结核分枝杆菌三基因融合表达的亚单位疫苗研究

为筛选出安全、有效的抗结核分枝杆菌感染的亚单位疫苗,本研究选择了9个结核分枝杆菌的重要抗原(Rv0199、Rv0394c、Omp A、Rv3802c、Ag85a、TB10.4、Rv2660c、Rv0125、Mpt51),利用小鼠模型评价其免疫效果。每3个抗原一组串联融合表达,将其分别与弗氏不完全佐剂及沙门氏菌菌蜕混合,共分成7组,通过皮下注射的方式免疫小鼠,共免疫3次。每次免疫后两周检测其血清抗体分型与效价、脾脏淋巴细胞的分化及其细胞因子的分泌。结果表明,这些融合蛋白均能够刺激机体产生高滴度的抗体,具有较强的免疫原性,其中融合蛋白Rv0199-Rv0394c-Omp A在一免后2周即可以刺激机体产生较高滴度的抗体。抗体分型结果显示,除阴性对照组外,其余组小鼠血清中Ig G1的滴度均高于Ig G2a。并且机体的免疫反应倾向于体液免疫。其中,沙门氏菌菌蜕的佐剂作用与商品化的弗氏不完全佐剂免疫效果一致。本研究为研制结核分枝杆菌亚单位疫苗奠定了基础。     

泰山松花粉多糖对PRRSV GP5亚单位疫苗免疫增强作用的研究

为研究泰山松花粉对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5的免疫增强作用,本研究以原核表达的高致病性PRRSV GP5蛋白为抗原,添加不同剂量的天然提取的泰山松花粉多糖(TPPPS)作为免疫佐剂配制PRRSV亚单位疫苗。选取72只SPF昆明小鼠随机分为6组(Ⅰ-Ⅵ),12只/组。Ⅰ组免疫纯化的GP5亚单位疫苗,Ⅱ-Ⅳ组分别免疫不同浓度的TPPPS(20 mg/mL、40 mg/mL、60 mg/mL)佐剂GP5亚单位疫苗,V组免疫弗氏不完全佐剂GP5亚单位疫苗,VI组注射PBS;1周后各组均加强免疫1次,加强免疫后,每周每组随机挑选3只小鼠采集外周血,分别检测小鼠血清抗体效价、T淋巴细胞亚群比例、T淋巴细胞转化率和细胞因子的含量,评价TPPPS对PRRSV-GP5蛋白诱导的免疫应答反应的调节作用。结果显示,所有疫苗免疫组小鼠的上述免疫指标比对照组均有显著提高,而添加TPPPS和弗氏佐剂的疫苗组各项指标均显著高于单独GP5蛋白免疫组。3个浓度的TPPPS佐剂中,60 mg/mL浓度的免疫增强效果最显著。本研究表明,重组表达的PRRSV GP5蛋白能够诱导动物机体显著的免疫应答,TPPPS佐剂对PRRSV GP5蛋白呈现显著的免疫增强效果。本研究为研制PRRSV亚单位疫苗提供了参考。     

CpG ODN联合重组乳酸乳球菌鼻内免疫BALB/c小鼠的佐剂效应

本试验初次建立了CpG ODN联合重组乳酸乳球菌滴鼻免疫BALB/c小鼠模型。结果得出CpG ODN佐剂协同重组菌抗原组血清中抗PRRSV特异性抗体IgG和呼吸道黏膜抗体s-Ig A均高于单独重组菌组(P>0.05)和单独佐剂组(P<0.01),佐剂CpG ODN协同重组菌抗原组的Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ及黏膜淋巴因子IL-5的活性高于单独抗原组(P>0.05)及单独佐剂组(P<0.01)。试验结果说明CpG ODN作为佐剂与重组菌鼻腔免疫小鼠后,可以提高重组菌诱导的黏膜免疫反应和Th1细胞参与的系统免疫反应,为研究安全有效的重组菌黏膜疫苗奠定了基础。     

细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4增强传染性法氏囊病病毒VP2质粒DNA的免疫效应分析

为评价分子佐剂细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)对IBDV VP2质粒DNA的免疫增强作用,试验采用重组质粒载体表达重组蛋白mLTA-VP2-CTLA-4和mLTA-CTLA-4,家兔毒性试验确定其安全性,后选择10日龄非免疫健康鸡进行随机分组试验,设不同剂量mLTA-CTLA-4加IBD活疫苗免疫组、不同剂量mLTAVP2-CTLA-4免疫组、IBD活疫苗免疫组及空白对照组,免疫后用ELISA法定期检测鸡血清抗体IgG及小肠黏膜抗体IgA效价;鸡在加强免疫后用IBDV野生毒株攻击,连续观察2周并计算保护率。结果显示,mLTA-VP2-CTLA-4免疫组、mLTA-CTLA-4加活疫苗共同免疫组产生的IgG和IgA抗体水平与活疫苗免疫组无明显差别,mLTA-CTLA-4加活疫苗共同免疫组产生的IgG和IgA抗体水平略高于mLTA-VP2-CTLA-4免疫组,疫苗对鸡的保护率为100%。结果表明,构建的IBDV分子佐剂DNA疫苗载体能表达无毒性的重组蛋白质,并能产生很好的免疫保护率,为进一步研究IBD亚单位疫苗奠定基础。     

新孢子虫NcSRS2和NcSAG1重组蛋白免疫小鼠诱导的免疫应答

为了研究新孢子虫NcSRS2和NcSAG1重组蛋白对动物的免疫效果,利用重组表达的NcSRS2和NcSAG1蛋白与弗氏佐剂混匀后免疫BALB/c小鼠,检测小鼠抗新孢子虫抗体水平和血清中IL-4和IFN-γ含量。结果表明,免疫后的BALB/c小鼠IgG、IgG2a和IFN-γ抗体表达水平升高,IgG1抗体和IL-4表达水平也升高,表明NcSRS2和NcSAG1重组蛋白可激发机体产生Th1型和Th2型免疫反应,且NcSRS2重组蛋白的免疫增强效果与NcSAG1重组蛋白免疫组的差异具有显著统计学意义(P0.05)。本研究结果为研制高效安全的抗新孢子虫的新型疫苗提供了参考。     

虎源FPV主要抗原表位区基因的原核表达及免疫原性分析

为筛选出制备猫瘟热亚单位疫苗的最佳佐剂类型与首选抗原片段,本试验对虎源FPV-HLJ株VP2全长基因及其截短基因片段PAB进行原核表达,切胶法纯化的表达蛋白经Western blot分析后,分别与氢氧化铝胶佐剂及弗氏佐剂混合,免疫BALB/c小鼠,间接ELISA方法检测小鼠体液免疫水平,初步评价各疫苗的免疫效果。结果表明:VP2、PAB融合蛋白主要以包涵体形式表达,切胶法获得的高纯度表达蛋白均能与鼠抗虎源FPV阳性血清发生特异性反应。纯化蛋白各佐剂免疫组免疫小鼠后均引起较强的特异性抗体IgG反应,其中PAB蛋白各免疫佐剂组抗体水平明显高于VP2蛋白相应免疫佐剂组,且PAB蛋白+氢氧化铝胶组与PAB蛋白+弗氏佐剂组抗体水平无显著差异(P0.05),但与未加佐剂组差异显著(P0.01)。研究证实,PAB蛋白具有良好的免疫原性,可与氢氧化铝胶佐剂协同用于FPV亚单位疫苗的制备。     

寨卡病毒DNA疫苗pVAX-ZikaME构建及新型佐剂的筛选

选用1种递送载体与4种免疫刺激增强剂混合,与赛卡病毒DNA疫苗pVAX-ZikaME联合免疫BALB/c小鼠,观察新型佐剂对DNA疫苗抗原的免疫应答能力。首先构建表达ZikaME蛋白的DNA疫苗,然后将重组质粒转染至HEK293细胞,采用Western blot检测目的蛋白的表达。用配制的佐剂与重组的DNA疫苗联合免疫BALB/c小鼠,通过细胞亚群检测、淋巴细胞增殖试验和特异性抗体检测验证新型佐剂的增强免疫效果。结果显示,Western blot检测所构建的DNA疫苗表达68 000目的蛋白。用重组疫苗辅以佐剂免疫小鼠,免疫35 d时淋巴细胞增殖刺激组刺激指数、细胞亚群分化、特异性抗体水平均高于对照PBS组(P0.05)。结果表明,DNA疫苗pVAX-ZikaME辅以新型佐剂免疫小鼠可增强机体对该疫苗的免疫应答能力。     

盘尾丝虫ASP1蛋白佐剂活性区不同标签融合表达与佐剂活性比较

为了探明纯化标签对盘尾丝虫活化相关分泌蛋白1(activation-associated secreted protein 1,ASP1)佐剂活性的影响,将其佐剂活性区PR-1编码序列分别与类弹性蛋白多肽(elastin-like polypeptide,ELP)、ELK16自聚肽或His标签进行融合表达,用相变循环、离心洗涤和镍亲和层析进行融合蛋白纯化;将ELP与传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)VP2基因片段进行融合表达,用蛋白酶切除ELP标签后与不同标签融合PR-1免疫小鼠,两次免疫后不同时间采血分离血清,采用ELISA检测VP2特异IgG、IgG1和IgG2c滴度,用试剂盒检测免疫小鼠血清的IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10浓度。结果显示,ELP-PR1、ELK-PR1、His-PR1和ELP-VP2融合蛋白在重组大肠杆菌中均获得正确表达,纯化蛋白纯度大于90%;3种标签融合PR-1均能增强免疫小鼠的抗原特异IgG、IgG1和IgG2应答,并能刺激小鼠产生IFN-γ、TNF-α、IL-6或IL-10细胞因子。在3种PR-1融合蛋白中,ELP-PR1的佐剂活性最强,ELK-PR1与不完全弗氏佐剂相当。本研究探索了不同纯化标签对PR-1免疫佐剂活性的影响,为传染性法氏囊病新型亚单位疫苗佐剂研制提供思路。     

布鲁氏菌外膜囊泡生物信息学分析及免疫原性评价

【目的】探索布鲁氏菌外膜囊泡(OMVs)在亚单位疫苗上的应用前景,制备布鲁氏菌OMVs亚单位疫苗,评估布鲁氏菌OMVs的免疫原性。【方法】利用高速离心法制备羊种布鲁氏菌OMVs,通过透射电镜、SDS-PAGE和生物信息学分析对制备的OMVs进行形态和组分分析;使用纳米佐剂(LDH)和弗氏佐剂乳化OMVs后免疫小鼠,通过间接ELISA方法检测免疫后7、14、21、28和35 d小鼠血清中的特异性抗体,利用小鼠IgG ELISA检测试剂盒检测免疫后小鼠血清中IgG抗体水平,评估OMVs诱导产生的体液免疫水平;通过小鼠脾脏淋巴细胞分离与细胞因子白细胞介素4(IL-4)和γ-干扰素(IFN-γ)测定及小鼠外周血T淋巴细胞亚群的流式细胞术测定评估OMVs免疫小鼠的细胞免疫水平。【结果】成功提取并纯化了布鲁氏菌OMVs,其直径大小为20～160 nm。生物信息学分析结果显示,OMVs主要组成蛋白OMP25、OMP31、OMP16、OMP19、BP26及SOD均属于亲水性蛋白和抗原性蛋白,且存在多个B细胞和T细胞优势抗原表位。与PBS组相比,OMVs免疫小鼠后,不同佐剂组均可诱导小鼠产生高水平的特异...     

猪瘟病毒E2亚单位蛋白与集落刺激因子的融合表达及其免疫效果分析

优化了工程菌BL21-E2 A/D-GM-CSF(含有783 bp的E2 A/D-GM-CSF融合基因)的原核表达条件,结果表明诱导的最佳时间和诱导剂IPTG的最佳用量分别为4 h和0.8 mmol/L。在此基础上,大量诱导表达融合蛋白后经Ni-IDA蛋白质层析柱纯化,Western-blot鉴定纯化蛋白具有抗原活性。将融合蛋白与福氏佐剂制成亚单位疫苗后免疫试验小鼠,并与E2 A/D蛋白、猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)进行免疫效果比较,结果显示E2 A/D-GM-CSF亚单位疫苗免疫小鼠后能够产生抗猪瘟抗体,并且抗体水平明显高于E2-A/D免疫组和HCLV免疫组。研究表明GM-CSF经融合表达后对E2-A/D蛋白有显著的免疫增强作用。     

猪链球菌2型05ZYH33菌株启动子的筛选和鉴定

为了筛选和鉴定用于猪链球菌(S.suis)致病因子和致病机制研究的启动子,本研究通过质谱鉴定了来自S.suis2型05ZYH33菌株的5个高丰度蛋白质,并通过其驱动GFP蛋白和甘露糖苷酶SSU05_1921的表达水平,评估了这5个蛋白相应的基因启动子的强弱。结果显示,这5种蛋白质分别为SSU05_0177、SSU05_0530、SSU05_1503、SSU05_1815和SSU05_1868,相应的5个启动子P0177、P0530、P1503、P1815和P1868均能够有效驱动GFP在E.coli和S.suis中的高水平表达,但是P1815、P0177和P1868不能驱动SSU05_1921在S.suis中的表达。P0530和P1503能够驱动SSU05_1921在S.suis中的表达,并且P1503启动子驱动GFP和SSU05_1921的表达水平均比P0530启动子驱动的高两倍以上。因此,P0530和P1503是S.suis的强启动子,并且P1503更强于P0530。这在高水平表达GFP用于标记菌体,以及构建无启动子基因的回复突变菌株中发挥关键作用,在S.suis遗传操作中具有很好的应用前景。     

利用信息肽诱导和Cre/LoxP系统构建猪链球菌基因缺失株

为建立一种高效的猪链球菌(Streptococcus suis)基因缺失方法,本研究利用信息肽诱导DNA片段转化和Cre/LoxP系统去除抗性基因这两种技术,通过在S.suis 05ZYH33的ssu05_1921基因上、下游片段和壮观霉素抗性基因(spc)片段之间引入LoxP位点,采用信息肽GE9诱导构建的DNA片段转化S.suis并发生重组,经抗性筛选快速获得spc替代ssu05_1921基因的缺失株;进一步引入pSET6s/P_tufA-cre质粒表达Cre重组酶作用于LoxP位点,去除spc基因,产生无痕ssu05_1921基因缺失株,经测序和RT-PCR验证缺失正确。本研究建立的该方法简单、快捷、阳性率高,为构建S.suis基因缺失株、研究S.suis致病机制提供了新的选择。     

副结核分枝杆菌MAP1068胞外蛋白酶的特性研究

为研究副结核分枝杆菌(MAP)1068蛋白的特性,本研究以MAP参考株K10基因组为模板,PCR扩增其map1068基因,构建p ET28a-map1068重组载体,将其转化BL21后诱导表达并纯化MAP1068蛋白。利用纯化的重组蛋白免疫(100μg/只/0.1 m L)小鼠制备多克隆抗体,应用该抗体对MAP1068蛋白进行亚细胞定位。以酪蛋白为底物测定MAP1068蛋白的酶活性。结果显示,MAP1068蛋白以包涵体形式表达;经变性、复性、亲和层析纯化后获得目的蛋白;将该蛋白免疫小鼠后其血清抗体效价可达1∶204 800;该蛋白主要定位于MAP细胞壁,可降解酪蛋白,为胞外蛋白酶。本实验为进一步研究MAP的致病机制奠定了基础。     

猪链球菌2型05ZYH33菌株具有N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性蛋白的鉴定及功能研究

为了研究猪链球菌2型(SS2)05ZYH33菌株是否具有N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)及同工酶,本研究通过同源蛋白比对,发现05ZYH33菌株表面蛋白SSU050630 C端Ss GH20结构域与肺炎链球菌(S.pneumoniae)的NAG Str H的GH20-1结构域具有60%的同源性;经基因克隆、蛋白表达及纯化后的酶活性分析表明Ss GH20具有NAG活性,且其活力为371 U/mg蛋白;其最适反应温度为50℃、最适p H为5.5;其Km值为0.69。通过构建SS2 ssu050630基因缺失株及全菌酶活性测定,显示SS2 05ZYH33菌株具有NAG活性,而ssu050630基因缺失后的菌株则失去了NAG活性,表明SSU050630是SS2 05ZYH33菌株唯一具有NAG活性的蛋白。本研究为进一步探究Ss GH20在SS2致病中的作用及SS2逃避宿主免疫反应的机制奠定了基础。     

猪IL-21的真核表达及其与CD40L共刺激抗体分泌的活性研究

为研究猪白介素21(IL-21)的生物学功能,本研究在猪IL-21基因(456 bp)的3’端加上猪Ig G Fc标签序列后,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建重组质粒pcDNA-IL-21-Fc。将该重组质粒转染293T细胞瞬时表达后,利用protein A亲和纯化介质纯化转染上清中的目的蛋白,并检测其纯度与生物学活性。结果显示,构建的重组质粒pcDNA-IL-21-Fc能够在293T细胞中表达相对分子量约为44 ku的猪IL-21融合蛋白;亲和纯化后的猪IL-21融合蛋白能够与CD40L协同呈剂量依懒性地刺激猪外周血淋巴细胞(PBMCs)分泌Ig G。本研究为进一步探究猪IL-21在适应性免疫应答中的作用提供依据。     

人工感染鸭源新城疫病毒对绍鸭β-防御素和细胞因子基因表达的影响

试验旨在探讨人工感染鸭源新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)对绍鸭β-防御素(avianβ-defensins,AvBDs)和细胞因子基因表达的影响。选用45只20日龄SPF绍鸭,随机分为攻毒组(27只)和对照组(18只),攻毒组采用滴鼻点眼的途径(108.38 EID50)接种鸭源NDV强毒株(Md/CH/LGD/1/2005),对照组接种磷酸盐缓冲液。在攻毒后24和48h,从对照组及攻毒组各随机取6只鸭屠宰,分别采集肾脏、肺脏、气管、腺胃、骨髓、脾脏、盲肠扁桃体、哈德氏腺、法氏囊9个组织,运用实时荧光定量PCR法检测组织样品中9种AvBDs和细胞因子的表达量;剩余鸭每天持续观察,每隔4d采血1次,直至24d,检测血清抗体水平;于攻毒后24、48、72和120h采集咽喉及泄殖腔拭子,以确定排毒周期。结果表明,感染该NDV毒株后,鸭没有临床发病症状和死亡情况发生;感染后鸭排毒开始于攻毒后第1天,到第5天停止,在攻毒组咽喉及泄殖腔拭子中均检测到NDV。抗体水平检测结果显示,该NDV能够诱导鸭体内产生抗NDV特异抗体。实时荧光定量PCR结果发现,与对照组相比,感染后24h,部分鸭组织中AvBD1、AvBD2、AvBD5、AvBD6、AvBD9和AvBD16表达量均显著升高(P<0.05);感染后48h,AvBD1和AvBD6在部分鸭组织中表达量均显著上调(P<0.05);感染后48h法氏囊中白细胞介素6(IL-6)和脾脏中干扰素γ(IFN-γ)的表达量明显低于感染后24h的表达量。综上所述,该鸭源NDV毒株感染可诱导绍鸭体内在早期产生天然免疫反应,这些反应可能与病毒在机体内复制有关。     

PP1和PP2对鸡传染性喉气管炎病毒感染影响的研究

为研究化学小分子SRC抑制剂PP1和PP2对鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)感染宿主细胞的影响,本研究将ILTV接种鸡细胞系LMH作为研究模型,检测了PP1和PP2对ILTV感染各阶段的作用。结晶紫染色结果显示,ILTV感染细胞中,与DMSO处理组相比,PP1和PP2处理组的细胞死亡均明显增多,表明PP1和PP2促进了ILTV感染介导的宿主细胞死亡;高内涵细胞筛选检测分析结果显示,在病毒感染24h时,PP1和PP2处理组EGFP荧光面积显著大于对照组(p<0.05),表明PP1和PP2可以促进ILTV的扩散,并且该现象不受ILTV中和抗体的影响,提示PP1和PP2可以促进ILTV的细胞-细胞间扩散;病毒特异性qPCR检测显示,PP1和PP2处理组的病毒基因组拷贝数与DMSO对照组相比无显著差异,PP1和PP2处理组之间的病毒基因组拷贝数也无显著差异(p>0.05),PP1和PP2对病毒复制无显著影响。为了进一步确定PP1和PP2促进ILTV细胞-细胞间扩散的具体作用方式,本研究利用多种颜色及理化性质不同的染料对LMH细胞膜、细胞质以及ILTV囊膜分别进行染色检测,结果显示PP1和PP2能够促进ILTV进入细胞,但对ILTV吸附细胞和细胞间胞质直接联系无显著影响。本研究初步确定了PP1和PP2影响ILTV感染的具体作用方式,为对其进一步分子机制研究奠定了基础。     

抗猫细小病毒嵌合抗体基因在昆虫细胞中的表达与鉴定

为降低单克隆抗体(MAb)在犬体内的免疫原性,本研究克隆了具有中和猫、犬细小病毒(FPV、CPV)活性的MAb(3EB)的轻、重链可变区基因及犬天然抗体(NAb)轻、重链恒定区基因,通过融合PCR获得鼠-犬嵌合抗体基因。构建能够表达嵌合抗体的重组质粒,经昆虫杆状病毒表达系统对重组嵌合抗体进行表达。SDS-PAGE和western blot试验显示鼠-犬嵌合抗体重链为55ku、轻链为25ku。间接免疫荧光试验显示该嵌合抗体能够与抗犬IgG和FPV特异性结合。上述结果表明,嵌合抗体保留了原MAb3EB对病毒特异结合能力的基础上,将鼠源恒定区替换为犬源NAb的恒定区。病毒中和试验表明嵌合抗体保留了3EB对FPV、CPV的中和活性。本研究首次通过昆虫杆状病毒表达系统表达了抗FPV、CPV的嵌合抗体,降低了原MAb的免疫原性,对FPV、CPV病临床治疗用抗体药物的研制具有重要指导意义。     

嵌合猫杯状病毒F9株感染性克隆的构建及病毒拯救

为构建猫杯状病毒(FCV)弱毒株F9的感染性克隆,本研究利经PCR分段扩增了FCV各基因片段,并拼接出FCVF9全基因组序列。经测序显示,其1823位多出一个碱基造成该序列存在移码突变,经替换为pOK-2280(已构建出的FCV强毒株的感染性克隆)相应序列并对差异氨基酸逐个突变,最终获得嵌合FCVF9全基因组的重组质粒pOK-F9H。将线性化的pOK-F9H体外转录,获得的加帽RNA转染F81细胞,得到了拯救病毒rFCVF9。经过对拯救病毒与亲本病毒的蚀斑形成能力、CPE形成能力和多步生长曲线分析,结果显示rFCVF9与亲本株在复制能力和体外生长能力方面基本一致,表明构建了嵌合FCVF9株的感染性克隆并拯救出重组病毒。本研究构建的嵌合FCVF9株感染性克隆可以为FCV的基因功能研究以及新型FCV疫苗的研发奠定基础。     

东北地区狐源大肠杆菌耐药性的检测

通过对东北地区狐源大肠杆菌进行分离培养,并对其耐药性展开调查。采用纸片扩散的方法测定各分离菌株对22种抗菌药物的敏感性。旨在为养殖场抗菌药物的正确使用和控制其耐药性提供重要的科学依据。结果表明,狐源大肠杆菌各个菌株对各种抗菌药物的敏感性不同。对氨苄西林、头孢噻吩、卡那霉素、四环素、氯霉素、强力霉素和复方新诺明的耐药率均在60%以上;对阿米卡星、多黏菌素B敏感率在80%以上,而对亚胺培南敏感率在90%以上。