口蹄疫病毒株China/99 P3区一级结构及与参考毒株的比较分析

用RT－PCR法，以口蹄疫病毒China/99感染的牛舌水泡皮为材料，扩增目的cDNA，与pGEM-T Easy载体连接并转化JM109菌株，再经重组质粒电泳、PCR和EcoR1酶切鉴定。序列测定和分析结果表明，猪源毒在3A基因内缺失10个密码子，与牛源毒的核苷酸和氨基酸序列差异较大。A－G和T－C的转换率较高，而且A－G转换导致氨基酸变异的几率大于T－C转换，它们是影响氨基酸稳定的因素之一。China/99P3区编码产物在第8、120、121、127、132、193、493、501和538位具有特征性氨基酸，可能与该毒株的表型如毒力等有关。3A基因突变率较高，3B、3C和3D较低，3D最为保守，这对维持3C和3D蛋白酶和3B的引物功能至关重要。     

不同厂家的猪O型口蹄疫疫苗对口蹄疫流行毒株保护性的研究

为了探索不同厂家疫苗对猪O型口蹄疫流行毒株的保护情况,选用当前政府采购的A、B灭活疫苗厂家和C合成肽疫苗厂家生产的猪O型口蹄疫疫苗,按照农业部推荐免疫程序对试验猪分别进行二次免疫后90天,用OZK/93和O/(XJ/10-11/MYA/98)进行攻毒,观察其各自保护率。结果显示,A、B两个厂家的灭活疫苗对OZK/93株的攻毒保护率分别为60%、80%,对O/(XJ/10-11/MYA/98)株的攻毒保护率分别为100%、100%;合成肽疫苗对OZK/93株的保护率为100%,对O/(XJ/10-11/MYA/98)株保护率为60%。说明试验用的3个厂家的猪O型口蹄疫疫苗对毒株的保护有差异。     

O型口蹄疫泛亚毒株单克隆抗体的制备及抗原表位差异分析

用纯化的O型口蹄疫泛亚毒株免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP 2/0骨髓瘤细胞进行融合,经3次克隆和间接EL ISA筛选,获得了ⅢA 11、ⅢC 3和ⅢF 10 3株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过间接EL ISA测定,单抗效价为:细胞培养上清1∶160~1∶640,腹水为1∶5×104~1∶4×105;经EL ISA法测定,3株单克隆抗体均与泛亚株VP 1蛋白反应,而不与A型口蹄疫病毒VP 1蛋白反应;单抗的亚类鉴定结果表明,ⅢA 11和ⅢF 10分泌的抗体为IgG 1亚类,ⅢC 3分泌的抗体为IgG 2b亚类。单克隆抗体抗原识别位点分析结果表明,ⅢA 11与另外2种单克隆抗体的识别位点不同,而ⅢC 3和ⅢF 10的识别位点相近。     

猪O型口蹄疫病毒强弱毒株VP1基因的克隆与序列分析

本研究根据口蹄疫病毒（FMDV）VP1基因的序列，设计并合成了1对用于扩增整个VP1基因的引物（5P、P6）。从细胞培养液或组织中提取总RNA，通过PT－PCR扩增，从F29株O3I3株和T509株中均获得了1条约740bp的DNA电泳带。将PCR产物双酶切后电泳回收，插入到相应双酶切的pUC18质粒中，获得了重质粒。通过PCR鉴定，证明重组质粒pUCVP1/F29,pUCVP1/0313,pUCVP1/T509均插入了VP1基因。对上述3个重线质粒进行测序后分析，F29强毒株与O313、T509弱毒株相比，其核苷酸序列同源性分别为98．75％和99．06％；因F29株核苷酸发生3个碱基缺失与1个碱基替换，故推导的氨基酸序列同源性分别仅为44．13％和41．32％，而T509和O3I3株相比，其核苷酸、氨基酸序列同源性分别为99．37％和95．31％。通过序列分析发现，本研究的3个毒株与国内大多数毒株（包括1997年台湾暴发FMDV所分离的毒株，除O／A／58株外）均属同一基因型，核苷酸序列同源性为85％－94％；而与国外毒株相比，属不同的基因型，核苷酸序列同源性仅为81％－82％，其推本研究的3个毒株与国内分离的大多数毒株的VP1基因的氨基酸序列同源性高达87％－95％，本项研究对猪O型FMDV的强弱毒株VP基历进行克隆与序列分析，将进一步丰富我国FMDV毒株VP1基因资料库，为更加科学地防制FMD提供分子水平依据。     

应用ELISA方法判定口蹄疫疫苗毒株血清学相关关系

在液相阻断ELISA(LPB-E)体系中,用JMS毒株及OZK毒株滴定JMS阳性血清,计算OZK株对JMS株的r值分别为0.71,0.5,0.5,均介于0.4至1.0之间,说明对JMS株来讲,其阳性血清能够很好地中和OZK毒株抗原,能够对OZK毒株提供有效的免疫保护;用JMS毒株及OR毒株滴定JMS阳性血清,计算OR株对JMS株的r值分别为1和0.5,0.5,均介于0.4至1.0之间,说明对JMS株来讲,其阳性血清能够很好地中和OR毒株抗原,能够对OR毒株提供有效的免疫保护;用OZK毒株及JMS毒株滴定OZK阳性血清,计算JMS株对OZK株的r值分别为0.0625,0.0625,0.125,均小于0.2,说明对于OZK株来讲,其阳性血清不能很好地中和JMS毒株抗原,不能够对JMS毒株提供有效的免疫保护;用OZK毒株及OR毒株滴定OZK阳性血清,计算OR株对OZK株的r值均为0.5,介于0.4至1.0之间,说明对OZK株来讲,其阳性血清能够很好地中和OR毒株抗原,能够对OR毒株提供有效的免疫保护。     

鸡新城疫流行毒株与标准毒株的交叉免疫保护试验

用新城疫(ND)分离强毒油佐剂灭活苗和NDV La Sota油佐剂灭活苗分别免疫母源抗体平均为2 log2的12日龄公雏。免疫后每隔1周采集血清，用微量血凝抑制试验检测HI抗体。免疫后21 d抗体水平达到峰值，抗体水平在6log2以上，维持30 d以上。免疫40 d后，用ND分离强毒株和NDVF48E9分别进行攻毒试验，2种疫苗的保护率均为100％，攻毒结果表明，ND分离强毒株和NDVF48E9株的免疫原性差异不显著。     

国内现有猪口蹄疫O型灭活疫苗对2010年流行毒株的抵抗力

在2010年上半年,猪O型口蹄疫不断发生,作为国内几个生产厂家的猪口蹄疫现用疫苗种毒的提供者,我组进行了猪源流行毒对该种毒灭活疫苗免疫猪的攻毒保护试验及观察。结果如下:1)、猪源流行毒致猪发病速度慢。猪源流行毒接种猪后,致猪发病的时间在3～5天,而疫苗株致猪发病时间是接种后2～3天;2)、该疫苗毒株能有效抵抗猪源流行毒的攻击,PD50大于6;3)、免疫保护和ELISA抗体水平没有线性相关性;4)、免疫保护与140S抗原量有相关性。     

IBDV野毒株的分子生物学鉴定

取3个分离于山东地区几个鸡场IBDV野毒株IBDV SD01、IBDV SD02、IBDV SD03,利用Trizol试剂提取IBDV RNA,设计特定的引物,通过RT-PCR和Nested-PCR,获得分离株的VP2基因高变区的特定序列,并对其进行克隆和序列分析结果表明,分离的3个野毒株在VP2高变区与超强毒株HK46有较高的同源性,关键氨基酸位点都符合超强毒株的特征,与一般的强毒株、变异株和疫苗株的亲缘关系较远。这些关键位点氨基酸的变化使vvIBDV能够逃脱低毒力抗原所产生抗体的捕捉,导致了免疫鸡的发病。     

鉴别猪流行性腹泻疫苗毒株与野毒株巢式PCR检测方法的建立及初步应用

根据Gen Bank中猪流行性腹泻病毒(PEDV)的基因序列分别设计两对引物,在完成最佳条件筛选、特异性、敏感性试验的基础上,建立一种快速区分PEDV疫苗毒株与野毒株的巢式PCR检测方法。建立的PCR快速检测方法能分别对PEDV疫苗毒株和野毒株扩增出特异性片段,片段大小分别为774 bp、150bp。该方法对传染性胃肠炎病毒(TGEV)、轮状病毒(Po RV)、猪瘟病毒(HCV)、伪狂犬病病毒(PRV)则不能扩增出特异性片段。该方法具有快速、灵敏、特异、通用等特点,可用于实验室的快速诊断、分子流行病学的调查和野毒株的分离鉴定。     

鸡新城疫流行毒株与标准毒株的交叉免疫保护试验

新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的禽类的一种以呼吸道、消化道黏膜出血为典型症状的急性传染病,是危害养禽业的重要的疫病之一。近年来,随着新城疫活苗和油乳剂灭活苗的广泛应用,禽类典型新城疫的发病率越来越少,但是在免疫鸡群发生非典型ND却越来越普遍,给养鸡业造成很大经济损失。针对免疫鸡群中非典型ND的普遍发生,学者们众说纷纭,有的认为存在超强毒,有的认为存在一种新型病原,有的认为由于并发症如大肠杆菌病的发生,使本来不能致病的疫苗株变成致病株,还有的观点是免疫失败所致。为了探索病因,西北农林科技大学禽病研究室2000年从ND免疫鸡群中分离了一株ND强毒株,     

IBDV强毒株与弱毒株对SPF鸡侵染过程的研究

用DIG标记PS19探针和异硫氰酸荧光素标记的鸡抗IBDV IgG，对人工接种IBDV强毒株Hrb和弱毒细胞适应株Ts后不同时间段的法氏囊、盲肠扁桃体、脾、肾、肝、胸腺、大腿及胸部肌肉的石蜡切片分别进行原位杂交和荧光抗体检测。同时将各时间段每种组织的石蜡切片进行HE染色以观察组织破坏情况。结果发现，用原位杂交和荧光抗体两种方法首先分别于接种Hrb后8h和16h在法氏囊中检测到IBDV的阳性信号，然后依次是盲肠扁桃体、脾、肾、肝、胸腺。侵害程度以法氏囊最重。实验结果表明：Hrb毒株在组织中复制速度快，并迅速在SPF鸡体内传播。Ts毒株侵染较轻，对器官组织无损伤。     

鸭病毒性肝炎弱毒株的研究

<正> 鸭病毒肝炎是雏鸭的一种急性传染病,其发病率和死亡率均很高,造成很大的经济损失。近年来,养鸭业发展很快,随之本病也有上升的趋势。为了控制木病,我们在开展灭活苗研究的同时,进行了弱毒疫苗的研究,以期研制出免疫原性好的弱毒株,为生产     

猪细小病毒四川毒株免疫原性研究

猪细小病毒(PPV)是引起猪繁殖障碍的主要病原之一,对养猪业可造成巨大经济损失。目前用于防制猪细小病毒感染的疫苗主要有弱毒苗和灭活苗两种。邬捷等(1985)在四川发病猪场病料中分得PPV3株,即PPVSR1,SR2,SR3株,并应用PPVSR1毒株研制了灭活苗,应用取得了较为理想的效果。?..     

传染性支气管炎病毒北京毒株与标准毒株结构蛋白的比较

利用鸡传染性支气管炎Ｇｒａｙ，Ｈｏｌｔｅ、Ｍ４１、Ｃｏｎｎ、Ｈ５２、Ｈ１２０标准毒株和北京Ｂ株的特异性多克隆血清，通过Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ技术，对Ｂ株和上述各标准株的结构蛋白进行了分析，并进行了不同血清与毒株结构蛋白间的交叉反应。结果表明，各株病毒都含有四种结构蛋白，从分子量看，Ｈ１２０、Ｈ６２、Ｍ４１的Ｍ蛋白比上述其他株的都小；Ｂ株和Ｇａｒｙ株的Ｓ２蛋白大于其它毒株的。在交叉实验中，Ｂ株和Ｇ     

新城疫病毒山东强毒株的分离鉴定

从山东流行烈性传染病的鸡群中分离出7株具有血凝活性的病毒，该7株病毒的血凝活性均能被新城疫La Sota株标准阳性血清所抑制，但病毒不能被中和，仍能致死鸡胚。经分离鉴定，分离毒均为新成疫病毒株。通过鸡胚半致死量（ELD50）、最小致死量致鸡胚的平均时间（MDT）、1日龄雏鸡脑内致死指数（ICPI）、6周龄雏鸡静脉致死指数（IVPI）、血凝解脱及血凝素稳定性等试验表明：7株分离病毒均为新城疫病毒强毒性，其毒力与标准强毒株F48E9株相似。     

基于锁核酸探针的双重荧光实时RT-PCR检测方法鉴别新城疫中强毒株与弱毒株

为鉴别新城疫病毒(NDV)强毒株和弱毒株,本研究建立了基于新型锁核酸(LNA)探针的实时荧光RT-PCR检测方法(Duplex LNA rRT-PCR)。该方法针对NDVF基因裂解位点设计了两条新型LNA探针,通过对11株NDV株进行大将军脂duplex LNA rRT-PCR检测方法检测,验证该方法的特异性;通过对副粘病毒I型(APMV-1)和NDV中强毒株(vNDV)不同浓度病毒液进行检测,确定该方法的灵敏度,并与TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法进行比较。结果显示本研究所建立的方法对11株NDV检测的特异性为100%(11/11),优于TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法(10/11);所建立的duplex LNA rRT-PCR方法检测中强毒株F48E9和弱毒株LaSota的灵敏度分别为10个EID50和0.1个EID50,比美国农业部推荐的TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法低10倍。本研究利用新型LNA探针技术,建立了鉴别NDV中强毒株与弱毒株的duplex LNA rRT-PCR检测方法,可以特异性检测NDV并有效区分中强毒株与弱毒株,适合用于鸡场和进出境动物产品中NDV的快速检测。