结果表明:陆地棉‘邯242’基因GhHMP1的CDS全长为402 bp,编码133个氨基酸,分子量约为14.88 kD,等电点为8.20;转录组和实时荧光定量分析表明,GhHMP1基因的表达具有组织特异性,且受镉胁迫诱导,可以作为重要的候选基因来培育棉花耐镉新材料,从而为棉花耐镉育种及修复重金属污染土壤提供重要的理论依据。     

陆地棉脱水素基因GhDHN1启动子序列分析

为了筛选棉花抗逆转基因育种的候选启动子，根据陆地棉脱水素基因GhDHN1的cDNA序列和陆地棉基因组序列，利用生物信息学分析方法，获得棉花陆地棉脱水素基因GhDHN1启动子序列。结果表明，该启动子上多个位点含有启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box，并含有非生物逆境胁迫响应元件、响应植物激素顺式作用元件、多种光调控相关的顺式作用元件以及胚乳表达顺式调控元件等。推测GhDHN1基因的启动子受光诱导，同时受低温和干旱胁迫等非生物逆境的诱导，参与棉花的生长发育。     

陆地棉脱水素蛋白GhDHN1的结构特征和无序性分析

利用生物信息学对陆地棉脱水素蛋白GhDHN1的氨基酸组成理化性质、保守结构域K片段以及无序性进行分析。结果表明，GhDHN1蛋白无明显跨膜结构，不是分泌蛋白，其2个序列相近的K片段均具有高度亲水性，属于部分无序性蛋白。推测GhDHN1的这些结构特性与其调控棉花响应低温胁迫有关。     

棉花DNA甲基转移酶GhDMT9抗逆性分析

为探究GhDMT9基因的功能,深入了解DNA甲基转移酶在植物表观遗传方面的作用及其作用机制,利用PCR技术从陆地棉TM-1中克隆GhDMT9基因,构建p YL156:GhDMT9 VIGS沉默载体并侵染棉花;构建PBI121:GhDMT9过表达载体转染拟南芥。生物信息学分析结果为:GhDMT9蛋白质相对分子质量为57 691.44 k Da,等电点为5.45,总平均亲水性是-0.359,不存在跨膜结构域。GhDMT9是一种具有亲水能力的酸性稳定蛋白,不是分泌型蛋白,不能在细胞中发生迁移。二级结构预测显示含有α螺旋(29.61%)、无规则卷曲(45.29%)、延伸链(19.22%)、β-转角(5.88%)。干旱和盐胁迫处理VIGS沉默GhDMT9基因的棉花幼苗出现明显的表型差异。实时荧光定量PCR的表达模式分析结果表明:干旱和盐胁迫处理p YL156:GhDMT9侵染过的棉花与对照相比,GhDMT9的转录水平明显降低。干旱和盐处理转GhDMT9基因的拟南芥T3代幼苗叶片失水、发黄、长势较弱。棉花幼苗沉默GhDMT9基因后与对照相比耐盐性降低,过表达GhDMT9基因的拟南芥与野生型的拟南芥相比耐盐性降低。上述结果表明GhDMT9基因在棉花响应胁迫过程中发挥重要作用,为进一步研究棉花的抗逆机制,挖掘功能基因奠定基础。     

陆地棉GhDHN1基因结构及内含子生物信息学分析

利用生物信息学方法分析陆地棉脱水素基因GhDHN1的DNA序列结构特性,预测其功能。序列分析表明,GhDHN1基因的基因组DNA中AT碱基含量为52.16%,而内含子具有较高的AT碱基含量（63.33%）;GhDHN1基因不含CpG岛;其内含子序列含有核心启动子元件TATA框、启动子的增强子元件CAAT框,并含有参与光响应的保守DNA模块的部分元件（Box 4）、赤霉素响应元件GARE-motif、生长素响应元件TGA元件等,说明该内含子可能参与了该基因的转录活动,可能受光、激素的诱导;GhDHN1内含子具有GT-AG 规则的保守序列,推测GhDHN1基因具有保守的内含子剪接机制。     

棉花耐低温研究进展

低温胁迫是影响棉花生长发育和品质的主要环境胁迫因子之一，是决定棉花生存、生长成熟和地域分布的最重要环境因素。从低温胁迫对棉花的影响和危害出发，分析了不同抗冷鉴定方法，综述了国内外关于抗冷相关基因、抗冷蛋白以及低温胁迫条件下转录组分析的研究进展，以期为棉花的抗冷育种和抗冷机理提供理论参考。     

陆地棉焦磷酸酶基因GhVP的启动子序列分析

为了筛选棉花耐盐转基因育种所需的诱导型候选启动子，本研究根据陆地棉焦磷酸酶基因GhVP的cDNA序列和陆地棉基因组序列，获得陆地棉焦磷酸酶基因GhVP启动子序列，并对其进行生物信息学分析。结果表明，该启动子具有多个基本元件TATA-box和CAAT-box，并含有多种逆境胁迫诱导相关的响应元件，含有丰富的光响应元件以及其他多种顺式作用元件。推测GhVP基因的转录同时受光、高温、干旱、创伤、脱落酸诱导，受生物钟控制的顺式元件调控，参与棉花的生长发育。     

陆地棉GhLEA3基因的克隆及其响应低温胁迫表达分析

【目的】本研究旨在探索棉花GhLEA3基因的结构特征及其在低温胁迫下的表达模式,研究其抗逆功能。【方法】利用同源序列克隆法在陆地棉中克隆GhLEA3;采用生物信息学方法分析其蛋白质性质,构建系统进化树。采用In-Fusion连接技术构建融合蛋白表达载体35S∷GhLEA3-GFP并进行亚细胞定位;在棉花三叶期进行叶片低温表达分析;采用农杆菌介导的花序浸染法将GhLEA3基因转入拟南芥;对T_3转基因拟南芥种子进行4℃低温萌发试验;低温处理后测转基因拟南芥叶片的电导率。【结果】GhLEA3基因编码序列全长1 218bp,编码405个氨基酸;GhLEA3蛋白含有4个功能结构域PF02987。陆地棉GhLEA3与拟南芥AtLEA3氨基酸序列之间相似性为52.6%。GhLEA3蛋白可能定位在液泡和小泡中。GhLEA3基因在低温处理的棉花叶片中上调表达。T_3转基因拟南芥低温萌发率显著高于野生型,低温处理后转基因拟南芥叶片电导率显著低于野生型。【结论】陆地棉GhLEA3属于典型的LEA3家族成员,与拟南芥AtLEA3亲缘关系最近;该基因响应低温胁迫,可能在抗冷中起重要作用。     

棉花脱水素GhDHN1的克隆及其表达

【目的】通过对棉花脱水素基因结构特征及其在低温胁迫下表达模式进行分析,探讨脱水素在棉花响应低温过程中的功能,为棉花抗冷育种提供理论基础。【方法】以棉花抗冷品种豫2067为试验材料,根据棉花陆地棉基因组序列查找已知脱水素（dehydrin,Dhn）基因的CDS序列,利用Primer5软件设计引物,克隆该基因,并命名为GhDHN1;采用生物信息学方法分析其蛋白质性质、氨基酸含量特征、功能结构域、系统进化树;选择XbaⅠ和SmaⅠ酶切位点对植物表达载体pBI121::GFP进行双酶切,采用In-Fusion连接技术构建融合蛋白瞬时表达载体pBI121-GhDHN1::GFP;分析其在洋葱表皮细胞中的瞬时表达,进行亚细胞定位;利用抗冷材料豫2067在三叶期对低温处理（4℃,24 h）前后的叶片和根系进行转录组测序,筛选差异表达基因;在三叶期时分别对豫2067（抗冷品种）和衡棉3号（冷敏感品种）进行低温（4℃,24 h）处理,利用实时荧光定量方法分别比较根、茎、叶中GhDHN1表达量,对该基因在2个抗冷差异材料叶中的表达量进行比较;对豫2067进行不同时间低温（4℃）处理,分析GhDHN1在叶片和根中的动态表达模式。【结果】该基因全长为726 bp,开放阅读编码框为636 bp,编码211个氨基酸,预测分子量为23.79 kD,等电点为5.04,富含谷氨酸（26.10%）和赖氨酸（19.40%）,不含色氨酸,半衰期为30 h,蛋白呈酸性,带负带荷,带负电荷的残基总数为60%;GhDHN1的二级结构α螺旋（Alpha helix）包含116个氨基酸残基,占54.98%,组成该蛋白的主体结构,无规则卷曲（Random coil）的氨基酸残基有87个;GhDHN1位于陆地棉D亚组第9染色体（Dt_chr9）上,在cDNA的259-348位置上含有一个长度为90 bp的内含子,2个外显子长度分别为258和378 bp;SMART和CDD分析表明该氨基酸序列含有2个保守的富含赖氨酸的K片段和1个保守的富含丝氨酸S片段,具有亲水素蛋白结构域pfam00257,表明该蛋白为K2S型脱水素;系统进化树分析表明,陆地棉亲水素GhDHN1与可可亲缘关系最近;洋葱表皮细胞中瞬时表达分析表明,GhDHN1蛋白主要定位在细胞膜附近。转录组分析表明,该基因在棉花三叶期叶片和根中,受低温处理后上调表达;荧光定量PCR分析表明,GhDHN1在4℃低温胁迫24 h后,在叶片、茎、根中均上调表达,在叶中上调表达倍数最大,在低温处理4 h和24 h时叶片中有2个表达高峰,在低温处理6 h和12 h时在根中有2个表达高峰,在抗冷材料叶片中的表达是冷敏感材料的2.47倍,说明该基因可能参与了棉花对低温的适应性调控。【结论】陆地棉GhDHN1属于典型的K2S型脱水素,与可可亲缘关系最近。该基因响应低温胁迫,在抗冷材料和冷敏感材料中表达差异显著,其表达量与棉花的抗冷性呈正相关,可以作为筛选不同抗冷材料的标记,同时可以作为重要的候选基因来培育棉花抗冷新材料。     

酵母耐盐相关基因HAL1在棉花中的功能表达

【目的】克隆酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）耐盐基因HAL1（halotolerance）并转化棉花,探究该基因在棉花中的功能,进一步探究酵母耐盐相关基因在高等植物中的具体功能。【方法】根据NCBI核酸数据库中酵母耐盐基因HAL1的mRNA全长序列信息,利用RT-PCR技术从酿酒酵母As2.375中克隆该基因。选择酶切位点XbaⅠ和SmaⅠ对表达载体pBI121::GFP进行双酶切,采用In-Fusion技术构建pBI121-ScHAL1::GFP融合表达载体。以自发荧光较弱的陆地棉品种Y-2067、ZA-23、GZ-2的花粉为材料,用基因枪轰击棉花花粉进行瞬时表达研究。采用基因枪活体转化技术将外源基因表达载体pBI121-HAL1::GFP转化棉花盐敏感材料中s9612,获得T0棉花转基因种子。用100 mmol·L^-1 NaCl盐溶液对转基因T0种子进行耐盐性发芽试验,并进行分子检测,对鉴定出的转基因植株进行叶盘耐盐性分析。【结果】从酿酒酵母As2.375中克隆耐盐基因ScHAL1,基因全长885 bp,共编码294个氨基酸。对其序列进行分析,发现HAL1蛋白中丝氨酸所占比例最大,整个蛋白呈碱性且带正电,属于亲水性蛋白。根据蛋白二级结构预测结果,推测该蛋白的结构功能域可能主要由无规则卷曲和β-折叠片构成。棉花花粉瞬时表达结果表明,转化HAL1后,3种陆地棉花粉的绿色荧光现象都明显增强,说明该基因可以在这3种陆地棉的花粉中表达。用100 mmol·L^-1 NaCl盐溶液对转基因棉花T0种子和受体材料中s9612自交种进行胁迫,发现转基因种子萌发能力明显强于受体材料,表明HAL1可以提高种子耐盐性。根据基因核苷酸序列设计2对引物对T0转基因棉花幼苗进行分子检测,将纯化后的PCR产物进行直接测序,测序结果证明转基因成功。对鉴定出的转基因植株进行叶盘耐盐性分析发现,在600 mmol·L^-1 NaCl和400 mmol·L^-1 NaCl盐胁迫下转基因植株叶盘叶绿素含量均高于对照植株,且在600 mmol·L^-1 NaCl溶液胁迫后,转HAL1植株叶绿素含量反而高于400 mmol·L^-1 NaCl溶液处理后的叶盘。【结论】成功从酿酒酵母中克隆基因HAL1,酵母HAL1对提高棉花耐盐性具有重要作用。