变异猪流行性腹泻病毒M和N双基因融合真核表达及其活性鉴定

[目的]体外表达变异猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M-N双基因融合蛋白并明确其生物活性,为开展PEDV新型疫苗及其诊断技术研究提供更多的候选蛋白.[方法]将变异PEDV的M基因克隆至pEASY-Blunt M2(pM2)真核表达载体构建pM2-M真核质粒,通过同源重组将N基因克隆至M2-M基因片段构建pM2-M-N双基因融合重组质粒,然后转染293T细胞表达出M-N双基因融合蛋白.通过Western blotting、ELISA及免疫BLAB/c小鼠试验鉴定表达融合蛋白的生物学活性.[结果]扩增获得的M基因、N基因片段大小分别为678和1359 bp,且与原序列的相似性均达100.0%.将M基因和N基因并连接至pM2真核表达载体成功构建获得pM2-M-N双基因融合重组质粒,M-N双基因片段大小为2004 bp,且与原序列的相似性为99.3%.以pM2-M-N双基因融合重组质粒转染239T细胞,表达出大小约75 kD且具有免疫活性的M-N双基因融合蛋白,纯化的M-N双基因融合蛋白能与PEDV阳性血清反应,与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等病毒均无交叉反应;以其免疫BLAB/c小鼠能诱导产生特异性抗体.[结论]通过pM2真核表达载体能构建获得变异PEDV毒株的pM2-M-N融合双基因重组质粒,转染293T细胞后可表达出具有良好免疫活性的M-N双基因融合蛋白,为后期开展变异PEDV基因工程疫苗及其诊断技术研究提供更多的候选蛋白.     

猪传染性胃肠炎病毒S蛋白主要抗原位点在昆虫细胞中的表达

用RT-PCR方法扩增届猪传染性胃肠炎病毒S基因主要抗原位点A、D,将其亚克隆至供体质粒pFastBacl,得到重组转移质粒pFastBael-TS1,转化到Escherichia coli DH5α中,提取阳性克隆质粒再转化到含穿梭载体bacmid的E.coliDHl0Bac中,发生转座作用,经蓝白斑筛选得到重组穿梭载体Bacmid-TS1,经PCR鉴定后再转染Sf9昆虫细胞,经空斑筛选得到纯化的重组病毒rAcV-Bac-FS1,经1FA、SDS-PAGE和Western-blot鉴定,重组杆状病毒TS1蛋白(相对分子质量约43 000) 在Sf9昆虫细胞中得到表达.     

TGEV与PEDV核衣壳蛋白双价基因原核质粒的构建与表达

运用DNA重组技术将猪传染性胃肠炎病毒核衣壳基因、猪流行性腹泻病毒核衣壳基因编码最大局部亲水性抗原决定簇基因片段进行串联,克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建预防仔猪冠状病毒性腹泻双价基因原核表达质粒.将该质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳结果显示,双价重组基因表达...     

猪轮状病毒与传染性胃肠炎病毒核酸免疫研究

将昆明鼠随机分为A,B,C,D4组,各组分别采用含有猪轮状病毒(RV)JL94株VP7基因的重组真核表达质粒pcDNA-VP7,含有猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)TH98株N基因的重组真核表达质粒pcDNA-N,pcD-NA-VP7和pcDNA-N、真核表达载体pcDNA3.1(+),肌肉注射3次,每次间隔2周。首次注射前后定期采血,检测血清抗体和外周血淋巴细胞中CD4+,CD8+T细胞数量的变化。A,C组小鼠血清在首免后第14天即可检出针对RVVP7的阳性抗体(P/N≥2.0)。B组小鼠血清在首免后第39天检出针对TGEVN蛋白的阳性抗体(P/N≥2.0)。A,B,C组小鼠在首免后外周血CD4+、CD8+T细胞数量与D组小鼠相比,在不同时间有显著差异(P<0.05),并明显高于D组小鼠。说明猪轮状病毒与传染性胃肠炎病毒核酸免疫后能诱发机体免疫反应。     

表面展示鸡传染性支气管炎病毒M41株S1蛋白的重组假型杆状病毒的构建

以鸡传染性支气管炎病毒M41毒株基因序列为模板,利用PCR方法扩增膜定位信号缺失的S1基因(dS1),将其亚克隆入杆状病毒表面展示质粒pBACsurf-1中,再次将S1及gp64的基因片段克隆到杆状病毒转移质粒pFastBacTMDual,得到重组质粒pFastBac-gp64-dS1.将该重组质粒转化到DH10Bac感受态细胞中,获得重组穿梭载体Bacmid-gp64-dS1,提取重组Bacmid质粒,以PCR验证其正确性.将阳性重组Bacmid质粒利用脂质体转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒BV-dS1.间接免疫荧光试验表明,该重组杆状病毒可以Sf9昆虫细胞膜表达鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白.     

猪传染性胃肠炎病毒SYBR-Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立猪传染性胃肠炎病毒SYBR-Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,利用RT-PCR技术扩增出猪传染性胃肠炎病毒N基因中324 bp的片段,并克隆到pGEM-T Easy栽体上,纯化的质粒作为模板进行SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量PCR检测方法.该方法...     

猪流行性腹泻病毒安徽分离株N基因的克隆与表达

[目的]克隆和表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)的N基因。[方法]采用RT-PCR方法对PEDV FD株的N基因进行扩增,将扩增产物连接pET-28B载体,阳性质粒转入大肠杆菌BL21感受态细胞,诱导表达目的蛋白。[结果]PEDV FD株N基因序列全长为1 326个核苷酸,编码441个氨基酸;重组N蛋白为可溶性表达,大小约58 ku;Western blot检测结果表明,重组N蛋白与PEDV抗体阳性血清发生特异性反应。[结论]该试验制备的PEDV重组N蛋白具有较好的免疫原性,可用于PEDV诊断方法的开发及相关研究。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白在杆状病毒系统表达及鉴定

通过PCR方法扩增猪圆环病毒2型(pcv-2)中的缺失核定位序列的ORF2基因,将其克隆到Bac-N-Blue杆状病毒表达系统的pMelBacB载体中,得到阳性重组质粒pMel-ORF2。将其与Bac-N-Blue DNA体外重组,在脂质体的介导下,转染处于对数生长期的Sf9细胞,获得重组杆状病毒并在Sf9细胞上表达重组蛋白。通过SDS-PAGE、Western-blot和间接免疫荧光法(IFA)鉴定表明,Cap蛋白在昆虫-杆状病毒系统获得了表达,为Cap蛋白作为pcv-2检测抗原进行猪圆环病毒特异性抗体的检测提供了物质基础。     

猪传染性胃肠炎病毒SYBR-Green I荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立猪传染性胃肠炎病毒SYBR-Green I荧光定量PCR检测方法,利用RT-PCR技术扩增出猪传染性胃肠炎病毒N基因中324 bp的片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,纯化的质粒作为模板进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量PCR检测方法.该方法检测灵敏度可达5×101拷贝数.μL-1,与猪伪狂犬病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒均不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性.结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床TGEVN基因的检测.     

SARS病毒核蛋白基因的克隆、序列分析及其在E．coil中的高效表达

对SARS病毒核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。根据GenBank中已发表的SARS全基因组序列，设计合成了1对特异性引物，对SARS病毒N蛋白基因进行了RT—PCR扩增。将PCR产物纯化后与pGEM—T连接得到重组质粒pGEM—N，进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1269bp，编码422个氨基酸。与Tor2、Urbani和TW1株相比，核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性均为100％。将pGEM—N双酶切．回收目的基因片段并克隆到大肠杆菌表达载体pE328a中，构建了重组质粒pET—N；将其转化表达菌BI21(DE3)用IPTG进行诱导表达。SDS—PAGE结果表明：重组菌可表达相对分子量约为53kD的蛋白。Westem—blotting证实，重组N蛋白可以与SARS免疫血清发生特异性反应。经凝胶薄层扫描分析，重组N蛋白表达量约占菌体蛋白的43％。     

猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株非编码区及结构蛋白的生物信息学分析

利用生物软件对猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株非编码区及结构蛋白所含的生物学信息进行了分析。结果显示,SC-Y株与TGEV其他参考毒株(Miller M60、Miller M6、Purdue、Purdue P115、PUR46-MAD、TS)5′UTR的二级结构差异显著,预测结构蛋白特性显示,N蛋白没有跨膜区域、糖基化位点及信号肽序列,属于非分泌性蛋白。在4种结构蛋白中,N蛋白的氨基酸变异率最低,为2.14‰。与MillerM60株、Miller M6株和TS株相比,SC-Y株S基因第1 123~1 128位核苷酸缺失6个碱基(AATGAT),在sM基因核苷酸第163~165位,SC-Y株比TFI株和FS772/70株多出3个碱基(ATT)。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因植物表达载体的构建

应用RT-PCR技术克隆了猪传染性胃肠炎病毒TGEV-JL株S基因全序列,将其连接到pMD18-T载体。经SacⅠ和BamHⅠ酶切鉴定,其产物全长4320bp。测序后与TH-98等8个TGEV毒株的S基因序列进行比对,同源性为97.6%～99.8%。将该基因插入植物表达载体pBI121的CaMV35S启动子下游,构建高效植物表达载体,转入根癌农杆菌EHA101中。结果表明:成功构建了重组植物表达载体pBI121-S,获得农杆菌工程菌。     

Cloning and expression of nucleocapsid protein gene of TGEV HB06 strain

The nucleocapsid protein gene of transmissible gastroenteritis virus, 1 149 bp in length, was amplified by RT-PCR from isolated strain HB06 and cloned into pMD18-T. Sequence comparison with other transmissible gastroenteritis virus (TGEV) strains selected from the Gene Bank revealed that the homology of N gene complete sequence shares more than 97% in nucleotide. N gene was cloned into BamHI and EcoRI multiple cloning sites of the prokaryotic expression vector pET 20 b, and named pETN. After being induced by isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG), the recombinant nucleocapsid protein was expressed. The result of SDS-PAGE and Western-blot showed that the recombinant nucleocapsid protein was 47 kDa and had strong positive reactions with TGEV-specific antibody.     

猪传染性胃肠炎病毒N蛋白基因的克隆及其原核表达载体的构建

以本实验室从河北分离到的TGEV毒株,采用RT-PCR技术扩增了TGEV N基因,长为1149bp,并进行亚克隆重组到pMD18-T质粒载体上,连接,转化,鉴定后得到阳性重组质粒．命名为pTN．将重组质粒插入的片段进行序列分析和比较,结果表明TGEV河北分离株N基因与国外的Purdue-115、FS772/70、TO14、96-1933株均具有较高的同源性,达95％以上。推导的氨基酸序列同源性为95％以上。并将目的基因与原核表达载体pGEX-4T-3重组,成功构建了原核表达载体pGEX-N。pGEX-N表达载体的构建,为其蛋白质的表达提供重要依据。     

犬瘟热病毒N蛋白基因的克隆、原核表达及其表达产物抗原性鉴定

参考GenBank中发表的CDVN蛋白基因序列,用Oligo6．0软件设计一对特异性引物,从患犬瘟热的犬全血样品中提取总RNA,经RT—PCR扩增得到1572bp的基因片段,将其插入pMD18-T克隆载体中构建了pMD18-CDVN重组质粒,将其转入到大肠杆菌DH5a中,进行鉴定、测序。将目的基因与原核表达载体pGEX-4T-2连接构建了pGEX-4T-2-CDVN重组质粒,转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,进行鉴定、测序、IPTG诱导表达。序列分析表明克隆的CDVN蛋白基因从起始密码子ATG开始到终止密码子TAA结束全长为1572个核苷酸,与GenBank中发表的CDVN蛋白基因序列相比同源率达到93．9％～99．1％。Western-blotting分析显示表达产物为84kDa的融合蛋白,可被犬瘟热抗血清所识别,具有良好的抗原性。     

H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆及原核表达

据GenBank收录的H9N2亚型禽流感病毒血凝素（HA）基因序列设计并合成引物,以H9N2亚型禽流感病毒RNA为模板,用R1PCR方法扩增了预计约1700bp的HA基因,将此扩增产物克隆进pMD18-T载体,采用限制性酶切及序列测定鉴定阳性重组克隆子结果表明HA基因长为1683bp。基于HA信号肽在表达中的负作用,研究通过基因工程手段缺失HA蛋白位于起始的信号肽的编码户列,获得了缺失HA蛋白信号肽的HA基因,将其亚克隆到pGEX-KG中,与GST融合表达。SDS-PAGE显示：融合表达的蛋白分子量乡为90kDa。     

Detection of TGEV Antibody by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Using Recombinant Nucleocapsid Proteins

An enzyme linked immunosorbent assays (ELISA) based on recombinant nucleocapsid (N) protein generated in Escherichia coli was evaluated for its sensitivity and specificity for diagnosis of transmissible gastroenteritis virus (TGEV) infection.The N gene encoding the N protein was cloned and expressed as a fusion protein with His tag protein in E. coli. The recombinant N protein migrated at 42 kDa and reacted with His6 tag specific monoclonal antibody by immunoblotting.Recombinant N protein ELISA (rnELISA) demonstrated 97.5% specificity among 80 TGEV-free individuals, and 97.3%sensitivity ranging among 110 clinical samples with TGEV. Taken together, these results indicated that nucleocapsid may be a useful antigen for the sera-diagnosis of TGEV and it was also suggested that the ELISA is a highly sensitive and specific test for detecting antibodies against TGEV.