砂梨2个内切-β-1,4-葡聚糖酶基因cDNA的克隆及其在果实贮藏过程中的表达分析

为从分子水平上揭示EG基因在早熟砂梨软化过程中的作用机制,该研究以早熟砂梨品种翠冠果肉cDNA为模板,根据NCBI上登录的其他植物内切-β-1,4-葡聚糖酶(Endo-1,4-β-glucanas,EGases)基因编码区设计引物,利用RT-PCR技术,克隆内切-β-1,4-葡聚糖酶基因家族中的2个成员PpEG1和PpEG2的编码区序列,并在此基础上,利用半定量RT-PCR技术,探讨两基因在夏季货架期1-MCP处理条件下翠冠果肉软化过程中的表达情况。结果表明:PpEG1编码区包含1 869个核苷酸,编码1个由622位氨基酸组成的多肽,PpEG2编码区包含1 863个核苷酸,编码1个由620位氨基酸组成的多肽;PpEG1和PpEG2都含有糖基水解酶家族-9(Glycosyl-hydrolases-family-9)活性位点,但PpEG2比PpEG1的C端多1个碳水化合物结合组件(Carbohydrate-binding module,CBM);PpEG1与PpEG2分别位于分子进化树的2个不同发育分枝上;在室温货架期间,翠冠果肉中PpEG1的表达量先上升,贮藏4 d时其表达量最高,后缓慢下降,而PpEG2的表达量开始缓慢上升,在贮藏12 d时出现mRNA的积累高峰;1-MCP对PpEG1和PpEG2的表达不起延缓或促进作用。PpEG1与PpEG2在翠冠果实软化过程中的不同表达规律显示,PpEG1与PpEG2作用于不同的β-1,4-葡聚糖多聚分子底物,且PpEG1和PpEG2的表达均不受乙烯调控。     

菊花花瓣XTH基因cDNA序列的克隆与分析(英文)

[目的]为研究非乙烯敏感型菊科植物的木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶(xyloglucan endo-transglycosylase/hydrolase,XTH)基因的结构特征。[方法]采用Trizol方法从菊花花瓣中提取总RNA,利用RT-PCR技术和T/A载体克隆XTH基因的cDNA序列。[结果]测序结果表明,克隆的cDNA片段大小为911bp,编码293个氨基酸残基,具有XTH蛋白家族的7个活性位点,命名该基因序列为CmXTH(基因登录号为HM752243);其推导的氨基酸序列与其它19种植物的XTH具有较高的同源性,其中与非洲菊、蕃茄的亲缘关系最近,而与猕猴桃、草莓、胡杨等的亲缘关系较远。[结论]克隆片段确为XTH基因的cDNA序列,可能与菊花花瓣的生长与衰老过程有关。     

菊花花瓣XTH基因cDNA序列的克隆与分析

[目的]研究非乙烯敏感型菊科植物的木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶(xyloglucan endo-transglycosylase/hydrolase,XTH)基因的结构特征。[方法]采用Trizol方法从菊花花瓣中提取总RNA,利用RT-PCR技术和T/A载体克隆XTH基因的cDNA序列,并对目的序列进行琼脂糖凝胶电泳和测序分析。[结果]克隆的cDNA片段大小为911 bp,编码293个氨基酸残基,具有XTH蛋白家族的7个活性位点,命名该基因序列为CmXTH(基因登录号为HM752243);其推导的氨基酸序列与其他19种植物的XTH具有较高的同源性,其中与非洲菊、蕃茄的亲缘关系最近,而与猕猴桃、草莓、胡杨等的亲缘关系较远。[结论]该研究结果显示克隆片段确为XTH基因的cDNA序列,其可能与菊花花瓣的生长与衰老过程有关。该结果为进一步研究XTH基因的结构与生物学功能以及菊花花瓣的生长发育机制奠定了基础。     

青花菜β-1,3葡聚糖酶基因的克隆、表达分析及其植物表达载体的构建

根据其他植物的β-1,3-葡聚糖酶基因保守域序列设计简并引物,扩增出青花菜β-1,3-葡聚糖酶基因的中心区段,结合5′RACE和3′RACE技术获得该基因的5′端序列和3′端序列,经序列拼接获得1个1 277 bp 的cDNA,在GenBank 中登录号为EF484879,定名为BObg.序列分析结果表明,该cDNA 包含1个1 056 bp的开放阅读框,编码352个氨基酸,其理论上的等电点PI=7.314,相对分子质量为3.892×104,聚类分析显示该序列与已报道的其他植物的β-1,3-葡聚糖酶基因具有较高氨基酸序列同源性.利用未接种和接种霜霉病后不同时期的青花菜植株细胞进行半定量RT-PCR分析,结果表明,该基因在霜霉病接种后48 h优势转录表达,未接种和接种后其他时期都呈低水平转录表达.利用pBI121质粒构建含35S启动子的正义表达载体,酶切图谱和PCR分析结果证明该表达载体构建成功.     

棉花木葡聚糖转移/水解酶基因克隆和分析

为研究XTH基因与棉花(Gossypium spp.)纤维伸长的关系,克隆了两个XTH基因,分别命名为Gh XTH1(Gen Bank:AY189971)和Gh XTH2(Gen Bank:JN968478)。Gh XTH1编码区全长870 bp,编码289个氨基酸,Gh XTH1全长885 bp,编码294个氨基酸。序列分析表明,Gh XTH1和Gh XTH2均存在XTH家族保守序列DEIDFEFLG。生物信息学分析表明,Gh XTH1和Gh XTH2均含有信号肽。跨膜结构预测表明,Gh XTH1和Gh XTH2均在N端存在跨膜螺旋。系统发生学分析表明,Gh XTH1与拟南芥XTH6、XTH7亲缘关系较近,Gh XTH2与拟南芥XTH9亲缘关系较近。半定量分析表明,Gh XTH1和Gh XTH2均随着棉花纤维发育表达量降低,Gh XTH2比Gh XTH1表达量高。     

合浦珠母贝C型凝集素2的序列特征和表达分析

构建了合浦珠母贝(Pinctada fucata)的cDNA文库,并通过EST序列筛选和重新测序获得了一个新的C型凝集素基因的cDNA序列,命名为PoLEC2,其长度为1 659 bp,5’端非编码区为39 bp,3’端非编码区为45 bp,开放阅读框为1 575 bp,可编码524个氨基酸;PoLEC2蛋白的分子量约58.0 kD,等电点为5.2;PoLEC2蛋白包含一个信号肽序列(M1-A16)、一个MAM-2结构域和一个C型凝集素的糖识别结构域。同源性分析结果表明,PoLEC2与其他物种C型凝集素的糖识别结构域序列的同源性在26.5%～33.6%,相似性在45.1%～55.6%。组织表达分析表明,PoLEC2基因在肝胰脏、鳃、外套膜、性腺及肠组织中均有表达,经溶藻弧菌刺激后8h在肠组织中的表达量显著上调。     

团花树木葡聚糖转葡糖苷酶cDNA克隆及序列分析

以团花树形成层组织中大量表达的RNA为材料,通过反转录、保守区域PCR、3′RACE和染色体步移等技术获得了团花树AcXET的全长cDNA序列,共1396bp。核苷酸序列分析表明:该序列含有1个960bp的开放阅读框,编码1个由320个氨基酸组成的蛋白质。该基因编码蛋白与已报道的其他植物的XET蛋白有较高的同源性,且含有XET的活性催化位点EIDFE。     

小偃麦异附加系TaXTH基因的克隆与生物信息学分析

本研究运用Gene Fishing技术,从经过PEG-6000模拟干旱处理的小偃麦异附加系种质SN6306的c DNA中获得了一个长度为586 bp的上调表达差异片段7154。通过NCBI数据库相似性比对,预测其为木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因(XTH)的一段序列。经克隆和RT-PCR获得Ta XTH的全长c DNA和DNA序列,对其核酸和蛋白序列分析的结果表明,Ta XTH全长DNA序列为2 224 bp,含有3个外显子和2个内含子;其开放阅读框(ORF)长度为936 bp,编码311个氨基酸。Blast P分析结果显示,Ta XTH属于GH16蛋白家族。相似性比对分析结果表明,该蛋白与小麦近缘物种二穗短柄草中的同源蛋白一致性达到79%。从多序列联配及系统进化树分析结果中推断Ta XTH属于XTH类,具有典型的DEIDFEFLG保守基序。     

内蒙古白绒山羊LDH-A基因cDNA的克隆与特性分析

 【目的】克隆内蒙古白绒山羊乳酸脱氢酶A（LDH-A）基因并分析其基本表达模式。【方法】采用RT-PCR和3′ RACE技术克隆基因,将得到的基因cDNA序列及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。利用RT-PCR方法进行组织表达检测。【结果】获得了内蒙古白绒山羊LDH-A基因全长cDNA序列。该基因cDNA全长1 649 bp,包含一个996 bp的ORF和642 bp 的3′ UTR。SMART分析表明ORF编码的蛋白质具有Ldh_1_N domain和Ldh_1_C domain,Psite分析表明有L-乳酸脱氢酶活性位点,PSORT程序分析将其定位于细胞质中。LDH-A基因在脾、肾、睾丸和肌肉组织中均有表达。【结论】内蒙古白绒山羊LDH-A基因编码的蛋白具有典型的乳酸脱氢酶结构,cDNA核苷酸序列与牛的LDH-A基因（NM_174099.2）具有较高的同源性。在脾、肾、睾丸和肌肉组织中均有表达。     

大白菜PHK4基因cDNA3′端序列的克隆及分析

采用3′RACEcDNA末端扩增技术,克隆出大白菜PHK4基因3′端cDNA序列。该序列长810bp,其中编码区序列546bp．编码181个氨基酸,其编码序列、氨基酸序列与拟南芥爿HK4基因的同源性分别为90％和96％．说明PHK4基因与AHK4基因编码区的同源性较高,而PHK4基因3′UTR区与AHK4基因3′UTR区的同源性为52％,远低于编码区。     

1-MCP和延迟冷藏对‘早红考密斯’梨货架期间品质 和软化相关基因表达的影响

【目的】针对‘早红考密斯’梨因果肉软化和果实腐烂导致损耗严重等问题,通过分析1-MCP和延迟冷藏处理对‘早红考密斯’梨果实腐烂和货架期软化的影响,解析‘早红考密斯’梨中果实软化相关基因表达模式,旨在为延长‘早红考密斯’梨货架期提供新的理论依据。【方法】‘早红考密斯’梨经1.0 μL?L ^-1 1-甲基环丙烯（1-MCP）处理后,分别在（20±2）℃下放置0、3和6 d后再进行（0±0.5）℃冷藏。冷藏95 d后转入货架期（（20±2）℃）分析果实品质变化,利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析多聚半乳糖醛酸酶基因（PG1、PG2）、α-阿拉伯呋喃糖苷酶基因（ARF1、ARF2）和β-半乳糖苷酶基因（GAL4）的表达模式。 【结果】延迟冷藏易导致‘早红考密斯’梨果实软化和腐烂,并且随着处理时间延长,果实腐烂率加剧;与空气密封处理后直接冷藏（CK）相比,1-MCP结合延迟冷藏处理能有效维持货架期果实硬度,抑制果实呼吸速率和乙烯生成速率,减少果实腐烂,保持果实品质,但随着延迟冷藏处理时间延长,果实货架期呼吸速率和乙烯生成速率增加,果实软化进程加快;1-MCP结合延迟冷藏处理可显著抑制果实软化相关基因PG1、PG2、ARF1、ARF2和GAL4等的表达,但随着延迟冷藏处理时间延长,这种抑制效果减弱。【结论】延迟冷藏易导致‘早红考密斯’梨腐烂,因此采后需尽快冷藏;1-MCP抑制软化和腐烂效果明显,结合延迟冷藏处理,在一定程度上有利于‘早红考密斯’梨冷藏后货架期果实软化;PG1、PG2、ARF1和GAL4参与了‘早红考密斯’梨冷藏后货架期果实的软化过程。     

京白梨果实后熟软化过程中细胞壁代谢及其调控

 【目的】探讨细胞壁代谢与‘京白梨’果实软化的关系及其调控,为解决果实品质下降及迅速软化问题提供依据。【方法】用0℃、1-甲基环丙烯（1-MCP）和乙烯利处理‘京白梨’果实,测定细胞壁组分及其降解酶活性变化及调控效应。【结果】随着‘京白梨’果实后熟软化,果实细胞壁物质（CWM）、共价结合果胶（CSP）、半纤维素和纤维素含量减少,离子结合果胶（ISP）和水溶性果胶（WSP）含量增加;果胶甲酯酶（PME）和多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性在采后3 d 后开始升高,分别在第9天和第12天出现活性高峰,α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-Af）和β-半乳糖苷酶（β-Gal）活性在采收时就开始升高,并持续到贮藏末期,但纤维素酶活性呈降低趋势。相关分析表明,果实硬度与半纤维素、ISP和CSP呈极显著相关,与WSP和纤维素呈显著相关;而β-Gal和α-L-Af不仅与硬度呈极显著相关,且与细胞壁组分的相关度均大于其它细胞壁降解酶,但纤维素酶未表现出相关性。0℃和1-MCP处理显著抑制了‘京白梨’果实纤维素、半纤维素与CSP含量的下降和ISP与WSP含量的增加,降低了α-L-Af、β-Gal、PME和PG活性,推迟果实软化;乙烯利的作用不大。【结论】采后‘京白梨’果实软化与细胞壁组分变化密切相关,细胞壁降解酶中,β-Gal和α-L-Af可能是果实早期软化的主要因子,PME和PG促进了果实后期软化,但纤维素酶作用不大。0℃和1-MCP能显著抑制‘京白梨’果实细胞壁代谢,延缓果实软化;乙烯利未显著促进果实软化进程。     

梨果实发育软化与果胶多糖降解特性的关系

【目的】探讨细胞壁果胶多糖降解特性与梨果实质地软化和贮藏性的关系,进一步阐明果实软化机理,为果实品质的提高及贮藏技术的完善提供理论依据。【方法】以‘鸭梨’和‘京白梨’为试材,根据果实发育和后熟特性,分别在果实发育和后熟软化两个阶段进行定期采样,用质构仪分析比较两品种果实的质构参数变化特性,分别采用生化方法和琼脂糖凝胶色谱柱层析法分析‘鸭梨’和‘京白梨’果实发育软化过程中细胞壁果胶组分含量变化及其分子质量的分布特点,并测定果胶多糖降解相关酶活性的动态变化规律,以探讨贮藏性不同的梨果实果胶多糖降解特性的差异。【结果】发育期,‘鸭梨’果实共价结合果胶（CSP）和离子结合果胶（ISP）含量迅速增加,显著高于‘京白梨’,其水溶性果胶（WSP）含量缓慢增加且低于‘京白梨’,‘鸭梨’果实WSP和CSP均由低分子量组分向高分子量组分转变。贮藏期,‘鸭梨’果实CSP含量高且恒定,WSP含量缓慢增加,但均保持较高的分子质量;而‘京白梨’果实CSP含量迅速降低,WSP和ISP含量快速增加,各果胶显著地由高分子量组分向低分子量组分转变。‘鸭梨’果实WSP、CSP和ISP含量变化仅在发育期与硬度变化显著相关,而‘京白梨’果实果胶与硬度的显著相关性主要表现在贮藏阶段。果胶降解酶活性测定结果表明,两品种的差异主要表现在贮藏期,即在贮藏阶段‘京白梨’果实多聚半乳糖醛酸酶（PG）、果胶甲酯酶（PME）、β-半乳糖苷酶（β-Gal）和α-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-Af）的活性和增加速率均显著高于‘鸭梨’,其中β-Gal和α-Af活性在‘京白梨’果实采收后即迅速增加,PG和PME相对滞后,且β-Gal和α-Af活性变化与硬度和各果胶组分含量变化间的相关度均强于PME和PG,此时期‘鸭梨’果实仅α-Af活性与ISP含量变化的相关性显著。综上,‘鸭梨’和‘京白梨’果实的果胶降解特性差异显著,而且在果实软化的不同阶段表现不同,导致两品种果实具有不同的后熟软化和贮藏特性。【结论】耐贮性强的‘鸭梨’果实发育期表现明显的大分子果胶组分积累和随果实后熟软化降解缓慢的特性,不耐贮的‘京白梨’果实发育期积累的大分子量果胶组分随果实软化迅速降解成小分子量组分。其中,难溶性果胶CSP含量的高低及其分子质量的分布是衡量梨果实耐贮性的重要指标。β-Gal和α-Af更促进‘京白梨’果实软化。     

1-MCP对‘绿宝石’梨采后成熟衰老期间H2O2含量及其相关酶活性的影响

为探讨1-甲基环丙烯(1-MCP)对梨果实采后成熟衰老过程中过氧化氢(H2O2)代谢的作用,试验以‘绿宝石’梨为材料,用1.0 μL/L 1-MCP密封处理24 h,空气密封为对照,研究1-MCP对‘绿宝石’梨室温(25±2)℃贮藏过程中果实硬度、可溶性同形物含量(SSC)、呼吸速率、H2O2含量、抗氧化酶活性[超氧化...     

梨幼果FWL1膜系统酵母双杂交三框cDNA文库构建及互作蛋白的筛选

【目的】筛选与FWL1互作的蛋白,为研究FWL1基因调节果实大小机理提供依据。【方法】以杜梨、库尔勒香梨、鸭梨、早美香为材料,提取4个梨品种果实细胞分裂关键时期的果肉组织混样RNA。构建梨幼果FWL1膜系统酵母双杂交三框cDNA文库,并鉴定文库质量。构建诱饵载体并转化酵母菌,筛选与FWL1互作的蛋白,对初步筛选出的阳性酵母克隆进行测序并在NCBI中进行Blast比对,确定候选互作蛋白。【结果】文库库容约为3×10⁷ CFU,大于1×10⁷ CFU,平均插入片段大于1 000 bp,阳性率为≥98%。诱饵载体无自激活功能,利用共转化方法,筛选出272个与FWL1互作的蛋白质。【结论】梨幼果膜系统酵母双杂交三框cDNA文库符合酵母双杂文库的基本条件,适用于后期筛选相互作用的蛋白。筛选出的272个互作蛋白在果实发育过程中表达不同,其中collagen and calcium-binding EGF domain-containing protein 1和metallothionein-like protein可能与梨果实大小发育有关。     

‘京白梨’果实后熟软化与糖、淀粉代谢及其基因表达的关系

【目的】探讨糖和淀粉代谢及其基因表达与京白梨果实软化的关系,为果实贮藏保鲜技术提供依据。【方法】以‘京白梨’果实为试材,经低温和1-MCP处理,测定果实后熟软化过程中硬度、呼吸速率、可溶性糖和淀粉含量及相关酶活性,并对其关键酶基因(AM、SPS、SS和AI)进行实时荧光定量PCR分析。【结果】采后‘京白梨’果实淀粉快速降解,与硬度下降呈极显著正相关关系,低温和1-MCP处理极显著抑制了淀粉含量的下降,降低了其与硬度间的相关水平。同时,淀粉酶(AM)活性快速增加,与硬度和淀粉含量变化极显著相关,且AM的表达量也迅速积累,淀粉酶活性和AM表达量的增加均显著受到低温和1-MCP处理的抑制。常温下,可溶性糖中唯有葡萄糖含量显著下降,果糖和蔗糖含量则有所增加,低温和1-MCP处理则显著抑制了葡萄糖含量的下降以及果糖和葡萄糖含量的增加。蔗糖代谢酶中仅酸性转化酶(AI)活性与果实软化显著相关,其活性和基因表达量的增加时期主要表现在呼吸跃变后期,滞后于AM。蔗糖磷酸合成酶(SPS)和蔗糖合成酶(SS)活性与硬度变化相关性不显著,但随果实软化均表现较高活性和基因表达水平,与蔗糖和果糖间相关性显著,受到低温和1-MCP处理的显著调节。【结论】淀粉降解与‘京白梨’果实软化的关系较为密切,AM是果实软化初期的重要酶;蔗糖代谢参与了‘京白梨’果实后熟软化,AI主要作用于果实后熟软化的后期阶段,SPS和SS能通过调控可溶性糖分的组成和含量来参与果实软化的生理过程。     

早酥梨授粉结实能力初探

[目的]研究早酥梨的授粉结实能力,为其高产栽培提供依据。[方法]对3种梨树品种的花期物候期进行观测,对照园中以园内无授粉品种而园周围有授粉品种(砀山酥和黄县长把梨)的为CK1,以园内配置2个授粉品种为CK2,供试园中套袋隔离早酥梨的花序,以上均为自然授粉,最终调查各种花序、花朵的坐果数。[结果]黄县长把梨的始花期和盛花期比早酥梨早2 d;砀山酥梨的始花期和盛花期比早酥梨晚1 d,均可作为早酥梨的授粉品种。早酥梨自花授粉的花序和花朵的坐果率分别为13.3%和4.9%;CK1和CK2的花序、花朵的坐果率分别为64.5%、14.5%和81.1%、30.6%。[结论]早酥梨虽有一定的自花授粉结实能力,但不能满足生产的需要,配置授粉品种能明显提高其坐果率。     

红巴梨果实花青素生成相关基因f3h全长片段的克隆

利用 RT-PCR方法从红巴梨成熟果皮中克隆出花青素生成相关基因 f3 h的全长片段 (1 0 95 bp) .核苷酸序列测定表明 ,该基因与苹果的 f 3 h基因同源性高达 97% .