海南龙血树金属硫蛋白基因DcMT2的克隆和表达分析

金属硫蛋白是植物金属离子代谢及胁迫应答的关键蛋白,而且通过清除多余的活性氧调控着植物抗性的形成过程。MT2蛋白是重要的植物金属硫蛋白之一。本研究利用海南龙血树转录组数据,在注释拼接的基础上首次克隆了海南龙血树金属硫蛋白MT2基因(命名为DcMT2,Gene Bank登录号为MF594215),DcMT2基因序列全长为237 bp,编码79个氨基酸。序列分析发现DcMT2具有典型的植物金属硫蛋白MT2的结构特征,包含2个富含半胱氨酸的保守基序。DcMT2蛋白与百合目植物芦笋、水仙和马蔺具有较高的相似度,且在系统进化上划为同一分支。生物信息学分析显示该编码蛋白包含6个磷酸化位点,为非分泌型蛋白,主要在细胞外发挥作用,相对分子量为7.81 kD,理论等电点为4.86;二级结构主要由α螺旋(20.25%)和无规则卷曲(56.96%)构成。实时荧光定量PCR结果表明,DcMT2在海南龙血树的各组织中均有表达,在果实中的表达量最高,而根、茎、叶中的表达量较低。此结果为研究金属硫蛋白DcMT2在海南龙血树发育和血竭形成过程中的作用奠定了基础。     

甘薯多酚氧化酶cDNA的克隆及序列分析

植物多酚氧化酶（olyphenol oxidase,PPO)是一类核编码的铜金属酶，含有2个保守的铜结合区域（CuA和CuB)，N端和C端部分缺乏明显的同源性。根据植物PPO的结构特点，从2个保守的铜结合区域的氨基酸序列设计一对简并引物，扩增了甘薯（Ipomoea batatas L.) PPO保守区之间的cDNA片段，测序表明该片段含595bp，编码195个氨基酸，推导的氨基酸序列包含了植物PPO的2个保守的铜结合区域，与葡萄（Vitis vinifera)，番茄（Lycopersicon esculentum)马铃薯（Solanum tuberosum)和蚕豆（Vicia faba)PPO保守区的同源性分别为71．3％，80．8％，79．8％，70．6％。在此基础上设计引物通过3'RACE和5'RACE的方法获得了甘薯PPO cDNA的3'和5'端的片段。最后根据保守区的cDNA片段，3'RACD片段和5'RACE片段的序列信息进行拼接，推导出甘薯PPO cDNA的全部序列信息。结果表明：甘薯PPO cDNA全长含1984bp，有完整的阅读框，编码588个氨基酸。另外5'非翻译区16bp,3'非翻译区202bp，其中包括1个多聚腺苷酸化信号AATAAA，以及1个含17个腺苷酸的ploy(A)尾。由甘薯PPO cDNA推导的氨基酸邓列由葡萄，番茄，马铃薯和蚕豆PPO cDNA推导的氨基酸序列进行比较，它们之间存在较明显的同源性，同源性分别为49％，48％，47％和49％。     

甘露糖阳性选择系统的建立及在番茄转化中的应用

利用PCR克隆了大肠杆菌(Escherichia coli)6-磷酸甘露糖异构酶基因（pmi)并进行了序列测定。将该基因替换植物表达载体pAMBIA2301中的卡那霉素抗性基因，构建了以pmi为选择标记基因的植物表达载体pPMI，并导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中。研究了甘露糖对番茄(Lycopersicum esculentum)生长和生根的影响及叶盘对甘露糖的敏感性。通过根癌农杆菌介导对番茄进行遗传转化，获得转化番茄再生植株，并对转化植株进行了PCR扩增检测。研究表明以甘露糖阳性选择系统在番茄遗传转化中应用是可行的。     

苎麻属植物RAPD反应体系影响因子的研究

以苎麻属植物中的4个种为材料，用SDS和CTAB2种方法提取基因组DNA并比较其RAPD分析的效果；对RAPD反应体系中的一些重要参数进行了优化，建立了适合苎麻属植物RAPD分析的反应体系。即在25μL的反应总体积中Mg^2 浓度为1.5mmol/L，dNTPs浓度为0.20mmol/L，40ng模板DNA，Taq酶1.0单位；反应程序为95℃预变性5min；前5个循环为94℃变性1min，36℃结合1min，72℃延伸2min；后40个循环为94℃30s，℃36℃1min，72℃2min（最后1个循环为10min）；共45个循环。该反应体系具有良好的稳定性和重复性。     

巴西橡胶树HbDRM的克隆与表达分析

运用PCR和RACE技术从巴西橡胶树中克隆出了一个域重排甲基转移酶(Domains rearranged methyltransferase,DRM)基因(HbDRM)。HbDRM全长为2 245 bp,含有1 917 bp的阅读框,145 bp的5′-UTR和176 bp 3′-UTR,编码638个氨基酸,分子量为71.39 ku,等电点为4.90。HbDRM的氨基酸序列与可可、葡萄、黄瓜、鹰嘴豆、番茄、拟南芥DRM家族成员的同源性分别为77%、74%、72%、67%、64%和52%。定量RT-PCR分析表明HbDRM在巴西橡胶树的根、树皮、叶、花、胶乳、胚和愈伤组织中均有表达,其中在花和愈伤组织中表达量较高,在胶乳中表达量最低,此外HbDRM在橡胶树自根幼态无性系的胶乳中表达比其供体胶乳中的表达低。HbDRM的克隆和表达分析为下一步研究HbDRM在巴西橡胶树自根幼态无性系高产中的作用打下基础。     

海南龙血树查尔酮合酶基因(DcCHS)的克隆及表达分析

利用RT-PCR和RACE技术对海南龙血树查尔酮合酶基因进行克隆,得到1条1 456 bp的cDNA序列,命名为DcCHS。DcCHS含有1 173 bp的阅读框架、99 bp的5′非编码区和184 bp的3′非编码区,编码390个氨基酸。DcCHS与其他植物的CHS氨基酸序列同源性高达84%以上,具有高度保守的CHS_like结构域、活性位点以及信号序列。推测DcCHS的分子量为42.7 ku,等电点pI为6.14,稳定性极差,具有15个磷酸化位点,无跨膜结构,无信号肽,亚细胞定位在细胞质的可能性较大,并预测了蛋白质的二级、三级结构。组织特异性分析结果表明,DcCHS在花中的表达远远高于根、茎、叶和果实。     

香蕉ACC合成酶含3＇末端的cDNA克隆

采用3'RACE方法对香蕉(Musa AAA Cavendish Subgroup)ACC合成酶含3'末端的cDNA进行扩增,扩增产物被克隆到pCR*2.1载体上,转化大肠杆菌DH5α,筛选到重组质粒(pACS2),并对插入片段进行序列测定。结果表明,3'RACE产物长1 680 bp,其中一个开放读框内的核苷酸序列编码444个氨基酸,氨基酸序列包括了ACC合成酶中所应具有的7个高度保守区。同时该产物还有长269 bp的3'末端,并具有完整的Poly(A)尾(24mer)。